芥菜开花调控因子SVP 与FLC 蛋白互作的结构域筛选与鉴定

 为阐明芥菜开花路径核心调节子SVP与FLC相互作用的结构域,从酵母重组质粒pGADT7SVP、pGBKT7FLC分别亚克隆了5个SVP截短体（SVP1 ~ 5）和5个FLC截短体（FLC1 ~ 5）。SVP1 ~ 5与FLC1 ~5编码蛋白的结构域均分别为MI、MIK、K、IKC和KC。利用酵母双杂交体系,分别构建酵母猎物质粒pGADT7SVP1 ~ 5与诱饵质粒pGBKT7FLC1 ~ 5,并转化对应的酵母Y187、Y2HGold菌。酵母转化子Y187［pGADT7SVP2 ~ 5］能与Y2HGold［pGBKT7FLC］融合,并可在选择性固体培养基QDO/X/A上长出蓝色菌落,表明FLC能与截短体蛋白SVP2 ~ 5异源结合,SVP的K域（SVP3）可独立作用于FLC蛋白。此外,Y187［pGADT7SVP］× Y2HGold［pGBKT7FLC2 ~ 5］也能同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1,表明FLC的K域（FLC3）也可独立作用于SVP。进一步研究发现：Y187［pGADT7SVP3］× Y2HGold［pGBKT7FLC3］正向杂交以及Y187［pGADT7FLC3］× Y2HGold［pGBKT7SVP3］载体互换后杂交均可相互作用,表明SVP的K域（SVP第96 ~ 173位氨基酸区域）与FLC的K域（FLC第114 ~ 167位氨基酸区域）能够异源结合,是介导SVP与FLC蛋白互作的关键结构域。     

芥菜开花调控蛋白SVP 与FLC 酵母表达载体的构建及其相互作用研究

 为深入研究芥菜开花信号整合子的两个核心调节因子SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）与FLOWERING LOCUS C（FLC）相互作用的分子机理,通过PCR扩增,从芥菜材料‘QJ’中分别克隆含EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切位点的SVP和FLC编码区全长,并利用酵母双杂交体系,将FLC与GAL4报告基因DNA 激活域融合（pGADT7FLC）,SVP与GAL4报告基因DNA 结合域融合（pGBKT7SVP）。两种重组质粒分别转化酵母Y187和Y2HGold后未出现自激活和毒性现象。融合的二倍体酵母（pGADT7FLC × pGBKT7SVP）能在选择性固体培养基QDO/X/A（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA）上生长,并且菌落呈蓝色。将诱饵质粒（pGBKT7SVP）与猎物质粒（pGADT7FLC）载体互换（pGADT7SVP、pGBKT7FLC）,再次转化酵母后仍能融合成二倍体酵母（pGADT7SVP × pGBKT7FLC）,并同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1,由此表明SVP与FLC蛋白能够相互结合。     

芥菜开花负调因子SVP 及FLC 同源互作域筛选和作用强度分析

 为探明芥菜开花负调因子SVP、FLC 自身聚合的分子机制及其蛋白作用模式,利用酵母双 杂交体系,分别对SVP、FLC 蛋白自身聚合及其作用强度进行研究。结果表明：酵母菌Y187 转化子 Y187-pGADT7SVP 和Y187-pGADT7SVP2 ~ 5 均能与酵母菌Y2HGold 转化子Y2HGold-pGBKT7SVP 融合, 并可在选择性固体培养基QDO/X/A 上长出蓝色菌落,而Y187-pGADT7SVP1 × Y2HGold-pGBKT7SVP 不 能在QDO/X/A 生长。说明SVP 蛋白能自身聚合,且与截短体SVP2 ~ 5 同源结合,SVP 蛋白自身聚合需 要核心作用域K 域参与。尽管MI 域不能单独介导SVP 自身聚合,但它的存在却能使SVP 自身聚合作用 增强,C 域有可能会削弱该作用。同时,Y2HGold-pGBKT7FLC 和Y2HGold-pGBKT7FLC2 ~ 5 也能与 Y187-pGADT7FLC 融合,同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1,FLC 能与截短体FLC2 ~ 5 同源互作。K 域是FLC 蛋白自身聚合必须的,I 域会增强这一作用。SVP 和FLC 的核心作用域K 域均由 K1、K2 和K3 亚域组成,形成3 个经典的α 螺旋,K 域有9 个高度保守的氨基酸位点及蛋白互作的结构 模体（亮氨酸拉链）。     

开花负调因子芥菜BjSVP与甘蓝BoFLC的异源互作研究

 为阐明开花负调因子BjSVP（源于种子春化型作物芥菜）与BoFLC（源于绿体春化作物甘 蓝）异源聚合后在开花调控路径中的互作机制,从芥菜酵母重组质粒pGADT7-BjSVP 分别亚克隆含MI、 MIK、K、IKC、KC、IK、IK1L1K2L2、IK1L1K2、IK1L1、IK1、I 结构域的11 个SVP 截短体（BjSVPΔ1 ~ BjSVPΔ11）, 构建猎物质粒pGADT7-BjSVPΔ1 ~ pGADT7-BjSVPΔ11 并转化酵母Y187 菌;从甘蓝中克隆了BoFLC 和 BoFLCzq 基因,构建诱饵质粒pGBKT7-BoFLC、pGBKT7-BoFLCzq 并转化酵母Y2HGold 菌。酵母双杂 交表明：芥菜BjSVP 能与甘蓝BoFLC 相互作用,在QDO/X/A 培养基上长出蓝色菌落,激活酵母报告基 因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。截短体BjSVPΔ2 ~ BjSVPΔ5 也能与BoFLC 相互作用,而BjSVPΔ7 ~ BjSVPΔ11 不能与BoFLC 互作。由此表明BjSVP 完整的K 域（BjSVP3）可独立作用于BoFLC,但K 域 亚域（K1、K2、K3）或者连接区（L1、L2）缺失突变后不能介导该作用。作用强度分析表明：BjSVP 的I 域能增强该蛋白互作,但M 域和C 域可能会干扰该作用;芥菜BjFLC 被甘蓝BoFLC 或BoFLCzq 替 换后,可明显增加作用强度;甘蓝FLC 的I 域第20 位、K 域第65 位和C 域第32 位氨基酸的变异很可能 与作用强度相关。     

甘蓝花粉管钙感应蛋白CaM 与SRK 相互作用研究

 为研究甘蓝花粉管钙感应蛋白CaM 与SRK 相互作用的分子机理及其可能相互作用的区域, 从自交不亲和甘蓝材料‘E1’中分别克隆得到CaM12 基因450 bp 及S 位点受体激酶（SRK7）基因全长 序列2 118 bp,并亚克隆得到SRK 胞外域（eSRK）和胞内激酶域（iSRK）,构建原核表达载体pGEX-CaM12、 pCold-eSRK 和pCold-iSRK,转化E. coli BL21（DE3）进行原核表达,表达产物纯化后进行体外相互作用, 结果表明CaM12 能够与SRK7 进行相互作用,但作用区域是iSRK7 而不是eSRK7。为进一步验证其相互 作用,本研究利用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-CaM12、pGADT7-eSRK7、pGADT7-iSRK7 和 pGADT7-SRK7 酵母表达载体,转化相应酵母Y2HGold 和Y187 感受态细胞后未出现自激活和毒性现象, 相互作用结果与原核表达检测一致。同时将CaM12 的3 个EF-hands 结构域突变体CaM12-2-、CaM12-23- 和CaM12-234-与iSRK7 分别构建酵母表达载体pGADT7-CAM12-2-、pGADT7-CAM12-23-、pGADT7- CAM12-234-,检测其相互作用。结果表明CaM12 EF-hands 突变体CaM12-2-、CaM12-23-和CaM12-234- 在酵母双杂交系统中均不能与iSRK7 片段发生相互作用,说明CaM12 的EF-hands 结构域突变后失去结 合Ca2+能力而不能与iSRK7 相互作用。该研究可为自交不亲和机理提供新的参考依据。 关键     

芥菜开花相关基因AGL24的表达及与SOC1、SVP和FLC蛋白的互作

为阐明芥菜（Brassica juncea Coss.）开花激活因子AGL24的表达特性及其在开花途径中与调节因子SOC1、SVP和FLC蛋白的互作机制,从‘青叶芥’中克隆了680 bp的AGL24基因,它编码221个氨基酸。序列分析表明：芥菜AGL24含有M、I、K和C域,分别有59、11、102和47个氨基酸,与油菜AGL24亲缘关系较近。荧光定量PCR分析发现：在低温春化途径和长日照光周期途径中,AGL24在叶片和茎尖中均有表达,营养生长期表达量较低,而生殖生长期表达量迅速增加;AGL24在光周期途径中的表达峰值要早于低温春化途径。酵母双杂交试验表明：全长AGL24与开花信号整合子SOC1蛋白能够互作,激活酵母报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2和MEL1,在QDO/X-α-Gal/AbA平板培养基上长出蓝斑。另外,分别去掉M域后的截短体AGL24与SOC1也能相互作用。β–半乳糖苷酶活性检测发现：截短体杂交组合AGL24 × SOC1的互作强度显著高于全长杂交组合AGL24 × SOC1。然而全长AGL24或截短体AGL24 均不能与光周期途径核心抑制子SVP互作,也不与低温春化途径核心抑制因子FLC相互作用,说明AGL24并不是SVP或FLC的直接靶蛋白。     

芥菜开花抑制因子SVP表达分析及其与FLC互作的调节位点鉴定

为阐明芥菜开花抑制因子SVP基因的表达特性及其与FLC蛋白互作的调节机制,从‘青叶芥’中克隆了SVP基因。定量PCR分析表明：低温春化途径和长日照光周期途径中SVP在叶片和茎尖均有表达。营养生长初期表达量较低（茎尖和叶片中平均相对表达量分别为0.56和0.35）,生殖生长早期则显著增加（春化途径的茎尖和叶片分别为0.60和1.27,光周期途径的茎尖和叶片分别为0.49和1.42）。茎尖中SVP对低温春化的反应比光周期敏感;而叶片中SVP对光周期的反应比低温敏感。酵母双杂交和 β–半乳糖苷酶活性测定显示：SVP蛋白I域突变体SVP^E90L以及K域突变体SVP^K104C和SVP^H106I均会削弱SVP/FLC₂蛋白的互作,但不会导致相互作用消失。SVP蛋白K域突变体SVP^R137L能完全破坏SVP/FLC₂的互作,但SVP^R137L仍然能与芥菜FLC₁、FLC₃、FLC₄和FLC₅相互作用,说明SVP/FLC₂的蛋白互作受到SVP第137位氨基酸的特异性调控。序列比对发现：芥菜FLC₄和FLC₅氨基酸序列完全相同,它们与FLC₃仅有1个变异位点;FLC₂与FLC₁、FLC₃、FLC_4-5之间分别有28、19、18个变异位点;FLC₂与FLC₁、FLC₃、FLC₄或FLC₅均不相同的位点有11个。推测FLC₂与FLC家族其他成员之间的变异位点很可能对SVP^R137L/FLC₂特异性调控有贡献。     

芥菜AGL18家族成员与开花整合子SOC1的互作分析

为阐明芥菜开花抑制因子AGL18与开花整合子SOC1间的互作调控机制,在芥菜‘QJ’的开花期克隆了AGL18-1,幼苗期克隆了AGL18-2和AGL18-3,它们分别编码257、257和258个氨基酸,为AGL18家族的3个成员。序列比对表明,芥菜AGL18家族成员与十字花科芜菁和油菜同源性均高达90%。酵母双杂交和BiFC试验表明:芥菜AGL18-1、AGL18-2和AGL18-3蛋白与SOC1不会发生蛋白相互作用。酵母单杂交和Dual-Glo~ Luciferase试验表明:AGL18-1、AGL18-2和AGL18-3中仅有花期AGL18-1蛋白与SOC1启动子间存在互作。为进一步筛选AGL18-1/SOC1的互作区域,分别截取了AGL18-1蛋白的M域和IKC域,发现仅M域与SOC1启动子存在相互作用,说明M域是介导花期AGL18-1蛋白与SOC1启动子互作的关键区域。这为深入研究AGL18与SOC1互作的分子机制及其对开花时间的调控奠定了基础。     

芥菜开花信号整合子的两个核心转录因子FLC和SVP相互作用的体外检测

 为了深入研究调控芥菜开花信号整合子的两个核心转录因子Flowering Locus C（FLC）和SHOTR VEGETATIVE PHASE（SVP）的作用机理和进行人工调控,以芥菜‘QJ’为材料,采用RT-PCR技术分别扩增FLC和SVP的编码序列,构建原核表达质粒pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP,转化宿主菌大肠杆菌BL21,通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP融合蛋白序列中的6 × His标签能与Ni+结合的特点,对芥菜FLC与SVP的相互作用进行SDS-PAGE检测。结果表明：FLC与SVP能在体外相互作用并形成复合体,为深入分析FLC与SVP间的作用机理以及探讨其与下游开花信号整合子元件的相互作用提供了理论和技术基础。     

葡萄MADS-box转录因子家族全基因组鉴定及表达分析

从葡萄基因组中共鉴定出54个MADS-box基因,其中Type-Ⅰ型10个,Type-Ⅱ型44个,分布于15条染色体中,编码的蛋白质序列为62～596个氨基酸,外显子数1～16个。启动子区含有大量光信号、植物激素、胁迫和分生组织等相关功能域。根据实时荧光定量RT-PCR的结果发现,SEP、FUL、FLC、SVP、SOC1和ANR1亚类基因随叶片生长表达水平逐步升高,在成熟叶中最高,衰老叶片中下降;果实第1次膨大期和果实转色期是SEP、SOC1和ANR1亚类基因的两个表达高峰期;单氰胺处理诱导SVP、AGL15、SOC1、AP3/PI、AGL12和FLC亚类基因在休眠过程中表达量持续上升,在休眠解除过程表达量下降。     

甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究

 为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16 ~ 421 bp的片段和SCR第1 876 ~ 2 068 bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。     

甘蓝SCR、THL与SRK交替相互作用的酵母双杂交检测

eSRK（S位点受体激酶胞外域）、SCR/SP11（S位点富含半胱氨酸蛋白-S位点蛋白11）和THL₁（类硫氧还蛋白）是甘蓝自交不亲和性信号传导过程重要的3个元件。利用PCR技术获得两种甘蓝SCR₂（class-Ⅱ）、eSRK₂（class-Ⅱ）、THL₁、SRKJ（class-Ⅰ，SRK₆激酶域）和eSRK₂₈（class-Ⅰ）的编码序列，并分别构建以pGBKT7为载体的SCR₂、THL₁的重组诱饵质粒和以pGADT7为载体的eSRK₂、eSRK₂₈、SRKJ的重组猎物质粒。利用酵母双杂交系统验证eSRK₂-SCR₂、eSRK₂₈-SCR₂、SRKJ-THL₁的相互作用。重组质粒在宿主细胞中未产生毒性及自激活作用，表明重组表达载体构建成功；组合Y2HGold〔pGBKT7-SCR₂〕×Y187〔pGADT7-eSRK₂〕在三缺平板（SD/-Trp-Leu-His/x-α-gal/AbA，TDO/x/A）上生长出蓝色克隆，激活了报告基因AUR1-C、MEL1、HIS3；组合Y2HGold〔pGBKT7-SCR₂〕×Y187〔pGADT7-eSRK₂₈〕能够在二缺平板（SD/-Trp-Leu）上生长，但在三缺平板上不生长，表明不同单倍型SRK-SCR可能不发生相互作用；组合Y187〔pGADT7-SRKJ〕×Y2HGold〔pGBKT7-THL₁〕能够在四缺平板上生长，激活了4种报告基因（AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2）。相同的单倍型SRK与SCR之间能够相互作用，不同的单倍型之间不会发生相互作用；酵母中报告基因表达的数目和类型的差异反映了class-Ⅱ型内部的SCR-SRK和class-Ⅰ的SCR-SRK互作强度，Ⅰ型高于Ⅱ型；THL与SRK之间存在较高的互作强度。这为Ⅰ型和Ⅱ型不同的自交不亲和性表型所依赖的3个起始信号传导元件之间的识别程度差异提供了直接证据和新内容。