甘蓝型油菜PIN家族基因的鉴定与生物信息学分析

PIN家族基因是一类调控植物生长素极性运输的重要载体元件, PIN基因编码生长素输出蛋白, 介导生长素在植物体的运输, 然而在基因组较复杂的甘蓝型油菜中缺乏系统研究。本研究运用生物信息学方法在甘蓝型油菜全基因组数据库筛选甘蓝型油菜PIN家族基因, 对鉴定出的29个BnPINs基因开展拷贝数变异、分子特征、跨膜结构域、保守基序、染色体定位、系统进化树构建、PIN蛋白二级结构及三级结构预测等研究, 结合高通量转录组测序进行低氮胁迫下的转录水平分析。结果表明, 甘蓝型油菜PIN家族基因拷贝数明显多于拟南芥、甘蓝和白菜所具有的PIN家族基因数量; BnPINs蛋白多属于由碱性氨基酸组成的稳定蛋白, 含有保守的N末端结构域, 二级结构与拟南芥PIN蛋白相似; 系统进化选择能力分析表明, BnPINs基因与甘蓝和白菜PIN家族基因进化关系相近。转录组测序表明, BnPIN1s、BnPIN2s、BnPIN3s基因主要在甘蓝型油菜根部表达且受长期低氮(72 h)诱导, BnPIN6s和BnPIN8s基因主要在地上部表达, 低氮会抑制BnPIN6s表达。本研究结果为进一步研究甘蓝型油菜PIN家族基因生物学功能尤其是在响应低氮胁迫中的功能奠定基础, 为已知大量数据的其他物种家族基因生物信息学研究提供参考。     

甘蓝型油菜响应低氮胁迫的表达谱分析

随着人们对作物产量的需求不断提高,氮肥被过量施用,而作物的氮素利用率(NUE)却在不断降低。本研究从低氮胁迫下油菜的生理变化入手,结合高通量的数字基因表达谱测序技术,分析了油菜在低氮0、3、72h下的转录组差异响应,鉴定了氮的吸收﹑转运﹑分配和转录因子等方面的差异表达基因。结果表明,甘蓝型油菜在低氮处理后,氮优先分配到地上部,硝酸还原酶(NR)活性显著降低,而谷氨酞胺合成酶(GS)活性升高,油菜植株总氮浓度降低, NUE升高。基因基因本位论(GO)功能与京都基因和基因组百科全书(KEGG)代谢通路分析表明,地上部差异表达基因主要是参与代谢过程、蛋白结合、离子结合、阴离子结合等,根中差异表达基因主要是参与分子功能、初级代谢过程、离子结合、阴离子结合等。基因表达谱分析表明,低氮胁迫72 h后,根中BnaGLNs家族基因表达大部分升高;根中BnaWRKY33s和BnaWRKY70s的基因表达量降低;BnaMYB4s、BnaMYB44s和BnaMYB51s亚家族中的大部分基因的表达量降低;BnaNIAs家族中的大部分基因表达上调;在BnaNRT2.1s和BnaNRT3.1s亚家族中,根中Bna...     

大豆GmbHLH041基因的生物信息学分析及对镉胁迫的响应

为探讨大豆Gmb HLH041转录因子在应答镉胁迫中的作用,根据前期的镉胁迫前后大豆根系转录组测序结果,筛选获得响应Cd胁迫的Gmb HLH041基因,利用NCBI和Phytozome数据库,结合生物信息学软件对Gmb HLH041基因进行预测分析,并通过q RT-PCR的方法检测大豆根系中Gmb HLH041基因在50μmol/L Cd SO4胁迫0,24 h的表达情况。结果显示,Gmb HLH041基因编码542个氨基酸,相对分子质量为61.17 ku,理论等电点为5.89。二级结构预测结果显示,该氨基酸序列主要以无规则卷曲(39.48%)、α-螺旋(37.27%)和伸展链(16.61%)的形式存在,从拟南芥b HLH家族中的12个亚家族中挑选了24个b HLH蛋白并结合其他物种中亲缘关系较近的b HLH蛋白,对Gmb HLH041进行系统进化树分析发现,Gmb HLH041与野生大豆和狭叶羽扇豆的b HLH041蛋白亲缘关系较近,Gmb HLH041划分到拟南芥b HLH家族第4亚族Ⅳd中。根据进化树的分析结果,选取与Gmb HLH041亲缘关系最近的Gsb HLH041、Lab HLH041以及拟南芥第4亚族Ⅳd中的AT5G56960进行多重比对,结果显示,Gmb HLH041含有一个保守的b HLH结构域;荧光定量PCR结果显示,Gmb HLH041基因在50μmol/L Cd SO4胁迫24 h后表达量极显著上升,说明Gmb HLH041基因在Cd胁迫应答中可能发挥着重要的作用。     

甘蓝型油菜GPDH基因克隆及其生物信息学分析

为了进一步研究甘蓝型油菜GPDH基因,通过从拟南芥GPDH基因与甘蓝型油菜的共线性分析发现:拟南芥GPDH基因(At2g41540)在甘蓝型油菜A基因组和C基因组中有4个拷贝,分别为:GSBRNA2T00132785001、GSBRNA2T00024258001、GSBRNA2T00058395001、GSBRNA2T00019118001。从Gen Bank分别下载了它们的DNA序列和c DNA序列,c DNA序列依次命名为GPDH1、GPDH2、GPDH3、GPDH4。根据序列信息设计了4对不同的引物,从甘蓝型油菜湘油15号c DNA全长序列中扩增出了4条片段,分别命名为Bn GPDH1、Bn GPDH2、Bn GPDH3、Bn GPDH4。利用生物信息学软件和在线系统进行核苷酸序列分析和蛋白进化分析。结果显示:4条片段大小依次为1 395,1 395,1 389,1 536 bp。其中,Bn GPDH4翻译成氨基酸时序列中间出现终止密码子,不能合成有效蛋白。3个Bn GPDH蛋白的氨基酸数目为464,464和462个,理论分子量为51.584 4~51.829 7 k Da,二级结构α螺旋和无规则卷曲所占比例在42%左右,其次是延伸链所占比例约为15%。三者的跨膜结构总体来说是相同的。3个蛋白都由保守结构Gps A、NADB_Rossmann superfamily和NAD_Gly3P_dh_C superfamily组成,属于GPDH超基因家族。同源建模分析表明3个蛋白均能适用甘油3磷酸脱氢酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDH)模型。对其进行亚细胞定位预测在细胞质膜的概率为79.0%。从序列分析、核苷酸聚类、理化性质预测、二级、三级结构预测、亚细胞定位预测、氨基酸聚类分析得出结论,它们具有GPDH基因家族的特征,为甘蓝型油菜GPDH基因家族中的成员。     

甘蓝型油菜CBF基因家族的鉴定和表达分析

低温是影响植物生长发育的重要环境胁迫因子,ICE1(inducer of CBF expression1)-CBF(C-repeat(CRT)-binding factors)-COR(cold responsive)在植物响应低温胁迫的信号途径中具有重要作用。为探究CBF(C-repeat-binding factors)基因在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中的进化以及在低温胁迫应答反应中的功能,本研究以4个拟南芥CBF基因为基础序列,鉴定出11个甘蓝型油菜、6个白菜和5个甘蓝CBF基因,并对它们的分子特性、蛋白保守结构域和系统进化树、基因结构及基因染色体分布、甘蓝型油菜CBF基因组织表达模式以及不同逆境和激素处理下的表达模式进行系统的比较分析。结果表明,在11个甘蓝型油菜CBF基因中,可分为亚组Ⅰ(CBF1/2/3)和亚组Ⅱ (CBF4) 2个亚组。转录组测序结果表明,所有甘蓝型油菜CBF基因受低温诱导表达,其中亚组Ib的4个基因对冷胁迫响应迅速且持续时间长,亚组Ⅱ中2个基因对冷胁迫响应表达较弱,但它们在根中表达量明显高于叶片,并且参与盐胁迫和渗透胁迫响应;甘蓝型...     

紫花苜蓿(Medicago sativa)YABBY基因家族的生物信息学分析及其对逆境胁迫的响应

YABBY转录因子家族是植物特有转录因子,与植物形态有关,在植物响应胁迫方面也有重要的调控作用。为了研究YABBY基因家族在苜蓿抗逆性中的作用,本研究利用生物信息学对苜蓿的YABBY转录因子家族成员、分布及结构等进行分析。对苜蓿、大豆、水稻和拟南芥进行系统进化树的分析,表明该家族基因在植物中具有同源性。理化性质和结构分析表明,苜蓿中YABBY基因主要分布在第2、4、5条染色体上,苜蓿YABBY家族基因中包含5个保守结构域,其蛋白质主要以无规则卷曲的形式构成,α-螺旋、β-折叠和β-转角含量较少,启动子序列分析发现该家族存在ABRE顺式反应元件,能够响应盐胁迫及ABA(Ascisic acid)胁迫,通过基因表达模式分析,发现MsYABBY2基因响应盐、碱、干旱等逆境胁迫,推测其在抗逆境胁迫中起到关键调节作用。本研究为后续研究MsYABBY基因的抗逆机制及调控机理提供了理论基础。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与生物信息学分析

为了研究甘蓝型油菜防御素基因的结构和功能,根据白菜防御素基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆到4个防御素基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,甘蓝型油菜防御素基因cDNA全长325~335 bp,包含231~243 bp的开放阅读框,编码76~80个氨基酸;防御素基因在长期进化过程中产生了显著的差异,但防御素含有的8个保守半胱氨酸残基均稳定存在;Bndef1、Bndef2、Bndef3与萝卜Rs-AFP1、诸葛菜Omdef亲缘关系较近,Bndef4与豇豆Vudef亲缘关系较近;4个防御素蛋白均为稳定蛋白,具有信号肽结构,可能为分泌蛋白。     

甘蓝型油菜BnAPX1基因的克隆与生物信息学分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种利用抗坏血酸作为电子供体的H₂O₂清除剂,在植物抵御逆境胁迫中起到重要作用。为进一步探究甘蓝型油菜APX1基因的功能,本研究通过RT-PCR法从甘蓝型油菜中克隆得到一条长度为753 bp的APX1 CDS序列,将其命名为BnAPX1。生物信息学分析表明,BnAPX1基因共编码250个氨基酸,相对分子量为27.546 14 kD,等电点为5.49,不稳定系数为36.73,属于稳定性蛋白;该蛋白的二级结构中无规则卷曲为42.00%,α-螺旋为39.20%,延伸链为10.40%,β-转角为8.40%;亚细胞定位预测结果显示该基因编码的蛋白位于过氧化物酶体中,其编码的蛋白没有跨膜结构,没有信号肽,属于非分泌蛋白。BnAPX1蛋白含有K+binding site、Substrate binding site、Heme binding site结合位点,属于植物过氧化物酶类似家族。     

甘蓝型油菜PEBP基因家族的鉴定与表达分析

植物磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-bindingprotein,PEBP)基因对于控制开花时间具有重要作用。油菜作为世界上最重要的油料作物之一,与模式植物拟南芥具有相似的开花习性。但有关油菜开花基因的功能研究相对较少。本研究利用拟南芥PEBP基因家族蛋白序列在油菜基因组内进行BlastP分析,获得油菜PEBP家族成员,并对其进行基因结构分析、motif预测、复制事件、进化树构建、选择压力分析和组织表达分析。结果表明,共有26个油菜PEBP基因成员得到鉴定,大部分成员含有4个外显子和3个内含子, motif-1和motif-2是PEBP成员的特征基序,超过76.9%的成员属于片段复制扩增事件。进化树分析显示, PEBP分为3个亚家族,基于转录组测序的组织表达数据表明油菜26个PEBP成员具有非常明显的组织表达特性。以上研究结果,极大丰富了我们对甘蓝型油菜开花基因及调控模式的认识,为进一步的分子育种提供了理论基础。     

甘蓝型油菜G3PDH和PK基因对氮肥的响应

氮肥作为植物生长最重要营养元素,其施用量的多少也是至关重要的。为了研究氮肥施用量对油菜含油量以及相关基因表达水平的影响,本研究以甘蓝型油菜宁油22作为材料,在0 kg/hm2、320 kg/hm2和640 kg/hm2三个不同氮肥水平下分别测定宁油22种子和角果皮的含油量,同时检测G3PDH和PK基因在不同氮肥水平下以及不同组织中的表达含量。结果发现,随着施氮量的增加,宁油22含油量下降,在0 kg/hm2和320 kg/hm2水平下下降不明显,在640 kg/hm2水平下明显下降,并且G3PDH和PK基因随着施氮量的增加,两个基因表达量均增强。本研究还分别分析了G3PDH和PK基因在种子跟角果皮中的比值以及开花30天后跟开花15天后的表达比,结果表明G3PDH基因在种子与角果皮的比值跟开花30天后跟15天后的表达比,均在640 kg/hm2水平下达到最高;PK基因在种子与角果皮中的比值在640 kg/hm2水平下达到最高,在开花30天后跟15天后的表达比在0kg/hm2水平下达到最大。     

甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因的鉴定及功能性研究

液泡是调控植物细胞分化、生长发育的重要部位,AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因调控植物液泡内外离子平衡、离子运输以及能量供应。本研究利用功能已知的拟南芥AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因为参考序列在甘蓝型油菜全基因组数据库、NCBI植物基因组注释数据库等鉴定并筛选出9个BnaAVP1、3个BnaVHA-a2和4个BnaVHA-a3,并分析基因拷贝数变异、分子特征、跨膜结构域、保守基序、染色体定位、系统进化树构建、蛋白二级结构及三维结构预测、高通量转录组测序等。发现甘蓝型油菜BnaAVP1和BnaVHA-a3的基因数量明显多于甘蓝和白菜;甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3蛋白属于由酸性氨基酸组成的稳定蛋白;系统进化选择能力的分析表明,甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3家族基因与甘蓝、白菜关系相近。转录组测序表明,低氮处理后,BnaAVP1s基因主要在地上部表达,且低氮3h后地上部表达下调,低氮处理72h根中表达量上调;BnaVHA-a2s和BnaVHA-a3s基因在地上部和根中均有表达,BnaVHA-a2s在低氮处理72h后表达量基本呈上调趋势,BnaVHA-a3s在低氮3h后基本呈下调趋势。低磷处理后,BnaAVP1s根中大部分基因表达上调,地上部表达基本无差异;BnaVHA-a2s表达基本无差异;BnaVHA-a3s地上部和根中均基本为上调趋势。该结果为进一步研究甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因生物学功能及AVP1、VHA-a2和VHA-a3蛋白水解ATP提供能量供植物代谢的分子机制奠定基础,为已知大量数据的其他物种家族基因生物信息学研究提供参考。     

甘蓝型油菜BnAPs基因家族成员全基因组鉴定及分析

天冬氨酸蛋白酶(AP)属于四大蛋白水解酶之一,在蛋白质加工、信号转导和胁迫反应中发挥着重要作用。甘蓝型油菜是我国重要的油料作物,利用蛋白质同源性分析,在甘蓝型油菜中鉴定出154个APs编码基因,分别编码典型、非典型和珠心类天冬氨酸蛋白酶。基因结构分析结果表明,多数BnAPs基因包含1～4个外显子,同一类型的天冬氨酸蛋白酶成员之间蛋白质基序(Motif)分布相似。共线性分析表明,甘蓝型油菜与白菜、甘蓝和拟南芥存在大量的同源基因,约89%的BnAPs基因来自于全基因组复制事件。转录水平检测结果表明,BnAPs基因家族成员在各个组织中均有表达,其中BnAP30.A05.1/A05.2/C05.1/C05.2、BnAP36.A04/C08、BnAP39.A06/C03在授粉后的柱头显著提高。BnAPs基因启动子区域顺式元件分析结果表明,逆境相关的顺式调控元件被显著富集;进一步利用RT-qPCR验证了这些富含逆境相关顺式调控元件的基因在逆境(ABA、NaCl或4℃)处理后的表达水平显著变化,推测这些BnAPs基因可能参与甘蓝型油菜对逆境的响应。进一步和拟南芥同源基因组织表达模式进行比较后发现,大...     

甘蓝型油菜SnRK基因家族生物信息学分析及其与种子含油量的关系

蔗糖非发酵相关蛋白激酶(sucrose non-fermenting-1-related protein kinase, SnRK)是植物中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它们参与调控植物的信号传导、逆境响应和种子生长等生物学过程。为了解析甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中SnRK基因家族的性质及其对种子含油量的影响,本研究对BnSnRK基因家族的系统进化、基因结构、蛋白质理化性质、保守基序、蛋白质二级结构、顺式作用元件和亚细胞定位预测等进行分析,并通过候选基因关联分析、单倍型分析和qRT-PCR筛选影响种子含油量的BnSnRK基因。结果显示,鉴定得到92个BnSnRK成员,分为3个亚族,分布于甘蓝型油菜19条染色体上,亚族之间蛋白质理化性质差异显著。多数基因拥有7～14个外显子;同一亚族的motif分布情况更相似。BnSnRK家族主要在细胞质中表达,蛋白质二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主。关联分析筛选出与油菜种子含油量相关的12个家族成员,基因BnaC02g10730D可能负向调控甘蓝型油菜种子含油量,基因BnaA07g12290D、BnaA10g22850D...     

Genetic analysis of four self-incompatible lines in Brassica napus

Reciprocal hybridization between four self-incompatible lines of Brassica napus: 271, 181, 184 and ‘White Flower’, revealed incompatibility. The reciprocal F₁s obtained by bud pollination showed self-incompatible reactions, and no segregation for self-incompatibility was observed in all the reciprocal F₂ populations, indicating that lines 271, 181, 184 and ‘White Flower’ were genetically identical with regard to self-incompatibility. Observations of self-incompatibility in 17 hybrids from crosses between line 271 and 17 varieties of B. napus showed 10 of the F₁ hybrids to be self-compatible, while four were partially self-compatible and three were self-incompatible. Genetic analysis based on F₂ and BC₁ populations from five self-compatible F₁ hybrids and two self-incompatible F₁ hybrids suggested the existence of at least two loci controlling the self-incompatibility of line 271: one is the S locus, with dominant and recessive relationships between the S alleles, and the other is the suppressor (sp) of the S locus. The sp locus is genetically different from the S locus, and also shows dominant and recessive relationships between the sp alleles.     

甘蓝型油菜BnDGAT3基因克隆与载体构建及其生物信息学分析

二酰甘油酰基转移酶(DGATs)是肯尼迪途径中三酰甘油合成的限速酶,DGAT3基因是DGAT基因家族重要成员之一,参与植物体内油脂代谢。为进一步探索甘蓝型油菜BnDGAT3基因功能,本研究通过查找拟南芥AtDGAT3 (AT1G48300),并在Brassica Database数据库检索到2条甘蓝型油菜DGAT3序列,以此为参考序列设计引物,在甘蓝型油菜W0111中克隆了大小均为1 071 bp的BnDGAT3两个拷贝,分别命名为BnDGAT3-1、BnDGAT3-2;经双酶切技术,构建pBI101-DGAT3-35S载体,并转化根癌农杆菌GV3101。2条BnDGAT3序列经生物信息学预测结果显示:BnDGAT3编码的氨基酸均为356,理论分子量约38 442.55 Da;BnDGAT3蛋白的二级结构大致相同且无跨膜结构,由具有TRX-like Fds及含有类似TRX-like Fd结构域的蛋白组成,属于TRX-like Fdfamily超基因家族;BnDGAT3均含有相同数目的外显子和内含子,分别位于A08、C08染色体上。本研究克隆的BnDGAT3经生物信息学分析表明该基因是DGAT3基因家族成员,为进一步探索甘蓝型油菜BnDGAT3基因功能及油菜分子育种提供帮助。     

用全基因组关联分析筛选甘蓝型油菜叶片叶绿素含量候选基因

提高油菜产量是保障国家粮油安全的重要举措。作物"源""流""库"理论表明,充足的光合产物(源)是高产的前提,而叶绿素是直接参与光合作用的物质,因此,选育高叶绿素含量的甘蓝型油菜是提高产量的重要途径。本课题组前期对全球收集的588份优异油菜种质资源进行5X重测序,获得385,692个高质量SNP标记。利用SPAD-502叶绿素仪于2018—2019连续2年测定苗期完全伸展的叶片叶绿素总量,结合获得的SNP标记进行全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS),筛选与叶绿素含量显著关联的SNP位点。结果表明, 2018年鉴定到5个显著关联的SNP位点,贡献率为5.51%～7.89%,其中S6₃493805位点贡献率最大;2019年检测到46个SNP位点,贡献率为7.29%～10.34%,其中S13₁1413088位点贡献率最大。将显著关联SNP位点上下游各500 kb区间内的基因与参考基因组比对,初步筛选出2022个油菜基因。将其基因序列在拟南芥基因组内进行BLAST比对,结合前人已报道的拟南芥同源基因...