谷子萌发吸水期关键代谢途径的筛选与分析

【目的】谷子适应性强,抗旱耐瘠,是起源于中国的重要作物。通过转录组测序技术分析谷子萌发不同吸水期的转录组差异,以期获得谷子萌发过程中的差异表达基因,寻找调控谷子萌发的重要代谢途径和代谢物。【方法】以晋谷20为材料,构建谷子萌发过程中开始快速吸水期、滞缓吸水期和重新大量吸水期的cDNA文库,进行转录组分析;采用K-Means开展基因表达聚类分析;利用DESeq筛选差异表达基因;通过COG、GO、KEGG等对差异表达基因进行功能注释;利用KEGG富集挖掘不同吸水期调控种子萌发的关键代谢途径和关键基因;并采用qRT-PCR验证其可靠性;用HPLC分析关键代谢物含量。【结果】转录物测序分析获得谷子萌发开始快速吸水期、滞缓吸水期和重新大量吸水期覆盖整个基因组的基因表达谱,共获得33 643个基因,识别9个具有不同表达模式的共表达基因簇。比较种子萌发的开始快速吸水期与滞缓吸水期、滞缓吸水期与重新大量吸水期、开始快速吸水期与重新大量吸水期,分别筛选出3 893、4 612和8 472个差异表达基因。KEGG富集分析表明,3个比较的差异表达基因都显著富集到phenylpropanoid biosynthesis、phenylalanine metabolism、starch and sucrose metabolism代谢途径;开始快速吸水期与滞缓吸水期、开始快速吸水期与重新大量吸水期的差异表达基因还显著富集到plant hormone signal transduction途径。并且3个比较中富集到phenylpropanoid biosynthesis和phenylalanine metabolism代谢途径的差异表达基因数都最多,其中过氧化物酶基因（peroxidase）比例最高。通过qRT-PCR对4个苯丙烷生物合成途径相关基因的分析表明,其表达趋势与转录组分析结果基本一致,其中,4-香豆酸-CoA连接酶3（4-coumarate-CoA ligase 3）在谷子种子中存在已形成mRNA,萌发吸水过程中呈先下调后上调再下调的表达趋势。苯丙烷类相关代谢物含量分析显示,芥子酸在种子中大量储备,在萌发过程中呈下调趋势;阿魏酸、对香豆酸和咖啡酸呈先上调后下调趋势。【结论】谷子萌发过程中,不同吸水期的差异表达基因显著与苯丙烷生物合成途径和苯丙氨酸代谢途径相关;其上游基因4-香豆酰-辅酶A连接酶和下游基因过氧化物酶家族成员在谷子萌发响应水分过程中发挥调控作用;中间产物芥子酸可能参与种子的休眠与萌发。     

谷子萌发期响应干旱胁迫的基因表达谱分析

【目的】谷子是一种耐旱作物,通过二代测序技术获得大量的谷子萌发期响应干旱胁迫的差异基因,进而挖掘谷子萌发期抵御干旱的关键基因及其相关的分子机制。【方法】以晋谷45为材料,谷子萌发期分别用18%PEG-6000干旱胁迫（处理组）和蒸馏水（对照组）处理种子并测定1、10和18 h种子的SOD、POD和CAT活性。SOD活性用氮蓝四唑（NBT）法测定,POD活性用愈创木酚法测定,CAT活性用比色法测定;对萌发10和18 h种子的对照组和处理组构建cDNA文库并进行差异基因表达谱分析;利用Bowtie将reads比对到参考基因组,采用RSEM对bowtie的比对结果进行表达量估计;使用DESeq进行差异表达基因分析;利用NR、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO在线数据库对差异基因进行功能注释,挖掘调控谷子萌发的关键基因;利用qRT-PCR验证测序结果的可靠性。【结果】处理组的SOD活性整体比对照组高,而POD活性和CAT活性与之相反;随着萌发时间的变化,SOD活性在不断地增加,但CAT和POD活性逐渐减小。基因表达谱序列与所选参考基因组序列高度一致,基因表达呈现出高度不均一性。通过高通量测序最后获得35 470个基因,以RPKM≥0.01为筛选标准,对照样本中分别筛选出24 030和24 486个表达基因,PEG干旱胁迫处理10和18 h的样本分别筛选出24 019和23 877个表达基因;差异表达基因分析表明,谷子萌发10和18 h分别筛选出456和545个差异基因,其中87和267个上调表达基因,369和278个下调表达基因;GO功能显著性富集分析表明,差异基因主要涉及代谢过程,细胞进程和响应刺激;KEGG富集分析表明,差异基因参与到苯丙烷代谢和植物激素信号转导过程;通过qRT-PCR对5个差异基因在干旱胁迫下种子萌发时的表达分析表明,其表达趋势与表达谱分析结果基本一致。【结论】差异表达基因广泛涉及到糖、蛋白质、核酸等生物大分子代谢、次生代谢和能量代谢等过程;SnRK2和PAL可能在干旱胁迫下调节种子的萌发。     

NaCl处理谷子萌发期种子的转录组学分析

【目的】谷子具有抗旱、耐贫瘠的特性,逐渐成为研究禾本科作物的模式作物。本研究以前期筛选并获得的谷子耐盐品种和敏感品种为材料,通过RNA-Seq测序筛选鉴定谷子的盐胁迫响应基因,揭示其响应盐害机制,为培育谷子抗盐新种质提供理论依据。【方法】 对14个谷子品种进行了萌发期抗盐筛选。谷子不同品种的种子经150 mmol·L ^-1NaCl处理萌发培养7 d后,分别统计各品种种子的萌发率、根长和芽长,综合各项指标鉴定到豫谷2为耐盐品种、安04为盐敏感品种。以这两个品种盐胁迫前、后萌发期种子为材料,应用RNA-Seq进行转录组测定,分析鉴定盐害下差异表达基因（differentially expression gene,DEG）,并对DEG进行GO和KEGG功能富集分析。同时应用qRT-PCR对随机挑选的15个DEG表达模式进行验证,并与RNA-Seq结果进行相关性分析。 【结果】 耐盐品种豫谷2、盐敏感品种安04种子经盐胁迫处理后,分别鉴定出2 786个和4 413个DEG;其中,每个品种在NaCl处理前及处理后分别鉴定出1 470和3 826个DEG。GO和KEGG聚类分析显示,NaCl处理下参与信号转导、抗氧化、有机酸的合成及转运以及次生代谢等相关的DEG在谷子萌发期种子应对盐胁迫响应过程中具有关键性的作用,DEG主要集中在胁迫响应、离子的跨膜转运、氧化还原、次生代谢及有机酸、多胺、苯丙烷的合成等过程。qRT-PCR对15个DEG表达模式的检测结果与RNA-seq结果相关系数为0.8817。其中编码离子通道的基因（HKT）、过氧化物酶基因（POD）、黄烷酮-3-羟化酶基因（FL3H）、MYB转录因子基因等在豫谷2中表达量较高,显示其在谷子萌发期种子响应盐胁迫中可能发挥一定作用。【结论】 谷子耐盐品种及盐敏感品种的种子对盐胁迫的响应程度具有一定的差异性,且品种对盐害的耐受能力主要与基因对胁迫的响应程度相关,而与DEG的数量相关性不大。     

利用RNA-Seq鉴定甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因

【目的】利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技术比较2种不同生长条件下甘蓝型油菜苗期叶片转录组,鉴定油菜叶片干旱胁迫应答相关基因,从转录组水平揭示油菜适应干旱胁迫环境的分子机制。【方法】提取正常生长（ZY）和自然失水处理（ZY8D）的六叶期甘蓝型油菜中油821的叶片总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。利用NGSQCTookit v2.3.3去除低质量和包含模糊碱基的reads。以甘蓝型油菜亲本物种白菜染色体v1.5和甘蓝Scaffold v1.0为参考序列,采用TopHat2-Cufflinks-Cuffmerge-Cuffdiff标准流程进行差异表达基因（differential expressed genes,DEGs）筛选。对上调和下调DEGs分别采用Cytoscape v3.1.0中的BiNGO和KOBAS2.0进行基因本体（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）代谢途径富集分析。选择上调和下调DEGs各3个,以实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】过滤低质量reads后,ZY和ZY8D分别保留了26 192 312和28 378 899对高质量reads用于DEGs筛选,其中86.6%和85.8%的reads能准确比对到参考序列上,说明RNA-Seq结果和参考序列可靠。DEGs鉴定结果表明3 657个基因受干旱胁迫诱导差异表达,其中上调表达基因1 431个,下调表达基因2 226个。GO富集分析发现上调表达基因主要与非生物胁迫响应和化学刺激响应相关,其中,参与水分胁迫响应和脱落酸（abscisic acid,ABA）刺激响应的基因分别有127和141个,而下调表达基因与植物病原菌防御、蛋白激酶活性和水杨酸（salicylic acid,SA）刺激相关。KEGG富集分析表明上调表达基因主要富集于苯丙烷和类胡萝卜素的生物合成及淀粉与蔗糖代谢途径,而下调表达基因主要富集于植物-病原菌互作和植物激素ABA、SA和茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号转导途径。qRT-PCR检测6个DEGs的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】RNA-Seq分析鉴定出3 657个甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因。GO和KEGG代谢途径分析明确了差异表达基因富集的分子功能与代谢途径。     

干旱胁迫下割手密根系转录组差异表达分析

【目的】探明云南割手密82-114受干旱胁迫的内在分子机制,挖掘与抗旱密切相关的功能基因,提高割手密抗旱基因的研究与利用。【方法】以干旱胁迫24、48和72 h的云南割手密82-114的根系进行Illumina Hi Seq TM 4000高通量转录组测序分析,将组装得到的Unigene分别与Swiss-Prot、Nr、KOG、Pfam和KEGG数据库进行比对,利用RPKM来衡量各样本间的基因表达丰度,以FDR≤0.05和|log2 fold change|≥1来评估样本间的差异表达基因,通过Gene Ontology(GO)数据库、KEGG pathway数据库对不同干旱胁迫样本差异表达基因的功能和参与的调控路径进行分析。【结果】未胁迫处理的CK与胁迫24、48和72 h后的样本转录组分别检测到134 724、130 368、133 564和131 321个表达基因,与CK相比,各胁迫样本显著上调(或下调)的差异表达基因分别有3 061(1 302)、2 304(2 841)和3 236(2 525)个;以FDR值=0为筛选条件,3个样本的极显著差异表达基因主要参与转录激活、水分运输、DNA结合、ATP结合及细胞膜、跨膜运输和防御反应等有关代谢活动。GO富集分析表明:3个胁迫处理的样本在生物学途径中富集最多的类别并不完全相同,其中,胁迫24 h与48 h的样本富集最多的类别是与DNA依赖型转录和转录调节子相关的基因,胁迫72 h样本富集最多的类别是与翻译相关的基因;而在细胞组件和分子功能中,3个胁迫样本富集最多的基因类别均是与内在的膜、核和ATP结合相关的基因。KEGG富集分析表明:胁迫24 h的样本有2 248个差异表达基因参与了107条代谢途径,胁迫48 h的样本有2 114个差异表达基因参与了130条代谢途径,胁迫72 h的样本有2 392个差异表达基因参与了144条代谢途径;经KEGG显著性富集分析,筛选到鞘糖脂生物合成途径、MAP激酶信号途径和ABC转运蛋白等与非生物胁迫或逆境相关。【结论】获得3个干旱胁迫样本与CK样本间差异表达基因的变化及其功能信息,发现参与云南割手密82-114干旱胁迫响应相关的细胞外信号调节激酶、磷脂酶D、β-氨基己糖苷酶和ATP结合盒B亚族(MDR/TAP)-1等,获得在整个干旱胁迫时期稳定上调表达基因70个,稳定下调表达基因11个,通过同源基因序列的比对分析,阐明这些基因在各自的代谢通路中被强烈诱导或抑制表达,显示与干旱胁迫存在密切关系。     

基于RNA-Seq的镉、铅胁迫下间作续断菊根差异基因的转录组分析

【目的】初步探索间作系统中重金属超富集植物续断菊对镉、铅吸收、转运、结合的分子机制,为进一步进行超富集植物续断菊转录组差异表达基因分析及耐重金属相关基因、重金属转运相关基因挖掘奠定基础。【方法】本研究采用RNA-Seq技术对间作系统中续断菊根组织转录组进行分析。【结果】通过Illumina Hi Seq TM 2000测序和De novo组装共得到19.23 GB的过滤后数据和65 357个续断菊根Unigenes,对差异显著的基因进行分析共得到上调的基因有52个,下调的有116个。对获得的Unigenes进行功能注释,在Nr、Swissprot、KOG和KEGG四大数据库共注释到44 059个。【结论】间作显著提高了续断菊生物量、镉铅含量和转运系数;GO功能富集分析显示:差异表达基因归类为生物学过程、细胞组分和分子功能,间作使得续断菊对与重金属镉、铅的吸收、转运和结合的相关基因表达量有显著影响,结合和吸收功能增强;KEGG Pathway富集分析表明:这些差异表达基因主要参与生物素代谢、氧化磷酸化、自噬调控等途径。     

卵形鲳鲹卵巢不同发育时期的转录组测序分析

【目的】鉴定筛选出与卵形鲳鲹卵巢发育相关的候选基因及信号通路,为揭示其卵巢性成熟过程的分子机制打下基础。【方法】挑选卵巢发育处于?期和Ш期的雌性卵形鲳鲹,分别构建卵形鲳鲹卵巢?期和Ш期的cDNA文库,采用Illumina HiSeqTM 2500进行转录组测序,经过滤、质量控制及拼接组装后获得的Unigenes在七大数据库（Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO）中进行比对;通过FPKM及DEGseq筛选出差异表达基因,以GOseq和KOBAS对差异表达基因分别进行功能注释及信号通路富集分析,并采用MISA和GATK3进行SSR鉴定及SNP分析。【结果】卵形鲳鲹卵巢组织转录组测序获得的325156432条Raw reads,经过滤筛选得到317206752条Clean reads,拼接组装后得到59554条Unigenes;69.65%的Unigenes在Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO等七大数据库中注释成功,其中有24599条Unigenes被注释到GO数据库,15997条Unigenes被注释到KEGG数据库。在卵形鲳鲹卵巢组织的2个发育时期共鉴定获得56115个基因,经差异表达分析后获得17737个差异基因,其中8169个基因在卵巢Ш期上调表达、9568个基因在卵巢Ш期下调表达。GO功能注释分析发现,卵形鲳鲹卵巢差异表达基因主要注释在细胞过程、氮化合物代谢过程、初级代谢过程、核、核部分、离子结合及水解酶活性等条目上;而KEGG信号通路富集分析结果显示,17737个差异表达基因显著富集在318条代谢途径上,其中前20条KEGG信号通路包括2-氧代羧酸代谢、PI3K-Akt信号通路、甲状腺激素信号通路、磷脂酶D信号通路、Fc εRI信号通路和细胞周期等。卵形鲳鲹卵巢转录组（59554条Unigenes）中共存在30133个SSRs和82490个SNPs。【结论】GnRHR、FSHR、FSHβ、CYP11A、SIRT3和PEG3等差异表达基因及PI3K-Akt信号通路和VEGF信号通路等与卵形鲳鲹卵巢的发育密切相关,共同调节卵巢的发育与成熟,在卵巢性成熟过程中发挥重要作用。     

酸雨胁迫下琯溪蜜柚叶片转录组差异表达分析

【目的】研究琯溪蜜柚受酸雨胁迫的内在分子机制,为琯溪蜜柚科学种植提供基础资料,也为酸雨逆境生理提供理论基础。【方法】以模拟酸雨胁迫24 h的琯溪蜜柚叶片进行Illumina HiSeq TM 4000高通量转录组测序分析,将组装得到的基因在参考基因组、Nr和KEGG数据库进行比对;利用FDR与log2(FC)来筛选差异基因,筛选条件为FDR0.05且|log2(FC)|1,将筛选的差异基因做GO和KEGG富集分析。【结果】模拟酸雨喷淋24 h后,琯溪蜜柚嫩叶出现明显块状伤斑;共得到21 497个基因,全部得到注释,与对照相比,酸雨处理组中有879个基因显著上调,588个基因显著下调;筛选出样本中前50个DEGs(差异基因),均为上调表达基因,大部分涉及代谢途径、次生代谢、苯丙基类丙烷生物合成和萜类物质合成等相关基因。GO富集分析表明差异表达基因主要位于细胞外区域;执行分子功能中催化剂活性是最为显著富集的GO term,其次是氧化还原酶活性;生物过程中差异表达基因最显著的GO term是DNA代谢过程。KEGG富集分析表明DNA复制是差异表达基因中最显著富集的Pathway,其次是次生代谢的生物合成,再次是苯丙素类合成途径。对次生代谢合成途径中4个差异表达基因[POD同工酶cg3g018770和cg2g001440、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)同工酶cg1g021310、4-香豆酸-辅酶a连接酶(4CL)同工酶cg3g029290]进行PCR荧光定量分析,验证了转录组数据的可靠性。【结论】琯溪蜜柚对酸雨耐性较强,对酸雨胁迫的响应是多基因参与、多生物过程协同调控的过程,次生代谢的调节可能是应对酸雨胁迫的主要方式。     

基于iTRAQ技术的桉树对桉树枝瘿姬小蜂抗性蛋白质组学分析

为了利用iTRAQ技术研究受桉树枝瘿姬小蜂危害后桉树叶片的差异蛋白,选择被姬小蜂危害后第24 h的桉树叶,采用iTRAQ定量蛋白质组学技术开展研究,在uniprot_Quercus中共鉴定到蛋白质1 687个。按照表达倍数变化1.2倍以上(上调大于1.2倍或者下调小于0.83倍)且P<0.05的标准筛选差异表达蛋白质。其中,C_vs_T组的上调差异表达蛋白质有110个,下调差异表达蛋白质92个。经过KEGG富集分析,筛选出的差异表达蛋白质富集于苯丙烷生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、核糖体(ribosome)、单菌素生物合成(monobactam biosynthesis)、有机含硒化合物代谢(selenocompound metabolism)、丙酮酸盐代谢(pyruvate metabolism)、脂肪酸延长代谢(fatty acid elongation)、丙酸代谢(propanoate metabolism)7条通路。     

抗氟苯虫酰胺小菜蛾差异表达基因及其通路

【目的】随着氟苯虫酰胺等双酰胺类杀虫剂的广泛应用,小菜蛾（Plutella xylostella）对该类药剂的抗性愈发突出。研究旨在从转录组水平研究小菜蛾对氟苯虫酰胺的抗性机制,明确小菜蛾对氟苯虫酰胺产生抗性的关键基因及通路,为揭示小菜蛾对氟苯虫酰胺的抗性机制打下基础。【方法】以室内筛选的小菜蛾抗氟苯虫酰胺品系（Rh28）、田间抗性种群（Rz36）和敏感品系（S）为材料,通过转录组测序技术（RNA-Seq）,获得抗性小菜蛾品系/种群在转录水平上的差异表达基因及抗性显著上调表达基因,采用基因本体（GO）显著性富集分析及京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）富集分析,确定差异表达基因具有的主要生物学功能及其参与的主要生化代谢和信号转导途径。【结果】通过将不同抗性品系/种群与敏感品系的RNA-Seq数据对比,获得数量不等的差异表达基因。将差异基因富集的生物学过程（biological process）和信号通路（pathway）进行GO分析,发现其主要集中于对刺激物的反应（response to stimulus）、催化活性（catalytic activity）和代谢过程（metabolic process）等条目中;而KEGG分析发现,差异基因主要集中于代谢通路（metabolic pathway）中,基因数量占比最高,为17.84%。通过统计分析进一步获得了抗性显著上调表达基因,并对其中218个基因开展了GO分析,其仍然主要集中在代谢过程、对刺激物的反应和生物调节（biological regulation）等条目中;通过对抗性显著上调基因进行KEGG分析,发现其仍主要集中在代谢通路中,其中谷胱甘肽-S-转移酶、细胞色素P450解毒酶及参与昆虫多种生理反应的热激蛋白（Hsp）超基因家族等基因的表达量均显著上调。通过聚类热图分析发现,显著表达上调的基因较多集中在内质网上蛋白质的加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、酪氨酸代谢（tyrosine metabolism）、咖啡因代谢（caffeine metabolism）和Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）中。【结论】获得了小菜蛾抗氟苯虫酰胺差异表达基因及抗性显著上调表达基因,其主要富集于代谢过程、应激反应及对刺激物的反应等条目中,这些基因的相互协同调控是小菜蛾对氟苯虫酰胺产生抗性的重要机制。     

腾冲红花油茶蜜腺2个发育时期转录组差异性分析

【目的】植物蜜腺基因能够调控其分泌产物花蜜中的化学组成,从而影响植物对传粉者的吸引力,本研究主要揭示腾冲红花油茶蜜腺发育与分泌过程中其基因表达的变化情况。【方法】采用高通量Illumina Hiseq测序手段对花蕾期蜜腺与泌蜜高峰期蜜腺进行转录组测序,并对测序数据进行相关分析研究,探讨蜜腺发育与分泌过程中的调控基因。【结果】在蜜腺发育与分泌过程中共检测到58 488个差异基因,其中表达上调的基因有1 602个,表达下调的基因有693个。GO分析结果表明:被注释生物学过程的差异表达基因有3 096个,其中富集差异基因数量较多的生物学过程为胞内过程、生物调节过程和新陈代谢过程;富集于分子功能的差异表达基因有1 280个,其中富集差异基因数量较多的分子功能为连接功能、催化活性和载体活性。Pathway显著性富集分析发现:有2 147个差异表达基因参与了292条代谢途径,其中富集差异基因数量最多的途径是代谢途径(941个,占43.83%),主要是参与糖代谢、氨基酸代谢等过程。【结论】蜜腺发育及花蜜分泌过程中大多数差异表达基因与花蜜化学组成的调控过程有关。     

海马齿根系响应盐胁迫的转录组分析

【目的】对盐胁迫下海马齿根系进行转录组测序分析,挖掘海马齿根系耐盐相关基因,为揭示海马齿耐盐的分子机制提供参考。【方法】利用Illumina测序技术对0 mmol/L NaCl （对照组）和400 mmol/L NaCl胁迫处理（盐胁迫处理组）下的海马齿根系进行转录组测序分析,从中筛选出差异表达基因,选取13个基因进行实时荧光定量PCR （qRTPCR）检测,以验证转录组数据的可靠性。【结果】在海马齿根系转录组中共鉴定出305145个转录本,平均长度为622 bp,其中,对照组有146177个长度>300 bp的转录本,盐胁迫处理组有72173个长度>300 bp的转录本;共有65535条Unigenes在Nr、GO、Swiss-Prot、COG和KEGG五大数据库注释成功,占Unigenes总数的52.36%。对照组和盐胁迫处理组共有65535个差异Unigenes,其中,有182个热休克蛋白基因。对照组和盐胁迫处理组间共有24042个差异表达基因,从中选取13个基因进行qRT-PCR检测,结果显示,9个基因表达上调,其余4个基因表达下调,与转录组测序结果一致。24042个差异表达基因中,共有10106个显著差异基因富集到129条代谢通路,其中富集程度排名前10的代谢途径为核糖体、次级代谢生物合成、RNA转运、内吞作用、剪接体、甘油磷脂代谢、内质网加工、吞噬、醚脂类代谢和植物-病原体相互作用,参与盐胁迫相关的硫代谢、脯氨酸积累、活性氧（ROS）代谢、与盐胁迫相关的钙信号通路和过氧化氢代谢等途径的差异基因上调。【结论】在盐胁迫下海马齿差异表达基因如小分子量热激蛋白基因、抗氧化酶相关基因及与离子交换相关基因发挥了重要调控作用。     

甘蔗鞭黑粉菌致病力差异菌株转录组分析

为探明甘蔗鞭黑粉菌不同致病力菌株在转录水平的差异,挖掘致病相关基因,采用Illumina测序技术对2个不同致病力菌株Ss16(强致病力)和Ss47(弱致病力)构建cDNA文库,进行转录组测序,通过质控后对其进行生物信息学分析。结果显示:共获得8.31G(Ss16)和9.88G(Ss47)的分析数据(clean reads),Ss16和Ss47相比较共获得显著(P0.05)差异表达基因649个,其中上调基因299个,下调基因350个。差异性表达基因的GO注释及KEGG通路富集分析结果表明,KEGG通路多与物质的蛋白合成、运输和代谢相关,富集最显著的前几条通路分别为:淀粉和蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism)、ABC转运蛋白(ABC transporters)、芳香族化合物的降解(degradation of aromatic compounds)、代谢途径(metabolic pathways)和嘌呤代谢(purine metabolism)。     

基于转录组测序挖掘小麦叶片抗旱相关基因

【目的】通过转录组测序分析干旱胁迫的小麦,以期挖掘小麦响应干旱胁迫的关键基因。 【方法】采用高通量 Illumina Hiseq 2500 测序平台对郑麦 366 号正常生长与自然干旱处理进行测序,并对测序数 据进行分析,筛选响应干旱胁迫的关键基因。【结果】两组样品中分别获得 45 471 018、45 133 470 个 clean read 片段,包含 6.82 Gb、6.39 Gb 碱基信息,拼接组装后,得到 188 334 个转录本和 119 588 个 Unigenes。通过筛选 共获得 1 207 个 DEGs,其中 752 个上调,455 个下调。GO 功能富集分析显示,上调的 DEGs 主要富集在水解酶 活性、催化活性、代谢过程、甘油代谢过程、膜和细胞部分等;下调的 DEGs 富集在细胞器、细胞和氧化还原 酶活性的最多。KEGG 途径富集分析发现,DEGs 显著富集于淀粉和蔗糖代谢、卟啉和叶绿素代谢、光合作用 - 天线蛋白、光合作用、苯丙烷生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、甘油磷脂代谢、氨基酸代谢和光合生物中的碳 固定等代谢通路。5 个抗氧化酶基因的 qRT-PCR 结果与 RNA-Seq 测序结果变化趋势相一致。【结论】利用转录 组测序技术获得了大量小麦抗旱相关基因,为深入研究小麦响应干旱胁迫的分子机制提供更多的基因遗传资源。     

不同光照处理甘蓝型油菜幼苗花青素合成的转录组和代谢组分析

【目的】筛选在不同光照下甘蓝型油菜幼苗的差异表达基因和差异代谢物,为花青素合成机理的研究奠定基础。【方法】以甘蓝型油菜自交系GLH4为研究材料,选取优质种子种植于花盆,在人工气候箱中以300 μmol/(m²· s）光照培养至2叶1心期后,进行强光700 μmol/(m²·s)和弱光300 μmol/(m²· s）处理,取0,24,48,72和96 h油菜幼苗进行表型观察;分别取不同光照处理96 h油菜的第1片真叶,利用高通量测序技术获得GLH4在不同光照下的转录组数据,随后利用生物信息学方法进行差异基因KEGG分析,筛选不同光照处理油菜幼苗差异表达基因,并用RT-qPCR技术进行验证;用超高效液相色谱和串联质谱和Analyst 1.6.3软件进行油菜幼苗代谢组数据的处理,对代谢物进行定性定量分析,筛选不同光照处理的差异代谢物。【结果】对0,24,48,72和96 h油菜幼苗的表型观察发现,强光处理油菜幼苗茎、叶颜色变紫,且随诱导时间延长,颜色逐渐变深。转录组KEGG分析共找到9 840个差异表达基因,且参与光照调控的差异基因显著富集到了20条通路中,其中代谢途径的差异表达基因最多（1 751个）,其次为次生代谢途径的差异表达基因（986个）。代谢组分析共检测出248个差异代谢物,其中类黄酮差异代谢物最多（81个）。类黄酮代谢物中包括7种花青素苷,其中花翠素、花翠素 3-O-葡萄糖苷、矢车菊素和牵牛花色素3-O-葡萄糖的表达量达到极显著水平。类黄酮代谢途径的差异表达基因和差异代谢物的表达量均达到了极显著水平;表达量居前的8个差异表达基因的RT-qPCR结果与转录组分析结果一致。【结论】强光诱导油菜器官和组织颜色的变化与花青素积累及相关基因的表达变化有关。     

红橘响应褐斑病菌侵染的转录组学分析

【目的】 明确红橘（Citrus reticulata Blanco, cv. Hongjv）接种褐斑病致病菌——链格孢菌橘致病型（Alternaria alternata tangerine pathotype）后基因种类和表达量在转录水平的变化规律,确定红橘响应该致病型侵染的关键基因。【方法】 采用链格孢菌橘致病型接种红橘离体叶片,28 h后选取感病叶片和未接种叶片提取RNA,进行转录组高通量测序,然后利用生物信息学分析,以甜橙基因组为参考,以|log₂ fold change|≥1,q-value≤0.01为阈值选取感病和健康红橘叶片转录组的差异表达基因,应用GO数据库对差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）进行功能分类,KEGG分析代谢途径,MapMan软件分析生物胁迫信号通路相关基因的表达变化。采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。【结果】 红橘接种链格孢菌橘致病型28 h后产生大量与胁迫相关的差异表达基因,获得上调差异基因5 173个,下调差异基因6 555个。GO功能分类显示差异基因主要与蛋白结合、膜、氧化还原过程等相关。通过KEGG富集和MapMan软件分析发现,红橘在受链格孢菌橘致病型胁迫的过程中基础代谢被严重破坏。乙烯、水杨酸和生长素等寄主防御相关的植物激素信号转导途径多个基因表达出现差异,其中乙烯起主导作用,乙烯受体ETR 3个成员被不同程度激活,下游激酶和乙烯响应因子均上调,生长素大部分关键信号基因、绝大部分生长素响应因子ARF和水杨酸合成途径的基因均下调表达。同时,黄酮醇、花青素、萜类化合物和生物碱合成相关基因受该菌诱导显著变化,萜类合成中大部分基因下调,而黄酮类合成相关上调基因数量和表达趋势均强于表达下调基因,有抗虫和抑菌作用的硫代葡萄糖苷基因呈上调趋势。进一步研究发现,大量参与抗逆过程的转录因子如WRKY、bZIP、ERF、MYB、NAC被诱导激活,其中大部分WRKY和bZIP转录因子受该菌正向调控,超过50%的ERF家族基因表达上调;在转录因子调控下,PTI及ETI响应基因如受体激酶、R蛋白、NBS抗病蛋白等大量表达,多个PR家族抗菌蛋白基因上调表达,22个抗氧化保护酶系统POD成员基因受到活性氧信号激发大量表达。以上结果表明链格孢菌橘致病型侵染对寄主内部生理状态产生显著影响。选取了19个与植物抗病相关基因进行qRT-PCR分析,其基因表达趋势与测序数据一致。【结论】 获得了红橘响应链格孢菌橘致病型侵染的差异表达基因及显著上调表达基因,其主要富集于代谢过程、应激反应及转录调控等条目中,这些基因的相互协同调控是红橘对该致病型产生防御反应的重要机制。     

凡纳滨对虾转录组测序分析及肌肉生长发育相关基因的筛选

【目的】筛选出凡纳滨对虾生长发育的功能基因及代谢调控网络,揭示其生长发育的分子机制,为后续开展凡纳滨对虾分子生物学研究提供宝贵的基因数据来源。【方法】以快速生长群体和慢速生长群体的凡纳滨对虾肌肉组织为研究材料,通过Illumina HiSeqTM2500平台对构建的cDNA文库进行高通量测序分析,以StringTie进行拼接组装后利用DESeq2筛选差异表达基因,并基于KOG、GO、nr、COG、Swiss-Pro、KEGG和Pfam等数据库进行差异表达基因功能注释分析。【结果】经拼接组装共获得53458844条Clean reads,各样品Clean reads的Q30均在93.00%以上;Illumina测序获得的Clean reads与参考基因组的比对效率在87.75%~87.80%,说明转录组测序数据真实可靠。采用SnpEff进行SNP/InDel变异注释分析,结果显示,SNP位点中以A>G、G>A、C>T和T>C等4种类型的数量较多（14950~21562个）,InDel位点则以SYNONYMOUS_CODING的数量最多（33630个）。使用StringTie对Mapped reads（比对到参考基因组的Reads）进行拼接,共发掘到4607个新基因,分别输入COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG和nr数据库中进行序列比对,最终发现共有1098个新基因被注释,以被nr数据库注释的新基因数量最多（1077个）,而被COG数据库注释的新基因数量最少（416个）。基于Q-value<0.05且Fold Change>2的筛选条件,共获得1408个差异表达基因（661个为显著上调表达基因,747个为显著下调表达基因）;1408个差异表达基因被注释到53个GO功能条目中,其中,22条被注释到生物学过程（Biological process）,16条被注释到细胞组分（Cellular component）,15条被注释到分子功能（Molecular function）;KEGG信号通路富集分析发现3条重要的信号通路,分别是溶酶体通路（Lysosome）、氨基糖和核苷酸糖新陈代谢（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism）及鞘脂类代谢（Sphingolipid metabolism）。在溶酶体通路中,CTSL基因、Nramp基因、MyoG基因和Myf5基因在凡纳滨对虾快速生长群体肌肉组织中呈上调表达,而Trypsin基因呈下调表达。【结论】通过转录组测序分析从快速生长群体和慢速生长群体的凡纳滨对虾肌肉组织中筛选出1408个差异表达基因（661个为显著上调表达基因,747个为显著下调表达基因）,主要富集在溶酶体、氨基糖和核苷酸糖新陈代谢及鞘脂类代谢等通路上,在对虾肌肉生长发育过程中发挥重要作用。     

不同繁殖力绵羊睾丸组织新转录本注释及功能解析

【目的】完善和优化绵羊（Ovis aries）基因组注释信息,解析绵羊睾丸组织在不同繁殖力水平的遗传机理。【方法】以高繁殖力绵羊品种湖羊和低繁殖力绵羊品种藏绵羊（各3只）为研究对象,采集其睾丸组织,提取RNA,构建cDNA 文库,进行RNA-Seq测序,对测序数据进行组装。利用Cuffcompare软件对重新组装的测序数据与绵羊参考基因组进行比对分析,优化已注释基因的结构,并挖掘新转录本,对新转录本进行GO和KEGG通路分析。使用DESeq软件挖掘差异表达新转录本,对其进行GO和KEGG通路分析。随机选取表达显著上调和下调的新转录本各5个,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）对其表达水平进行验证。【结果】对6只供试羊构建了6个独立的cDNA文库,共获得266 009 566个原始读段,质量控制后得到133 004 783个过滤后读段;6个cDNA文库过滤后读段的GC含量在49.61%～51.14%,符合碱基组成规律,Q30比例≥92.96%。对4 273个已注释基因的结构进行了优化,其中5′非翻译区域（UTR）延伸基因2 027个,3′ UTR延伸基因1 907个,5′和3′ UTR同时延伸基因339个。挖掘到12 178个新转录本,GO功能分析显示,2 416个新转录本注释到生物学过程、细胞组成和分子功能;KEGG富集发现新转录本显著富集在单纯疱疹病毒Ⅰ型感染、过氧物酶体、河马信号通路。与湖羊相比,藏绵羊睾丸组织中有155个新转录本表达差异显著,其中103个表达上调,52个表达下调;GO功能分析显示,差异新转录本富集在细胞过程、膜部分、绑定等条目;KEGG富集发现差异新转录本显著富集在钙信号通路和核因子-κB炎症信号通路等。10个差异表达新转录本的RT-qPCR验证试验结果与RNA-Seq结果趋势一致。【结论】从湖羊和藏绵羊睾丸组织中共挖掘出12 178个新转录本,其中155个差异表达。这些新转录本主要通过参与细胞功能、生物调节和代谢途径,以及通过核因子-κB炎症信号和钙信号通路广泛参与调控生殖细胞的增殖与分化、睾酮的分泌、免疫应答、Ca²⁺跨膜转运等途径,进而调控绵羊睾丸的发育和精子的发生。     

基于转录组测序番茄抗南方根结线虫相关基因的挖掘

【目的】筛选番茄抗南方根结线虫侵染相关基因,为其克隆及番茄抗病育种提供参考依据。【方法】用Illumina HiSeq~(TM)4000对南方根结线虫侵染和未侵染番茄抗性材料F5样本的转录组进行测序,基于差异表达基因本位数据库(GO)和Pathway显著性富集(KEGG)分析,挖掘参与抗南方根结线虫的相关基因。【结果】筛选到1116个差异表达基因,其中731个为上调基因,385个为下调基因,其功能归类于生物过程、细胞组分和分子功能三大类1830个条目,富集于94条KEGG代谢通路。差异表达基因的GO和KEGG分析结果表明,植物与病原互作相关的22个基因差异表达,其中18个抗性相关基因上调表达,上调表达明显的抗性基因包括12个Ca~+-CaM/CML信号相关基因(11个类钙调蛋白、1个钙调蛋白)、3个WRKY转录因子和1个环核甘酸门控离子通道蛋白。【结论】Ca~+-CaM/CML信号、WRKY转录因子和环核甘酸门控离子通道是番茄抗性材料F5对南方根结线虫抗性反应的重要机制,可作为深入探索根结线虫与番茄互作及挖掘番茄关键抗性相关基因的参考依据。     

5-氮杂胞苷对苦瓜果实成熟及转录表达谱的影响

【目的】研究5-氮杂胞苷（5-azaC）对苦瓜果实成熟和基因表达模式的影响,为解析苦瓜果实成熟的分子调控机制提供理论依据。【方法】以苦瓜（Momordica charantia L.）高世代自交系E12201-e1为材料,利用50 mmol/L 5-azaC处理绿熟期（授粉后18 d）苦瓜果实,以ddH₂O处理为对照,观察处理组（TR）和对照组（CK）果实的表型变化,并利用RNA-seq技术比较TR和CK苦瓜果肉组织中的转录水平差异。【结果】50 mmol/L 5-azaC处理能明显延迟苦瓜果实成熟。RNA-seq获得的数据质量较高,可满足后续分析需求。通过筛选共获得1 773个差异表达基因（DEGs）,其中1 007个上调基因,766个下调基因。GO和KEGG分析结果表明,DEGs主要富集在细胞组分和分子功能模块,217个DEGs共富集到93条代谢通路中,其中30个DEGs显著富集到光合作用和苯丙烷类生物合成通路。8个DEGs参与细胞壁代谢过程,其中6个基因在5-azaC处理中下调表达。共获得681个差异表达转录因子（TFs）,分属于220个TF家族。12个DEGs的qRT-PCR结果与RNA-seq结果变化趋势一致。【结论】5-azaC处理抑制苦瓜果实成熟,并影响果实成熟相关基因的表达模式。