甘蔗割手密种类甜蛋白家族鉴定及栽培种同源基因功能分析

类甜蛋白(thaumatin-like protein,TLP)在植物生长发育和抵抗逆境胁迫中发挥重要作用。为全面了解甘蔗TLP家族基因的结构和功能特性,本研究利用甘蔗野生种割手密基因组数据库和生物信息学方法,首先筛选获得122个SsTLP家族基因并进行蛋白理化性质、基因染色体分布、基因结构和系统进化等分析;其次,从我国大陆主栽甘蔗品种ROC22中克隆到1条SsTLP87的同源基因ScTLP1,并对其基因表达模式、亚细胞定位、瞬时表达和转录自激活活性进行鉴定。结果表明,122个SsTLP家族基因分布在28条割手密染色体上,且存在多基因聚集现象,每条染色体上有1~13个SsTLP基因,多数SsTLP蛋白被预测为定位于细胞质的酸性疏水性不稳定蛋白。SsTLP家族基因结构类型多样,其内含子数目(1~30)、内含子相位(0~2)和Motif(1~5)存在多种类型和分布。系统进化树分析显示,SsTLP基因编码蛋白分别聚类在TLP家族的Ⅰ~Ⅹ分支上,其中具有抑菌潜力的第Ⅴ类SsTLP数量最多(36个)。从甘蔗栽培种ROC22克隆获得的ScTLP1基因编码227个氨基酸残基,属于第Ⅴ类进化聚类组,定位于细胞膜,不具有转录自激活活性,其与割手密SsTLP87蛋白的氨基酸序列相似性高达99.56%。qRT-PCR分析表明,ScTLP1基因在甘蔗不同组织部位组成型表达,且在蔗芽部位的表达量最高。ScTLP1基因在脱落酸(abscisic acid,ABA)和水杨酸(salicylic acid,SA)处理下的表达量无显著变化,但受甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitaminea)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、氯化钠(sodium chloride,NaCl)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和4℃低温诱导上调表达。瞬时过表达ScTLP1基因后,本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中的DAB染色加深,乙烯合成相关基因NtEFE26和茉莉酸代谢途径相关基因NtPR3上调表达,且接种烟草青枯菌(Pseudomonas solanacearum)和烟草茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium solani var.coeruleum)的ScTLP1基因瞬时过表达叶片发病情况较对照组轻,表明ScTLP1基因可以诱发本氏烟的过敏反应,参与乙烯和茉莉酸信号传导途径,增强本氏烟对病原菌的防御效应。研究结果为深入探究甘蔗TLP家族基因的结构和功能奠定了良好的基础。     

三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的功能分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是植物抗病防御系统的重要组成部分。在前期研究中,从三七中分离得到一个编码PGIP蛋白的基因PnPGIP,PnPGIP在转录水平响应三七根腐病菌茄腐镰刀菌的侵染。为深入分析PnPGIP的功能,构建PnPGIP的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行大量表达,纯化获得PnPGIP的重组蛋白,并进行体外平板抑菌试验;构建PnPGIP的植物超表达载体,通过根癌农杆菌介导产生了PnPGIP转基因烟草,分析T2转基因烟草离体叶片对茄腐镰刀菌的抗性。PnPGIP原核重组蛋白对茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌、核盘菌和轮枝状镰刀菌的菌丝生长具有很强的抑制作用,并且随着蛋白量的增加,抑制活性也逐渐增强。q RT-PCR分析结果显示,PnPGIP在T2转基因烟草中大量表达。此外,与野生型烟草相比,转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性显著增强。PnPGIP是三七中参与茄腐镰刀菌防御反应的重要抗病基因。     

甘肃高寒阴湿区豌豆根腐镰刀菌种群及致病性研究

甘肃省高寒阴湿区豌豆镰刀菌根腐病的病原有5种,即茄病镰刀菌[Fusarium solani(Mart.)Sacc]、茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium sola-ni var.coeruleum)、半裸镰刀菌(Fusarium semitec-tum)、单隔镰刀菌(Fusarium dimerum)、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)。茄病镰刀菌致病性最强,拟丝孢镰刀菌和茄病镰刀菌蓝色变种次之,半裸镰刀菌和单隔镰刀菌的致病性较弱。其中半裸镰刀菌、单隔镰刀菌、拟丝孢镰刀菌是中国豌豆病原菌上的新纪录。     

甘蔗Na~+/H~+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因SOS1(salt overly sensitive 1)是植物耐盐性的必需基因之一,在植物抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。本研究以小麦EST序列KJ563230为探针,利用电子克隆技术结合RT-PCR,获得一条甘蔗SOS1基因的cDNA序列,命名为ScSOS1(GenBank登录号为KT003285)。序列分析结果表明,该基因全长1403 bp,包含一个1272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸的蛋白质。ScSOS1蛋白的相对分子质量为47.6 kD,理论等电点(pI)为9.12。氨基酸序列分析表明,ScSOS1蛋白具有一个CAP-ED superfamily结构域。生物信息学预测显示,ScSOS1的编码蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与中间代谢。实时荧光定量PCR分析表明,ScSOS1基因的表达具有组织特异性,在甘蔗叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽和根中均有表达,其中在叶鞘中的表达量最高,根中的表达量最低。此外在NaCl、PEG、ABA、SA和MeJA的胁迫过程中,该基因表达均受到调控,其中受NaCl和PEG诱导后上调表达,均在24 h表达量达最高,分别约为对照组的1.5倍和4.0倍。推测该基因的表达与甘蔗耐盐性和抗渗透胁迫有关。     

甘蔗S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM)的克隆及表达

利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号(ROC 22)中克隆获得SAM基因的cDNA序列,命名为ScSAM,GenBank登录号为KC172558。用生物信息学方法预测分析其序列,cDNA全长1466 bp,含有1个1191 bp的完整开放阅读框(ORF),编码396个氨基酸,与高粱和玉米等植物的SAM蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScSAM与高粱的SAM蛋白亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明ScSAM为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的3.6倍。其在黑穗病菌胁迫和低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同;在H₂O₂胁迫下其表达被抑制。推测其可能参与甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱、抗盐和抗氧化等胁迫过程中也起某种作用。     

甘蔗类甜蛋白基因ScTLP2和ScTLP3的生物信息学分析及表达

类甜蛋白(thaumatin-like proteins,TLPs)是一类与作物抵抗真菌病害紧密相关的病程相关蛋白。本研究从课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库中筛选获得两个甘蔗类甜蛋白基因(ScTLP2和ScTLP3),利用生物学软件对ScTLP2和ScTLP3基因进行序列特征、结构功能及聚类分析,采用qRT-PCR技术,检测ScTLP2和ScTLP3基因在不同甘蔗组织和黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)胁迫下的表达情况。生物信息学分析显示,ScTLP2基因全长1835 bp,包含1个969 bp的完整开放读码框,编码322个氨基酸;ScTLP3基因全长1259 bp,包含1个765 bp的完整开放读码框,编码254个氨基酸。ScTLP2和ScTLP3编码蛋白均含有THN家族的保守结构域和糖苷水解酶家族的64结构域(GH64-TLP-SF),两者分别隶属于TLPs家族中的Ⅵ类和Ⅰ类。q RT-PCR结果表明,ScTLP2和ScTLP3基因在甘蔗中均为组成型表达,其中ScTLP2基因在蔗叶中的表达量最高,是蔗皮的11.2倍,而ScTLP3基因在蔗芽中的表达量最高,是蔗皮的45.3倍。受黑穗病菌侵染后,ScTLP2基因在甘蔗抗黑穗病品种‘崖城05-179’中上调表达,而在感黑穗病品种‘ROC22’中无明显变化;相反的,Sc TLP3基因表达量在‘崖城05-179’中无明显变化,在‘ROC22’中上调表达。以上结果为深入研究甘蔗ScTLP家族基因的结构和功能积累了基础资料。     

甘蔗E3泛素连接酶基因PRT1的生物信息学及表达模式分析

为探究甘蔗PROTEOLYSIS 1(PRT1)基因与黑穗病菌的互作关系，以甘蔗割手密种和栽培品种为研究对象，通过RT-PCR技术对ScPRT1(GenBank登录号：MT747433)基因进行克隆，生物信息学分析、定量PCR、亚细胞定位和基因共表达网络分析。生物信息学分析表明，该基因的cDNA全长为1 621 bp,包含一个长度为1 260 bp,编码419个氨基酸的完整开放读码框；其编码蛋白的分子量为46.56 ku,为酸性、不稳定的亲水蛋白，无信号肽，具有核定位信号；该蛋白包含2个RING结构域和1个ZZ结构域；ScPRT1蛋白的高级结构元件多为无规则卷曲。定量PCR结果显示，ScPRT1在皮、叶片、芽中的表达量相差不大，在蔗髓中表达量最高。同时该基因的表达受脱落酸胁迫后显著上调；受黑穗病菌胁迫后，在甘蔗抗黑穗病品种中上调表达，在感黑穗病品种中下调表达，都达到了显著水平。亚细胞定位结果揭示，ScPRT1定位于细胞核。寄主甘蔗和病原黑穗病菌的基因共表达网络中，与甘蔗ScPRT1共表达的黑穗病菌基因中，有3个为N端具有芳香族氨基酸残基的黑穗病菌效应蛋白，这暗示它们之间存在直接的相互作...     

甘蔗谷胱甘肽硫转移酶基因SoGST-1a的克隆与表达分析

克隆甘蔗谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因,并分析其序列特征和表达谱,为甘蔗抗旱育种提供基因来源。本研究采用电子克隆和RT-PCR技术从甘蔗品种‘新台糖22号’中克隆到一个甘蔗GST基因,命名为SoGST-1a。通过生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR检测其表达谱。序列分析表明该基因cDNA全长702 bp,编码224个氨基酸,预测的蛋白分子式为C₁₁₁₇H₁₇₅₀N₃₀₀O₃₂₈S₆,蛋白分子量为24.82 kDa,等电点为5.96。蛋白疏水性分析推测其为亲水性蛋白。保守结构域预测表明SoGST-1a蛋白具有2个GST结构域。系统进化树分析表明该基因与玉米Zeta类GST蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,干旱胁迫下SoGST-1a基因下调表达。研究结果表明,SoGST-1a基因可能在甘蔗干旱胁迫中并不发挥一定作用。这些结果为深入了解SoGST-1a基因的生物学功能奠定了基础。     

甘蔗ScWRKY4基因的克隆与表达特性分析

WRKY是植物中特有的转录因子家族之一, 在植物对生物和非生物逆境胁迫的应答反应中起重要调控作用。本研究基于课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库, 从新台糖22 (ROC22)中成功克隆到1个WRKY基因, 命名为ScWRKY4 (GenBank登录号为MG852087)。序列分析发现, ScWRKY4基因cDNA全长1265 bp, 包含1个741 bp的完整开放读码框, 编码246个氨基酸, 该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域和C₂H₂锌指结构域, 属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测分析发现, ScWRKY4蛋白为碱性的不稳定亲水性蛋白, 不存在信号肽和跨膜结构域, 蛋白二级结构元件缺少β螺旋。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScWRKY4蛋白定位于细胞核。酵母杂交实验结果显示, ScWRKY4不具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明, ScWRKY4基因在甘蔗的根、叶、芽和皮中的表达量无明显差异, 在蔗肉中的表达量最高, 为对照蔗根的18.38倍; 黑穗病菌侵染0~72 h, ScWRKY4在抗病品种崖城05-179中下调表达, 在感病品种ROC22中表达较稳定; 受到外源激素脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯以及非生物胁迫因子氯化钠和聚乙二醇胁迫后, ScWRKY4基因均被诱导上调表达。上述研究结果表明, ScWRKY4基因可能不参与甘蔗对黑穗病的抗性反应或在该防御方面起负调控作用, 但积极响应甘蔗对盐和干旱胁迫的应答。     

甘蔗磷脂酰肌醇转运蛋白基因ScSEC14响应干旱和盐胁迫

Sec14-like磷脂酰肌醇转运蛋白(Sec14-like phosphatidylinositol transfer proteins, PITPs), 广泛存在于真核生物细胞中, 参与肌醇磷酸代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫等多种重要的生命过程。甘蔗中响应干旱和盐胁迫的Sec14-like基因尚未见报道。本研究从甘蔗受黑穗病胁迫的转录组数据库中获得一条SEC14基因序列, 并利用RT-PCR技术克隆得到甘蔗SEC14基因cDNA全长序列, 命名为ScSEC14 (GenBank登录号为MG571103)。生物信息学分析显示, ScSEC14基因全长1617 bp, 包含一个1008 bp的完整开放阅读框, 编码335个氨基酸; ScSEC14为不稳定的亲水性蛋白, 不存在信号肽; 蛋白二级结构元件多为α-螺旋, 具有典型的SEC14结构域和CRAL_TRIO_N结构域。此外, 系统进化树分析揭示, 该蛋白属于Sec14-like蛋白家族的SSH (soybean Sec14 homolog group)亚家族。亚细胞定位结果表明, ScSEC14蛋白主要定位于细胞膜。实时荧光定量PCR分析发现, ScSEC14基因在甘蔗中组成型表达, 在蔗皮中的表达量最低, 蔗叶中的表达量最高, 约为蔗皮的4.9倍; 该基因在PEG、NaCl、CaCl₂和水杨酸(SA)胁迫下的表达量均上调。因此, 甘蔗ScSEC14基因可能参与Ca ²⁺和SA介导的抗逆信号通路, 积极响应逆境胁迫, 尤其调节了干旱和高盐环境下的抗逆性。     

甘蔗Rieske Fe/S蛋白前体基因ScPetC的克隆及表达分析

细胞色素b6f复合体还原型铁硫蛋白前体(Cytochrome b6f complex Rieske Fe/S precursor protein, PetC)是由细胞核PetC基因编码的蛋白,其成熟蛋白参与构成细胞色素b6f复合体,是电子传递的重要元件。基于前期构建的受高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)侵染的甘蔗转录组数据库,从主栽甘蔗品种‘新台糖22号’叶片中成功克隆到该基因,并命名为ScPetC (GenBank登录号为MH333037.1)。生物信息学分析发现, ScPetC基因cDNA全长824bp,包含了一个678bp的开放阅读框,编码226个氨基酸。ScPetC属于PRK13473超家族,其C末端具有典型的Rieske保守结构域;蛋白理论等电点为8.19,属于稳定的、亲水性蛋白;二级结构多为无规则卷曲,三级结构预测其比其他植物PetC多出一段α螺旋结构。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScPetC定位于叶绿体、细胞质和细胞膜。尽管前人研究表明, ScPetC的表达量会受SrMV侵染的影响,不同于半夏(Pinellia ternata) PetC与大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV) P1蛋白之间的互作, ScPetC不能与SrMV-P1蛋白互作,但能与甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV) P0蛋白互作。实时荧光定量PCR分析表明, ScPetC基因在甘蔗不同组织中均有表达,但在叶片中的表达量最高。甘蔗受脱落酸胁迫3 h时, ScPetC表达量显著上调,但是随着处理时间的延长,表达受到抑制;在茉莉酸甲酯、水杨酸、氯化铜、氯化镉和氯化钠胁迫下,ScPetC表达量均显著下调。本研究通过对ScPetC生物学功能、环境外源激素与重金属等胁迫下的表达模式及其与甘蔗病原病毒蛋白互作的初步探究,增加了对甘蔗PetC的了解,也为深入研究其在甘蔗受黄叶病毒侵染中的作用奠定基础。     

小麦4B染色体上LOX基因的等位变异及其区域分布

为了解中国不同麦区小麦种质资源籽粒脂肪氧化酶（lipoxygenase,LOX）活性相关基因TaLox-B1的差异和分布,利用小麦4B染色体上的功能标记LOX16和LOX18对7个麦区的436份种质资源进行分子检测。结果表明：在供试材料中共检测到3种TaLox-B1基因等位变异类型,分别为TaLox-B1a（与高LOX活性相关)、TaLox-B1b（与低LOX活性相关）和杂合型,其频率分别为19.0％、70.4％和10.6％。小麦LOX活性基因不同变异类型在各生态区的分布存在明显差异：基因型TaLox-B1a在黄淮冬麦区、北部冬麦区和长江中下游冬麦区分布较多,其比例分别为21.1%、19.8%和17.6%;基因型TaLox-B1b在西南冬麦区和长江中下游冬麦区分布较多,比例分别为87.9%、72.5%;杂合型仅存在于北部冬麦区、黄淮冬麦区与长江中下游冬麦区,比例分别为14.2%、12.4%和9.8%。利用标记LOX16和LOX18对53个自选高代品系进行分子检测,发现自选品系仅有TaLox-B1b与杂合型两种基因型,其中基因型TaLox-B1ab有32个,比例为60.4%。采用分子标记辅助选择,有利于快速鉴定小麦籽粒LOX活性,加速LOX的遗传改良和新品种选育。     

烟草青枯病和黑胫病拮抗细菌的筛选、鉴定及防效研究

筛选对烟草青枯病和黑胫病具有良好防效的生防菌株,为烟草根茎类病害的有效防控提供生防资源。从发病烟株根际土壤中分离细菌,采用平板对峙法和滤纸片法测定分离菌株对烟草青枯病菌和黑胫病菌的抑制活性,基于盆栽验证法检测高活性菌株对烟草青枯病和黑胫病的防治效果,通过16S rDNA通用引物对高活性拮抗菌株进行分子生物学鉴定,同时选用9对特异性引物对高活性菌株的促生长和抑菌活性进行PCR检测。共筛选出2株对烟草青枯病和黑胫病均有防治效果的拮抗菌株LF-1和LF-2,经分子生物学鉴定LF-1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,LF-2为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。室内活性试验结果表明,菌株LF-1、LF-2对烟草青枯病菌抑制率分别为31.16%、56.98%,对烟草黑胫病菌抑制率分别为64.44%、72.44%;盆栽试验结果表明,菌株LF-1对烟草青枯病和黑胫病的防效分别为69.54%和65.49%,菌株LF-2对烟草青枯病和黑胫病的防效分别为72.49%和68.32%。菌株LF-1和LF-2对烟草根茎类病害具有较好的生防效果,在烟草根茎类病害防控中应用前景广阔。     

甘薯IbCAF1基因的克隆及耐盐性、抗旱性鉴定

CAF1 (CCR4-associated factor 1) gene plays an important role in plant development and disease resistance. In this study, the IbCAF1 gene of sweetpotato was cloned according to the EST sequence. The ORF of IbCAF1 was 846 bp, encoding 281 amino acids, with a molecular weight of 32.13 kD and an isoelectric point of 4.83. The results of amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that IbCAF1 had higher homology with ItlCAF1, a homologous protein of Ipomoea triloba (2x), and the homology was 96.8%. IbCAF1 gene was induced and expressed by NaCl, PEG, ABA, and H₂O₂. The IbCAF1 gene was transferred into tobacco by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. The overexpression of IbCAF1 gene significantly improved the salt and drought tolerance of transgenic tobacco plants. After 200 mmol L ^-1NaCl and 10% PEG-6000 treatments, the transgenic tobacco plants showed significant upregulation of the genes involved in ROS scavenging system and proline biosynthesis related genes, significant increase of SOD activity, POD activity and proline content and significant decrease of H₂O₂ and malondialdehyde contents. These results demonstrate that the IbCAF1 gene could improve salt and drought tolerance in transgenic tobacco. This study will lay a foundation on salt and drought tolerance gene engineering of IbCAF1 gene in sweetpotato for the following research.     

RNA干扰对烟草NtPPO8基因沉默的效应分析

多酚氧化酶（PPO）是发生酶促褐变的关键酶,PPO活性过高会使烟叶变褐。为明确烟草NtPPO8基因对PPO活性的影响,建立降低NtPPO8基因表达量的病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）体系,探究使用RNA干扰技术对烟叶NtPPO8基因表达量及PPO活性的影响。以中烟100和K326为材料,分析在移栽后50d进行VIGS载体侵染的植株,并在侵染后10、20、30、40d分别测定NtPPO8基因表达量及PPO活性。结果表明,接种VIGS载体的转化植株,其中在侵染后20d时NtPPO8基因的沉默效率最高,为78.46%;随着侵染时间推移,NtPPO8基因的沉默效率逐渐降低,在接种后40d内有效表达;且转化植株中的病毒载体会随着植株的生长而向上传导,随着接种部位的上移,沉默效率逐渐降低。因此,研究建立VIGS体系能够有效沉默NtPPO8基因的表达,并且有效降低PPO活性,为提高烟叶耐烤性及降低烟叶褐变比例提供了新的思路和方法。     

甘蔗ScCRT1基因克隆及其应答SCMV侵染分子机制的研究

Calreticulin (CRT) is widely expressed in eukaryotes. As a molecular chaperone and a Ca²⁺ binding protein, CRT is involved in many biological pathways such as the regulation of calcium homeostasis, calcium-dependent signaling, endoplasmic reticulum quality control, plant growth and development, immunity and response to stress. However, the response of CRT of sugarcane (Saccharum spp. hybrid) challenged by Sugarcane mosaic virus (SCMV) has not been reported. In this study, a CRT gene was cloned from the noble cane cultivar Badila (S. officinarum) and designed as ScCRT1. ScCRT1 had an open reading frame (ORF) length of 1281 bp and encoded 426 amino acids. Bioinformatics analysis showed that ScCRT1 was a stable hydrophilic protein and possesses a signal peptide at the N-terminal, a typical transmembrane domain, and a typical endoplasmic reticulum location signal at the C-terminal. The secondary structure of ScCRT1 was composed of mostly random coils. Phylogenetic tree analysis indicated that ScCRT1 belonged to the CRT1/CRT2 subtype and was divergent between monocotyledons and dicotyledons. Subcellular location assays showed that ScCRT1 was mainly located in the endoplasmic reticulum. Real-time quantitative PCR analysis showed that ScCRT1 gene was extensively expressed in different tissues of sugarcane, with the highest expression in leaf roll and the lowest expression in the 8th internode. ScCRT1 gene was up regulated in the early stage of SCMV infection, but down regulated with time going. ScCRT1 interacted with the 6K2 from SCMV as confirmed by yeast two hybrid and bimolecular fluorescence complementation assays. Based on these foundlings, we speculated SCMV interfered the calcium homeostasis by the interaction of 6K2 with ScCRT1, thereby facilitating viral infection of sugarcane.