芥蓝BoaBKI1基因的克隆及表达分析

[目的]克隆芥蓝中的BoaBKI1基因,进行生物信息学与表达分析.[方法]采用改良CTAB法提取芥蓝总RNA,并反转录为cDNA;设计引物,克隆BoaBKI1基因;使用生物信息学方法分析BoaBKI1基因序列;用半定量PCR进行BoaBKI1基因的时空表达分析.[结果]成功克隆到BoaBKI1基因,序列分析显示其开放阅...     

人促凋亡蛋白基因bax的克隆与原核表达

以人促凋亡蛋白基因bax全长转录本eDNA为模板,经PCR扩增得到bax基因,将其克隆到pMD18-T,并构建原核表达质粒栽体pGEX-4T-1-Bax,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达.PCR扩增、双酶切鉴定他测序结果均显示bax基因已被成功克隆到表达载体中,表这产物经SDS-PAGE检测,证实为GST-Bax融合蛋白.     

奶牛TNMD基因的克隆与原核表达

从奶牛组织中克隆Tenomodulin(TNMD)基因的cDNA序列,采用双酶切后连接表达载体pGEX-4T-1,转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达。结果表明,TNMD基因的序列全长为957 bp,通过双酶切构建的表达载体pGEX-TNMD在BL21大肠杆菌中成功表达了分子量为59.68 kDa的融合蛋白。     

曲霉来源植酸酶基因phyA的克隆及原核表达

在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染,具有广泛的应用前景。本试验以自行分离得到的黑曲霉菌株基因组DNA为模板,克隆得到植酸酶phyA基因,并将其连接到原核表达载体pET21b、pET30a上,利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建植酸酶大肠杆菌工程菌株。工程菌株在经诱导后可以产生大量的植酸酶蛋白。     

弓形虫MAPK1基因的克隆与原核表达

为获取具有生物学活性的弓形虫MAPK1蛋白,根据Gen Bank中编码MAPK1的已知序列设计并合成1对引物,用NCoⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到同样双酶切的原核表达载体PET-28a上,构建重组表达质粒PET-28a-MAPK1并转化至E.coli BL21感受态,用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明:表达质粒在E.coli BL21中得到表达,克隆的MAPK1基因与Gen Bank中收录的基因序列同源性为99.9%。对重组质粒进行酶切鉴定,获得1 599 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-MAPK1。Ni2+螯合柱纯化后蛋白浓度为0.26 mg/m L,可用作免疫原,经SDS-PAGE电泳显示PET-28a-MAPK1融合蛋白的分子量约为58 ku。Western blotting显示融合蛋白具有良好的抗原性。     

鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

人朊蛋白基因的克隆与原核表达

以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E．coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99．6％,推导的氨基酸序列同源性为99．8％,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E．coli BL21(DE3),在37℃下用1．0 mmol／L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20％～25％．用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物．Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别．因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原．     

新城疫病毒HN基因的克隆与原核表达

根据GenBank公布的标准Lasota株的HN基因序列,设计了一对引物,经RT-PCR从标准Lasota疫苗毒中特异性扩增出约1590bp的HN基因。将扩增得到的基因定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-NDV/HN,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组菌BL21(pET-NDV/HN)。将重组菌诱导表达后,通过SDS-PAGE分析可见约64.3kDa的特异条带,说明融合蛋白大小与预期理论值相符;Western blotting结果进一步表明表达的蛋白可与NDV阳性血清发生特异性结合,说明其具有良好的免疫原性。     

小鼠IL-10基因的克隆及其原核表达

从ConA活化的昆明小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到小鼠的IL-10基因.编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体pET-28a,构建IL-10基因的重组原核表达载体,在大肠杆菌(DE3)中诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE结果表明,该表达产物的分子量与预期值相符,Western blot结果说明小鼠IL-10基因得到了表达.     

毛白杨4CL-like基因的克隆与原核表达分析

为得到毛白杨4CL-like基因并对其原核表达特性进行分析,利用毛白杨叶片的总RNA反转录得到的总cDNA为模板,利用PCR技术克隆得到毛白杨4CL-like基因(登录号:XP_002315339.1).利用MEGA软件对4CL-like基因及其他9个来自不同物种的4CL基因进行进化树分析.最后通过构建pET30-4CL-like原核表达载体对该基因进行原核表达分析.结果显示,克隆得到的4CL-like基因CDS区全长为1 758 bp,编码585个氨基酸.系统进化分析表明,该基因与葡萄中的4CL-like5有很高的同源性.另外,SDS-PAGE分析表明,4CL-like基因在大肠杆菌BL21中成功表达,所表达融合蛋白的分子量约为60 ku.     

芥蓝(Brassica alboglabra)苯丙氨酸解氨酶基因BaPAL的克隆、表达与序列分析

根据NCBI数据库中拟南芥、甘蓝型油菜和菘蓝的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)基因序列设计简并引物,从芥蓝叶片cDNA中克隆到1个PAL基因,定名为BaPAL.BaPAL编码区全长2 145 bp,编码714个氨基酸,在NCBI的登录号为FJ849059.半定量RT-PCR结果表明,BaPAL基因在茎、叶、花蕾、开放花朵和嫩角果中均有表达,而且以开放花朵的表达量最大,根中未能检测到.BaPAL与其他植物PAL序列比对的结果表明:芥蓝与甘蓝型油菜、白菜的关系最为接近,与同科的菘蓝和拟南芥的关系稍远,但它们都处于同一进化分支;跟蕨类植物的同源性最低,亲缘关系最远.     

Monosomic Addition Lines of Flowering Chinese Cabbage (B. campestris L. ssp. chinensis var. parachinensis L. H. Bailey)-Chinese Kale (B. oleracea L. var. alboglabra L. H. Bailey)

Interspecific alien addition lines have played significant roles in gene mapping, intergenomic gene transfer and chromosomal homoeological identification between closely related species. Selection of alien addition lines was conducted by karyotype analysis and morphological observation with the reference of parents. Triploid interspecies hybrid (AAC, 2n=3x=29) was obtained from Brassica campestris ssp. chinensis var. parachinensis Qinglu 9601 (tetraploid, AAAA, 2n=4x=40)×B. oleracea vat. alboglabra Baihua 9705 (diploid, CC, 2n=2x=18) by immature hybrid embryo culture in vitro. Five different alien monosomic addition lines (AA C2, AA C3, AA C4, AA C6, AA C7) were obtained from the backcross progenies of AAC×AA. Each alien monosomic addition line has some specific morphological characters. It is feasible to obtain alien addition lines from the progenies of AAC×AA by karyotype analysis and morphological observation based on the reference of parents.     

不同磷源在砖红壤上芥蓝营养生长期的应用研究

[目的]探讨不同磷源在砖红壤上对芥蓝生长发育及养分积累的影响。[方法]通过盆栽试验,研究枸溶性磷源和水效性磷源对芥蓝生长、养分积累及砖红壤土壤理化性状变化的影响。[结果]施用水溶性磷源液体肥料处理对芥蓝的株高、菜薹横径、生物量以及氮磷钾养分积累量等都有显著的促进作用。[结论]施用水溶性磷源液体肥料有利于促进芥蓝体内的氮、磷、钾养分积累,显著提高土壤中有效磷的含量,改善土壤的供肥能力。     

近交五指山小型猪SLA-DQA基因的克隆及在大肠杆菌的原核表达

采用RT-PCR方法扩增五指山猪SLA-DQA基因cDNA,克隆入测序载体,测序结果与Gene Bank(登陆号:AY243104)的序列相同,大小为768 bp,该基因编码255个氨基酸残基和一个终止密码,预计蛋白分子量为28 kD.将这个基因克隆到原核表达载体PET-28a(+)中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确,插入到表达载体中,阅读框是正确的,从而构建成重组表达载体PET-28a(+)-DQA.重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析,结果表明得到了与预计分子量相同的蛋白.     

芥蓝BoPGIP2全长基因的分子克隆及其序列分析

1材料与方法 1．1材料与试剂试材为“中花”芥蓝,种子播于装有蛭石和珍珠岩各半的苗钵中,并在玻璃温室中生长。幼苗期取幼嫩叶片,用75％的酒精棉擦洗干净,做好标记,立即投入液氮中固定,-75℃保存备用。     

奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达

根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白.     

芥蓝BoPGIP2全长基因的分子克隆及其序列分析

从芥蓝（Brussica oleraceaL．var．alboglabra）中克隆了一个新的PGIP基因,命名为BoPGIP2。BoPGIP2基因序列全长为1102bp,由2个外显子和1个内含子构成,外显子总长为993bp,内含子总长为95bp,编码330个氨基酸序列,分子量为37．1kDa。推导的氨基酸序列分析表明,该序列包含5个N一糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,5个酪蛋白激酶II磷酸化位点,4个N-豆蔻酰化位点;同源序列比对分析表明,所比对基因都含有LRR结构,在145位点的LRR结构域在所有物种中高度保守。     

人促性腺激素释放激素及其转运肽基因的克隆、表达与纯化

研究根据GenBank中已发表的人GnRH2基因mRNA序列以及转运肽基因核苷酸序列,借助Oli-go4.1设计了一对寡核苷酸引物,以引物3'末端的短互补序列退火形成小段双链,从而互为模板和引物,通过引导合成长达90bp的目的序列GnRH/TRS。将其克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pYC1,经酶切鉴定筛选出阳性克隆pYC1,进一步的序列分析确认其中GnRH/TRS序列的正确性。pYC1经BamHI和EcoRI酶切得到GnRH/TRS片段,然后将此片段克隆到表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pYC2。经酶切鉴定筛选出阳性克隆pYC2,并转化到大肠杆菌BL21(ED3)plyS实现原核表达。IPTG诱导后成功表达出与预期大小相符的约28ku的融合蛋白,光密度扫描对表达产物进行初步定量,表达产物约占菌体总蛋白的33.3%,表达产物经GlutathioneSepharose4B层析纯化后,得到了纯度较高的GST-GnRH/TRS融合蛋白,为进一步科研和实际应用奠定基础。