鸡β-防御素及其真核表达载体构建分析

本文介绍鸡β-防御素和研究现状,并对其真核表达栽体构建的可行性进行了可行性分析.     

防御素基因克隆和表达载体构建

人防御素(HNP)是一类广谱抗菌阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对于细菌、真菌乃至某些被膜病毒有广谱杀伤作用,是免疫系统中的重要组分。实验根据已发表的HNP-1cDNA序列,设计并合成了一对引物。以HL-60细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的片段并克隆到pUC18载体上,经筛选获得阳性重组子pUC18-HNP-1(pDFS1)。测序分析证实,扩增片段即为HNP-1cDNA。pDFS1再经SmaI与SalI酶切、插入pGEX-6p-1质粒构建HNP-1表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子最终获得pGEX-6p-1-HNP-1(pDFS2)重组质粒。     

猪β防御素3表达载体的构建及其 在大肠杆菌中的表达

根据Gen Bank上发表的猪β防御素3(p BD3)基因的序列,通过生物学软件预测其成熟肽序列。提取猪舌组织RNA,设计引物,通过PCR的方法扩增得到约150 bp的p BD3成熟肽基因序列,构建其原核表达载体p ETp BD3,并获得工程菌株BL21-pET-p BD3。IPTG诱导表达后,比对照多表达了1条约16 k D的蛋白条带,通过免疫蛋白印记说明所表达的蛋白为带有His·Tag的融合蛋白,证明p BD3成功表达。     

miR-15a真核表达载体的构建及鉴定

根据miR-15a成熟体序列合成1对miRNA寡聚单链DNA,克隆到真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-15a真核表达载体。瞬时转染肺腺癌A549细胞后,经Real-time PCR证明pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-15a能有效表达miR-15a。试验结果为进一步研究miR-15a的功能和靶基因鉴定打下了基础。     

三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。     

MDR1真核表达载体的构建及鉴定

采用PCR技术扩增MDR1基因全长序列及胞外区约1kb片段,并定向克隆到pcDNA3质粒载体CMV启动子序列下游的Bam HⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切位点之间重组体经转化E．coli JM109后可大量扩增,提取该重组体进行限制性内切酶分析,得到预期的目的片段,并且以重组体为模板,用特异性引物可扩增出MDR1基因的1kb片段?     

牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从11月龄的牛脑垂体组织中扩增出BGH基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-BGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,结果表明,成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体。     

牛IL-18真核表达载体的构建及其对FMD疫苗的免疫增强作用

【目的】探讨牛IL-18(BoIL-18)对口蹄疫(FMD)灭活疫苗的免疫增强作用。【方法】PCR扩增BoIL-18蛋白基因片段,将其定向克隆至pcDNA3.1载体中,构建牛IL-18真核表达质粒pcDNA3.1-BoIL18。将pcDNA3.1-BoIL18与FMD灭活疫苗联合免疫小白鼠,同时设空载体和单纯接种FMD灭活苗组为对照,通过对口蹄疫抗体效价的检测、T淋巴细胞转化试验及NK细胞活性检测试验,研究BoIL18对FMD灭活疫苗的免疫增强作用。【结果】同时接种FMD灭活疫苗和IL-18真核表达质粒的小白鼠T淋巴细胞转化率和NK细胞活性,从接种第21天开始均明显高于单纯FMD灭活苗接种组(P<0.05),所产生的中和抗体效价从第28天开始与单纯接种FMD灭活疫苗组差异显著(P<0.05);空载体组与单纯FMD灭活疫苗组上述3项指标间无显著差异。【结论】牛IL-18真核表达质粒在小白鼠体内得到了良好表达,且表达产物对FMD灭活疫苗的免疫效果具有明显的增强作用。     

耐碱Mn-SOD基因克隆与真核表达载体的构建

以高产耐碱Mn-SOD产生菌Bacillussp.110-2总DNA为模板,通过PCR扩增得到耐碱Mn-SOD基因,编码一个完整的开放阅读框,共202个氨基酸,含18个碱性氨基酸,包括12个赖氨酸和6个精氨酸。与地衣芽孢杆菌同源性为99%,与极端耐碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)同源性为78.7%。克隆片段酶切后,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,获得毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-SOD。     

牛18ku-bFGF基因真核表达载体构建与鉴定

将牛18ku-bFGF基因全编码序列插入质粒pEGFP-N1中,构建真核表达载体pCMV-bFGF,并用菌落PCR、酶切和测序等方法对重组质粒进行了鉴定.研究结果表明,检测结果均一致于预期,表明牛18ku-bFGF基因全编码序列已正确插入到载体中.     

抗菌肽Defensin基因pcr3.1真核表达载体的构建

通过克隆果蝇的defensin基因,构建了defeBSin基因的哺乳动物细胞真核表达栽体.把黑腹果蝇基因组DNA通过PCR获得defensin,克隆载体pMD18-T/defeBSin,并将其转化到大肠杆菌里.最后进行抗菌肽基因重组真核表达载体pcr3.1/defensin的构建和鉴定.结果表明,以果蝇总DNA为模板扩增出280bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除一个碱基外,其余的完全一致,译成的氨基酸序列相同.对重组质粒pcr3.1/defensin进行双酶切鉴定并测序.结果也完全一致.所以,重组质粒per3.1/defensin由真核载体pcr3.1和defensin DNA片段组成.且插入的defensin DNA片段与已知序列完全相同.     

杂合抗菌肽基因的设计及表达载体的构建

为高效表达具有高抗菌活性的抗菌肽,根据Magainin 2(MA)、Sapecin(SA)和Melittin (ME)基因核心序列,设计杂合抗茵肽MA-SA-ME(MSM)基因并进行密码子优化.生物信息学分析显示,该抗茵肽具有很好的抗茵作用.将MSM基因与毕赤酵母表达载体pPICZQ-A连接,构建重组表达载体pPICZ...     

抗菌肽Fa-AMP基因的克隆及其原核表达载体的构建

为研究抗菌肽Fa-AMP的高效制备方法.采用大肠杆菌偏嗜性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列,通过重叠区扩增基因拼接法合成目的基因,并将其连接到表达载体pET-47b上,转化获得其BL21(DE3)pLysS工程菌,经PCR和测序鉴定,表明重组表达载体构建成功,这为体外生物活性检测与开发提供了参考.     

抗菌肽Fa-AMP基因的克隆及其原核表达载体的构建

为研究抗菌肽Fa-AMP的高效制备方法。采用大肠杆菌偏嗜性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列,通过重叠区扩增基因拼接法合成目的基因,并将其连接到表达载体pET-47b上,转化获得其BL21(DE3)pLysS工程菌,经PCR和测序鉴定,表明重组表达载体构建成功,这为体外生物活性检测与开发提供了参考。     

牛Nanog基因真核表达载体构建及有效干扰序列筛选

 【目的】构建牛Nanog基因的真核表达载体pVenus-Nanog,筛选对其有效的干扰序列。【方法】以含有牛Nanog基因的PMD-18T-Nanog重组质粒为模板,经PCR扩增目的片段,将其克隆到真核表达载体pVenus上,酶切及测序鉴定正确后命名为pVenus-Nanog。将pVenus-Nanog用脂质体瞬时转染牛皮肤成纤维细胞,用荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting分别检测Nanog的表达情况。针对牛Nanog基因的CDS区设计并合成3对干扰序列,分别命名为S1、S2、S3及阴性对照N.C.,用脂质体共转染pVenus-Nanog和siRNA于成纤维细胞,用半定量RT-PCR分析干扰效率。【结果】酶切分析与测序结果表明重组载体pVenus-Nanog构建成功,荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting结果显示其能够在牛成纤维细胞中高效表达。脂质体共转染pVenus-Nanog和siRNA后,半定量RT- PCR结果显示S1效果最好,干扰效率达75%,S2和S3分别为20%和70%。【结论】成功构建了牛Nanog真核表达载体pVenus-Nanog,且获高效表达。通过脂质体共转染法筛选出了牛Nanog基因的有效干扰序列,为研究该基因在胚胎干细胞及早期胚胎中维持多能性调控网络中的作用机制奠定了基础。     

pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定

[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。     

靶向Annexin A3短发夹环RNA干扰载体的构建及鉴定

[目的]利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术构建和鉴定膜联蛋白A3(Annexin A3)的真核表达载体,为进一步研究Annexin A3在肝细胞中的功能奠定基础。[方法]人工合成3对shRNA序列,退火后定向克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo上,采用酶切和测序法鉴定。[结果]质粒酶切及测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致。[结论]成功构建膜联蛋白A3靶向的真核表达载体。