谷子黄叶色突变体ylm-1的精细定位与功能分析

谷子叶色突变体在研究C₄光能利用效率和叶绿素代谢机制方面具有重要作用。为探究谷子叶色突变的分子机制,利用甲基磺酸乙酯（EMS）处理谷子品种豫谷1号,获得1个稳定遗传的黄叶色突变体ylm-1。通过表型和遗传分析及遗传背景检测,同时利用突变位点图谱（MutMap）技术对突变基因进行精细定位。结果表明,ylm-1整个生育期叶色均为淡黄色;ylm-1与野生型遗传背景相同且受1对隐性核基因控制;MutMap精细定位到第9号染色体关联区间内共13个非同义突变基因,其中,Seita.9G249900是一个编码与红叶绿素代谢还原酶（RCCR）相关的基因,该基因位于第9号染色体19 937 988与19 940 620bp之间,含有2个外显子和1个内含子,在第2外显子361bp处发生A/T碱基突变,导致1个谷氨酸（E）变成天冬氨酸（D）。根据突变碱基设计了dCAPS标记,进一步验证了ylm-1候选基因突变位点。黄叶色突变体ylm-1的鉴定与基因功能分析将为该基因的有效利用、功能验证及作用机制研究奠定理论与技术基础。     

水稻白条纹叶Gws基因的精细定位与遗传分析

叶色突变是一类十分明显的性状突变,在高等植物的叶绿素合成、叶绿体结构、功能、遗传、分化与发育等基础研究中均具有重要意义。到目前为止,已鉴定多个重要的水稻功能基因,据不完全统计,水稻中至少已定位了79个叶色突变位点,并已成功克隆出多个叶色相关基因,其中OsCHLH、OsCAO1、OsCAO2、chlorina1、chlorina9、ygl等直接参与编码叶绿素合成,其余基因均参与叶绿体发育调控。在日本晴(Nipponbare)T-DNA插入突变体库中筛选到一份对温度敏感的白条纹突变体gws(green-white-stripe),遗传分析表明它来自组织培养过程中的单隐性基因突变。利用gws与培矮64杂交组合的F2代群体,将Gws精细定位于第6染色体标记InDel15和InDel16之间,物理距离为73kb,此区间内包含13个基因。基因组序列分析发现,突变体在核糖核苷二磷酸还原酶小亚基(ribonucleoside-diphosphate reductase small chain,RNRS1)编码区第314～315碱基发生缺失,第316～317碱基由GC变为TT,导致该基因阅读框移码突变,蛋白质翻译提前终止。该基因是已经报道的水稻白条纹叶基因St1(Stripe1)的等位基因,gws突变体较st1突变体的白条纹出现早且明显,gws白条纹表型出现在第2片叶之后,而st1的白条纹表型仅出现在第4或5片叶之后。     

水稻白条纹叶突变体wsl1的遗传分析及基因精细定位

从粳稻日本晴和籼稻R1128杂交衍生的重组自交系群体中获得一个稳定遗传的白条纹叶突变体wsl1(white stripe leaf 1),世代为F10。与亲本R1128相比,突变体wsl1表现出白条纹叶,同时叶脉呈现白化,该性状在苗期就出现并持续整个生育期;突变体的株高、每穗总粒数、剑叶长、生育期显著增加,而结实率显著下降,其他农艺性状没有显著变化。分蘖期突变体wsl1的叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素含量较杂交亲本R1128显著下降;透射电镜观察表明,与野生型相比,突变体的叶绿体形状异常,不规则。遗传分析表明,该突变性状由1对隐性核基因控制。精细定位后发现,目标基因WSL1位于第1染色体短臂上标记M1-54与标记M1-70之间,两者相距89.7 kb。生物信息学分析表明候选区间内共有8个开放阅读框,暂未发现已报道的叶色相关基因;其中LOC_Os01g02080编码肽基脯氨酰顺反异构酶, GO (Gene Ontology)分类显示其可能与类囊体形成有关,后续将通过比较测序、qRT-PCR等分子实验来确定候选基因。     

水稻ygl98黄绿叶突变基因的精细定位与遗传分析

通过EMS诱变获得一份遗传稳定的水稻黄绿叶突变体ygl98,该突变体整个生育期呈黄绿色。与野生型相比,突变体的叶绿素和类胡萝卜素含量分别下降45.3%和45.6%,有效穗数和结实率分别减少14.4%和10.7%,株高降低7.4%。透射电镜观察表明,ygl98突变体的叶绿体形状不规则,叶绿体中有许多空的囊泡状结构,类囊体数目减少,每个基粒仅由少数几个类囊体垛叠而成。遗传分析表明,ygl98的突变性状由1对隐性核基因控制。利用(ygl98/浙辐802) F₂作为定位群体,将突变基因定位在第3染色体长臂InDel标记I3和I4之间,遗传距离分别为0.07 cM和0.19 cM,两标记之间的物理距离约为44.2 kb,此区间内包含8个预测基因。基因组序列分析发现,ygl98突变体在编码镁离子螯合酶ChlD亚基的OsChlD基因编码区第1 522碱基处(位于第10外显子),碱基G突变为碱基A,从而造成编码蛋白序列第508位的丙氨酸(Ala)突变成苏氨酸(Thr)。该基因是已报道的水稻黄绿叶基因Chlorina-1的等位基因,但突变体表型有明显区别,Chlorina-1突变体在2~3周龄幼苗时开始出现黄绿叶,且该黄绿叶性状仅在苗期表现,而ygl98突变体整个生育期都表现为黄绿叶,这可能是OsChlD基因组序列的突变位点不同造成的。     

水稻ygl80黄绿叶突变体的遗传分析与目标基因精细定位

通过化学诱变获得遗传稳定的水稻黄绿叶突变体ygl80。与野生型亲本10079相比,ygl80突变体在苗期和孕穗期叶片叶绿素分别下降76.64%和54.59%,类胡萝卜素含量分别下降53.85%和41.18%,成熟期株高、每株有效穗数、每穗着粒数、穗长和千粒重分别减少14.8%、16.5%、21.3%、9.1%和7.4%。遗传分析表明,ygl80的突变性状由1对隐性核基因控制。利用(ygl80/浙辐802) F₂作为定位群体, 将突变基因定位在第5染色体长臂InDel标记C2和C3之间,遗传距离分别为0.24 cM 和0.39 cM,两标记之间的物理距离约为90 kb,此区间内包含11个预测基因。基因组序列分析发现,ygl80突变体在编码叶绿素合酶的YGL1(LOC_Os05g28200)基因编码区第5027碱基处(位于第14外显子),碱基C突变为碱基T,使编码蛋白序列第348位的脯氨酸(Pro)突变成亮氨酸(Leu)。该基因是已报道的水稻ygl1黄绿叶突变基因的等位基因。ygl80突变体在整个生育期都表现为黄绿叶,而ygl1突变体在苗期叶片黄化,中期慢慢转绿,后期叶色以及总叶绿素和类胡萝卜素的含量接近野生型,这可能是YGL1基因编码的叶绿素合酶蛋白的氨基酸不同突变位点造成的。     

谷子6号染色体雄性不育基因的克隆

克隆谷子雄性不育材料1066A的不育基因,分析不育基因与可育基因存在的突变位点,为揭示谷子雄性不育分子机制、利用分子标记辅助选择方法选育多用途的不育材料奠定基础。利用谷子全基因组测序数据及前人不育基因定位结果克隆谷子雄性不育材料1066A的雄性不育基因,发掘导致不育的突变位点,旨在为从分子水平揭示谷子不育机制、利用分子标记辅助选择方法选育多用途的不育材料奠定基础。首先利用生物信息学方法从豫谷1号6号染色体找到1个雄性不育基因位点(Si015780m.g),该基因全长5 027个碱基,编码479个氨基酸,且位于前人用分子标记定位的基因组区间内。根据豫谷1号不育基因序列设计2对特异引物在雄性不育材料1066A的基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产生的2个基因组片段进行拼接后在谷子不育材料1066A中获得2 561 bp的基因序列,包含了下游部分编码区。通过对豫谷1号、张谷、1066A的不育基因部分编码序列及推定的蛋白质序列进行比对分析,结果发现谷子不育材料1066A的不育基因编码序列存在3处突变:2处单碱基替换和1处单碱基插入,这3处突变导致谷子不育材料1066A的不育基因蛋白的第402,403个氨基酸由异亮氨酸和亮氨酸替换成缬氨酸和异亮氨酸,同时导致其不育基因编码的蛋白在第466个氨基酸处发生提前终止。3处突变中2处氨基酸替换对编码蛋白的功能影响不大,因此,认为谷子不育材料1066A的不育基因蛋白翻译提前终止可能是导致其产生不育的原因。     

谷子叶绿体基因RNA编辑位点的鉴定与分析

RNA编辑是高等植物叶绿体基因转录后加工修饰的现象,它会影响叶绿体发育,导致植株叶片出现黄化或白化等表型。本研究以长农35号及其2份叶色突变体(E752和E1005)为试验材料,利用紫外分光光度计测定了苗期叶绿素含量,通过透射电镜观察了叶绿体结构;利用在线工具Prep-Cp对谷子叶绿体基因RNA编辑位点进行了预测,通过PCR、RT-PCR及测序等方法对预测到的编辑位点进行了验证,并与其他单子叶作物的编辑位点进行了比较分析;进一步利用荧光实时定量方法,分析rpoB及依赖PEP转录的光合途径相关基因(ndhG、psaA、psbA和rbcL)在不同发育时期的表达水平;最后,利用生物信息学分析ropB编辑前后蛋白二级结构的变化。结果表明,与长农35号相比,2份叶色突变体叶绿素含量显著降低,叶绿体发育异常;在谷子中,有10个叶绿体基因共计20个位点发生RNA编辑,所有编辑位点均为胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的转换,不同基因的编辑位点存在数量差异,其中ndhB编辑位点数量最多,共计6个; 20个编辑位点中,有19个位点在物种进化上具有较高保守性,只有rpoC1-2753为谷子中特有的编辑位点;在长农...     

水稻早衰突变体esl-H5的表型鉴定与基因定位

在甲基磺酸乙酯(EMS)诱变粳稻淮稻5号的突变体库中,筛选到一个稳定遗传的叶片黄化早衰突变体esl-H5(early senescence leaf H5)。该突变体幼苗期表型正常,播种后50 d开始出现下部叶片黄化早衰表型。与野生型相比,esl-H5突变体抽穗期延迟,株高、穗长、穗粒数、有效分蘖数、千粒重等均显著降低,叶绿素含量显著减少。遗传分析表明该突变受一对隐性基因调控。分子标记定位结果显示,该突变基因定位于1号染色体。通过MutMap分析发现编码胼胝质合成酶基因Os01g0533000的最后一个外显子内有一个碱基G变成了A,这导致翻译提前终止。进化树分析结果显示, ESL-H5与拟南芥AtGSL7 (Glucan Synthase-Like 7)同源性最高。糖含量测定表明esl-H5突变体中可溶性糖和淀粉含量增高,推测ESL-H5功能缺失后影响了光合产物的转运,导致叶片中糖含量显著增高,进而引起叶片衰老。qRT-PCR结果显示, esl-H5突变体中抗病相关基因PR1a、PR1b、PR2、PR4、PR5和PR10表达量均高于野生型,这与突变体的白叶枯病抗性明显提高一致。上述研究...     

水稻中脉缺陷突变体dl-6的遗传分析与精细定位

为了克隆DL-6基因,以dl-6与9311配制正反杂交组合进行性状分析发现,dl-6突变性状受1对隐性核基因控制,利用SSR分子标记将控制dl-6性状的基因DL-6初步定位在水稻第3染色体的短臂上,进一步利用新发展的InDel标记将DL-6基因精细定位在I3-5和I3-8之间85 kb的物理距离内。对该区段内存在的开放阅读框( ORF)进行分析,发现其中ORF9编码的YABBY基因是一个与叶脉发育相关的基因,对突变体dl-6和野生型中YABBY基因进行测序,将测序结果与数据中日本晴序列进行比对发现,突变体dl-6中YABBY基因的第1个外显子存在1个单碱基突变,该突变导致野生型中编码的半胱氨酸突变为突变体中的精氨酸;同时突变体dl-6在YABBY基因的3′端还存在8个碱基的缺失。这2个突变位点哪个是导致dl-6突变的功能区目前还不确定,有待进一步研究。     

水稻白化转绿基因Gra3的精细定位及遗传分析

本研究鉴定到一份水稻苗期白化转绿突变体,该突变体在幼苗的2叶到4叶期会出现叶片边缘白化,4叶期后转绿,对突变体和野生型农艺性状比较研究表明,前期白化不会对植株生长发育及产量等相关性状产生影响;同时,对两者叶绿体超微结构对比分析发现,突变体叶绿体发育在白化期受到一定程度的抑制。通过构建F2分离群体,调查了部分F2单株表型,结果表明白化型和野生型单株符合1:3的孟德尔单基因分离比,遂将该基因命名为Gra3;利用分离群体分析法(bulked segregant analysis,BSA)和隐性群体分析法(recessive-class analysis,RCA)最终将Gra3定位于RM14436和RM14450之间,对应日本晴基因组片段125 kb。该性状可作为一个形态学标记应用于水稻生产。