生长因子对卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响

为了探讨生长因子（ＥＧＦ，ＰＤＧＦ）对牛卵母细胞体外成熟与早期胚胎体外发育的影响，本研究进行了两个实验。实验１：在卵母细胞体外成熟（ＩＶＭ）中，将卵母细胞平均随机的放入表皮生长因子浓度为０，２．５，２５，５０μｇ／Ｌ的成熟培养液和对照组中。实验２：在早期胚胎体外培养（ＩＶＣ）过程中，将受精卵平均随机分配入５个不同培养液的处理组：（１）ＴＣＭ－１９９＋１０％阉公牛血清（ＳＳ）；（２）ＴＣＭ－１９９＋ＥＧＦ＋ＰＤＧＦ；（３）ＴＣＭ－１９９＋ＥＧＦ；（４）ＴＣＭ－１９９＋ＰＤＧＦ；（５）ＴＣＭ－１９９＋无生长因子、其中ＥＧＦ：５０μｇ／Ｌ，ＰＤＧＦ：０．１μｇ／Ｌ。２，３，４，５组有０．１％ＰＶＡ和０．３％ＢＳＡ，并与颗粒细胞单层协同培养。卵母细胞的体外成熟（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）和早期胚胎体外培养（ＩＶＣ）的方法与Ｌｕ等（１９８７）报道的相同。结果表明：浓度为５０μｇ／Ｌ的处理组分裂率与对照组无差异（８９．０％，９２．４％，Ｐ＞０．０５），而浓度为０，２．５，２５μｇ／Ｌ的处理组分裂率均显著低于对照组（７８．６％，８２．３％，８４．３％，Ｐ＜０．０５），在囊胚率和第７ｄ一级胚胎率上各组均无差异。ＥＧＦ在体     

细粒棘球蚴生发层细胞系可溶性抗原的免疫学及SDS-PAGE分析

本研究报道了细粒棘球蚴生发展细胞可溶性抗原的免疫学研究结果及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果，将原头节可溶性抗原，生发展可溶性抗原，囊液抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠制备抗血清并用原头节人工感染Ｂａｌｂ／ｃ小鼠制备阳性鼠血清，再用生发展细胞系可溶性抗原以间接ＥＬＩＳＡ法进行检测以观察该抗原的反应原性；用ｐＡｇ，ｇＡｇ，ＳＨＦ以及生发展分泌抗在分别对曾反种过细胞系细胞的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠的血清进行检测，以了解细胞系抗原     

甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＦＭＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的核苷酸序列合成引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法获得ＣＰ基因后,再将其克隆到原核表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋）中。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,经ＩＰＴＧ诱导,ＣＰ基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得了高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,制备了ＳＰＦＭＶ外壳蛋白的特异性抗血清。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ和点免疫（Ｄｏｔｂｏ     

乙肝表面抗原和生长抑素融合基因在杆状病毒中表达

将乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）与生长抑素的融合基因（ＨＢｓＡｇ／ＳＳ）插入杆状病毒转移载体质粒ｐＶＬ１３９３，构成重组转移质粒ｐＶＬ１３９１ＨＳ。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂质证实ＨＢｓＡｇ／ＳＳ已插入ＰＶＬ１３９３。借助磷酸钙沉淀法，将ＣｓＣｌ超速离心纯化的重组转移质粒和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）共转染Ｓｆ９细胞，用荧光空班和酶联免疫测定法（ＥＬＩＳＡ），筛选到重组病毒ＡｃＮＰＶＨＳ。提取感     

玻璃化冷冻体外成熟牛卵母细胞的尝试

通过两个试验对体外培养成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻。试验１用１０％丙二醇（ＰＧ）加上不同浓度（０％～２０％）的乙二醇（ＥＧ）作为细胞内玻璃化溶液（ＶＳ１），２５％ＰＧ＋２５％ＥＧ作为细胞外玻璃化溶液（ＶＳ２）对卵母细胞进行冷冻。结果卵母细胞的体外受精分裂率（０．９％～２３．４％）均显著低于对照组（７５．０％）。在处理组中，以１０％ＰＧ＋５％ＥＧ和１０％ＰＧ＋１０％ＥＧ作为ＶＳ１的效果较好，分裂率分别为２３．４％和２２．２％，均显著高于其他处理组。试验２以１０％ＰＧ＋５％ＥＧ作为ＶＳ１，２５％ＰＧ＋２５％ＥＧ作为ＶＳ２进行冷冻。解冻后在０．５ｍｏｌ／Ｌ或０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中１～２步或在含防冻剂的溶液中经２～３步稀释防冻剂。卵母细胞经体外受精后，分裂率在１８．２％～３０．６％之间。在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中一步脱防冻剂的卵母细胞经体外受精、体外培养后，２５个早期胚胎中有３个发育成囊胚，其它组均未发现囊胚。这些结果表明玻璃化过程对卵母细胞造成了损伤。引起损伤的原因可能是玻璃化溶液的化学毒性作用及脱防冻剂过程中卵母细胞受到的渗透压损伤。     

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转基因小鼠的建立

利用小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的调控序列指导人Ｇ－ＣＳＦ基因所构建的融合基因,注射小鼠受精卵,ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明,获得了人Ｇ－ＣＳＦ转基因小鼠,整合率为２．３７％,这一模型的建立为转基因大动物生产提供了资料和方法。     

斑点免疫金银染色技术检测鸡传染性法氏囊病毒的研究

本研究成功建立了检测鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）抗原的斑点—免疫金银染色技术（Ｄｏｔ－ＩＧＳＳ），并确定了操作流程的最佳试验条件。应用该法对纯化ＩＢＤＶ抗原的最低检出量为０．１９５３ｎｇ／点，其敏感性为Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的８倍。特异性阻断试验和交叉反应试验证明Ｄｏｔ－ＩＧＳＳ具有较高的特异性。Ｄｏｔ－ＩＧＳＳ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ对５４份自然感染法氏囊样品检测的阳性率为９６．３％和９２．５％（χ２＝３．１１７９，Ｐ＞０．０５），统计学分析两者无显著差异。研究表明本法具有敏感、特异性强、经济、安全等优点，可用于ＩＢＤＶ感染的特异诊断。本研究为免疫金技术应用于畜禽传染病的诊断和研究打下了基础     

核酸探针检测人工感染猪及死胎的猪繁殖与呼吸综合症病毒

利用反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合症病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲株ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ。将ＰＣＲ产物连接进线状克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ后获阳性重组质粒。用ＥｃｏＲＩ及ＳｍａＩ双酶切阳性重组质粒ＤＮＡ,回收４６３ｂｐ的小片段并以此制备出地高辛标记的核酸探针。应用该探针对４头鼻内人工感染ＡＴＣＣＶＲ－２３３２的     

在大肠杆蓖TG1中克隆和表达苏云金芽胞杆菌cryI基因

本研究分离并提纯苏云金芽胞杆菌８０１０菌株的质粒ＤＮＡ，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶解后与ＤＩＧ标记的ｃｒｙＩ基因ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段的ＲＮＡ探针杂交，显示出分子量分别为６．５６ｋｂ和４．４ｋｂ的阳性片段。用Ｂｌａｓｓｍｉｌｋ回收４．４ｋｂ的阳性片段并与双功能载体ｐＲＩＴ５重组，转化感受态大肠杆菌ＴＧ１细胞，通过斑点杂交和快检获得含４．４ｋｂ片段的克隆株Ｔ２，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表明它表达了１３０ｋＤ     

苜蓿细胞悬浮培养与耐受高浓度PEG变异体的筛选

本文对紫花苜蓿的细胞悬浮培养、悬浮细胞系的建立、离体辐射效应和高浓度ＰＥＧ耐受性变异体的筛透进行了研究。结果表明：１．高浓度的２，４．Ｄ（５～１０ｍｇ／Ｌ），低浓度的ＡＢＡ（０．１～２ｍｇ／Ｌ），高浓度的蔗糖（６％～９％），较高的离子强度，以及逐步缩短继代时间，均有利于胚性悬浮细胞系的快速建立。相反，细胞分裂素，高浓度的ＮＨ和ＧＡａ的存在，不利于悬浮系的建立。细胞分裂素（４ＰＵ３０，ＫＴ或ＢＡ）可促进细胞的团聚，不利于细胞的分散。此外，低浓度的２，４－Ｄ，４ＰＵ３０（或ＢＡ，ＫＴ）和ＡＢＡ的配合使用，在悬浮培养基中可形成大量的体细胞胚。２．辐射处理悬浮细胞的最适剂量为２０～６０Ｇｙ。３．未经改造的初期悬浮培养物远较悬浮细胞系对高水势敏感。４．胚性悬浮细胞系经２０Ｇｙ的γ射线处理，筛选出了对１５％ＰＥＧ水势（约－１１巴）耐受性的克隆６个，并获得了一批再生植株，从２０％ＰＥＧ（约－１５巴）筛选出１个抗性克隆。抗性细胞系对高浓度ＰＥＧ和ＮａＣｌ产生的水势在细胞水平表现出很强的抗性。     

抗鸡贫血病毒结构蛋白单克隆抗体制备及其对应抗原表位分析

以纯化的原核表达的鸡贫血病毒结构蛋白为抗原，免疫6-8w的雌性Balb/c鼠, 经过三次免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以纯化的蛋白为抗原进行ELISA检测，将阳性细胞孔经过三次有限稀释，共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。间接免疫荧光试验证实6株单抗可以与鸡贫血病毒感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应，Western blot结果显示单抗与杆状病毒表达的VP1重组蛋白可以发生特异性反应。利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定，结果表明6株单抗均为IgG1亚型，且所有单抗的轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析，初步鉴定了筛选出的单抗所对应的抗原表位，其中有四株单抗识别的表位位于VP1 218-274位氨基酸之间，另外两株单抗识别的表位分别位于275-301位、324-369位氨基酸之间。     

人工雌性激素己烯雌酚单克隆抗体的制备及表征

合成了己烯雌酚的半抗原CP-DES,并将半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联制备免疫原和包被原。将免疫好的Balb/c小鼠脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选出了1株能稳定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D87C412C7。分析该杂交瘤细胞的染色体,并以间接酶联免疫吸附分析法(iELISA)检测了单克隆抗体免疫球蛋白的类型。获得的杂交瘤细胞的平均染色体数目为45-50对左右,它分泌IgG1亚类的单克隆抗体。该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定,细胞上清效价大于640,诱导腹水效价大于108,该单克隆抗体的检测限IC20=2.3ng/ml,与己烯雌酚结构类似物存在一定的交叉反应,与两种载体蛋白(BSA,OVA)无交叉反应。本研究为己烯雌酚ELISA检测方法的建立提供了条件。     

毒死蜱单克隆抗体的制备及鉴定

本文合成毒死蜱的半抗原并对其进行结构鉴定,将半抗原与牛血清白蛋白和鸡卵清蛋白共价偶联分别制备免疫原和包被原,再取已免疫的Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,建立2株分泌毒死蜱单克隆抗体的杂交瘤细胞。以琼脂双扩散法鉴定抗体亚类类型,间接竞争ELISA方法测定了抗体对毒死蜱的灵敏度、特异性和亲和性。结果表明该抗体分泌IgG1亚类的单克隆抗体,且与毒死蜱的亲和性较高(1.5×107 L / mol),与其他结构类似物的交叉反应均小于1%。本研究成功制备了毒死蜱特异性的单克隆抗体,为今后ELISA方法的建立提供了条件。     

抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争ELISA试剂盒的研制

利用合成的完全抗原(BSA-ENR)免疫小鼠,通过细胞融合技术和间接竞争ELISA筛选出了能分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以此为基础研制恩诺沙星残留检测的竞争ELISA试剂盒(competitive ELISA ENR-Kit),并测定其性能。结果表明:筛选出的2株杂交瘤细胞,单抗亚类均为IgG1型,其中4G1-B3株的ENR mAb间接ELISA效价为1:1.024×106,亲和常数(Ka)为9×1010L/mol;竞争ELISA试剂盒的线性检测范围为0.05~101.6μg/L、灵敏度0.05μg/L、半数抑制浓度(IC50)1.1μg/L,与其他化合物的交叉反应率(CR%)均小于0.01%,鸡肉样、鸡肝样、鱼肉样和牛奶样的平均添加回收率分别为81.5%8、7.6%、84.3%和95%,不同基质添加恩诺沙星标准品做竞争ELISA对ENR-Kit检测结果影响小,试剂盒保存期6个月以上。结果说明该竞争ELISA试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点,适用于ENR残留的快速检测。     

Production and characterization of a monoclonal anti-anti-idiotype antibody against fumonisin B(1).

A monoclonal anti-anti-idiotype antibody (mAb3) against fumonisin B(1) (FmB1) was produced from the hybridoma cell line 7C7F4, which was generated by the fusion of P3/NS-1/1-AG4-1 myeloma cells with spleen cells isolated from a Balb/c mouse that had been immunized with the Fab fragments of affinity-purified anti-idiotype antibodies. The mAb3 belongs to the immunoglobulin M, kappa light chain. A direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dc-ELISA) and an indirect competitive ELISA (idc-ELISA) were established for antibody characterization and toxin analysis. In an idc-ELISA using FmB1-ovalbumin (OVA) as the coating antigen, the concentrations causing 50% inhibition of binding (IC(50)) of mAb3 to the solid-phase FmB1-OVA by free FmB1, FmB2, and FmB3 were found to be 75, 95, and 450 ng/mL, respectively. In the dc-ELISA, the concentration causing IC(50) of FmB1-horseradish peroxidase to the solid-phase mAb3 by free FmB1 was found to be 233 ng/mL. Analysis of 12 samples naturally contaminated with fumonisins with mAb3-based idc-ELISA and polyclonal-based dc-ELISA showed a good correlation between these two methods with a correlation coefficient of 0.76 at p < 0.02. The linear regression slope was found to be y[polyclonal ELISA] = 0.87x[mAb3 ELISA] - 52 ppb.     

莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺(RAC)偶联于牛血清白蛋白(BSA),合成免疫原BSA-RAC,并用紫外和凝胶电泳鉴定;用BSA-RAC免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗RAC单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备RAC mAb。应用RAC mAb研制RAC残留快速检测阻断ELISA试剂盒(RAC-Kit),并测定其性能。结果表明,BSA-RAC偶联成功,分子结合比为1∶24.5;筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的4D8株的亲和常数Ka为1.65×1010L/mol。RAC-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,线性范围为1~170μg/L,灵敏度为0.52μg/L,检测限为1μg/L,饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为91.1%和89.2%,平均批内和批间变异系数<15%,与多巴酚丁胺的交叉反应率为22.3%,与其他化合物无交叉反应,RAC-Kit在4℃可保存180d。     

Development of a monoclonal antibody against domoic acid and its application in enzyme-linked immunosorbent assay and colloidal gold immunostrip

A monoclonal antibody (mAb) specific to domoic acid was produced from a stable hybridoma cell line, 9F1F11, generated by the fusion of P3/NS1/1-AG4-1 myeloma cells with spleen cells isolated from a Balb/c mouse immunized with domoic acid--keyhole limpet hemocyanin. The 9F1F11 mAb belongs to the immunoglobulin G1 (kappa-chain) isotype. A competitive direct enzyme-linked immunosorbent assay (cdELISA) and a competitive indirect ELISA were established for antibody characterization. In the cdELISA, the concentration causing 50% inhibition (IC50) of binding of domoic acid-horseradish peroxidase to the antibody by domoic acid was found to be 0.58 ng/mL. A sensitive and rapid mAb-based colloidal gold immunostrip was also developed. The immunostrip assay, which has a detection limit of 5 ng/mL for domoic acid, can be completed in 10 min. Analysis of domoic acid in blue mussel samples revealed that data obtained from immunostrip were in a good agreement with those obtained from cdELISA. The mAb-based cdELISA and immunostrip assay established in this study were sensitive and accurate for rapid screening of domoic acid in shellfish samples.     

特布他林杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体制备与鉴定

分别通过1,4丁二醚法和EDC法将特布他林偶联于载体蛋白BSA和OVA上,用BSA-TBL免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,OVA-TBL包被后用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、高敏感性和高特异性的小鼠进行抗原进行冲击免疫;无菌手术取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合建立分泌TBL单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用体内诱生腹水法制备TBL mAb,并对TBL mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果显示,免疫的6只小鼠血清抗体效价均达到10-4;融合后筛选出4C08-G5和3H3-A02共2株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1∶800和1∶1600,腹水效价分别为1∶2.56×105和1∶1.02×106;4C08-G5株分泌的抗体对TBL的IC50为5.25ng/ml,与瘦肉精、莱克多巴胺等其他β2激动剂交叉反应性小于3%。本试验获得了抗TBL mAb,为TBL残留免疫检测方法的建立奠定了坚实的基础。     

抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定

苯巴比妥(PB)经化学修饰在其苯环上引入活性基团氨基,合成半抗原对氨基苯巴比妥(pAPB),用重氮化法将pAPB偶联于BSA,合成人工抗原BSA-pAPB,并用红外(IR)、紫外(UV)、SDS-PAGE鉴定;用BSA-pAPB免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗PB的单克隆抗体mAb(PB mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备PB mAb,并鉴定其免疫学特性。结果表明,BSA-pAPB偶联成功,偶联率为1∶19;筛选出1B9、3C4、3F6、4E6共4株杂交瘤细胞,其中最好的4E6株间接ELISA效价细胞培养上清为1∶8.1×102,腹水为1∶6.4×105,同种型为IgG1/κ,亲和常数(Ka)为2.08×1010L/mol,对PB的半数抑制浓度(IC50)为11.35μg/L,与巴比妥的交叉反应率(CR%)为12.4%,与其他化合物无CR。本试验研制出高效价、敏感、特异的PB mAb,可用于PB残留检测的免疫学实验。     

西马特罗杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体制备和鉴定

用重氮化法将牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）分别与西马特罗（CIM）偶联作为免疫原或包被原,用BSA-CIM免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,OVA-CIM包被后用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、高敏感性和高特异性的小鼠进行抗原超强免疫;取脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌CIM单克隆抗体（Monoclonal antibody,mAb）的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备CIM mAb,对CIM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果显示免疫的6只小鼠血清抗体效价均达到10-3;融合后筛选出3B11-H4、2A11-G11和4F5-F11共3株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1∶800、1∶1600和1∶1600,腹水效价分别为1∶2.56×106、1∶1.02×107和1∶2.56×107,3B11-H4株对CIM的IC50为040ng/ml,与瘦肉精、莱克多巴胺等其他β2激动剂交叉反应性小于02%。本试验获得了高效价、敏感、特异的抗CIM mAb,为CIM残留ELISA检测试剂盒和试纸条的建立奠定了坚实的基础。