超量表达PhWRIL1基因抑制矮牵牛叶片外植体再生不定芽

许多研究发现AP2/ERF家族euANT支基因超量表达可以促进植物生长和离体再生。但尚未有关于与euANT支亲缘关系很近的AP2/ERF基因basalANT进化支基因超量表达对离体培养中不定芽再生影响的研究。本研究中从矮牵牛中克隆了一个basalANT基因,命名为PhWRIL1。Real-time PCR结果显示,PhWRIL1的mRNA在矮牵牛各种组织中均有表达,表达量处于中等水平,在成熟组织中比幼嫩组织中更高。超量表达PhWRIL1的矮牵牛植株严重矮化,但开花时间没有显著变化。测定再生能力的结果表明：PhWRIL1超量表达的转基因植株叶片外植体的愈伤组织和芽的诱导与生长明显减少。这些结果表明PhWRIL1在矮牵牛中超量表达抑制了离体培养过程中不定芽的再生能力,在植物发育过程中basalANT和euANT基因可能发挥相反的作用。     

拟南芥At-pri-miR828 基因的克隆及其对番茄的遗传转化

 MicroRNA828（miRNA828）是一种新近发现的生物学功能还未全面研究的miRNA。为从 不同角度阐明miRNA828 的生物学功能,从拟南芥中克隆到At-pri-miR828 基因并构建了该基因过量表达 的植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828,通过农杆菌介导的叶盘法将pC2300-pOT2-At-pri-miR828 导入异源植物番茄品种‘Ailsa Craig’中。PCR 鉴定结果显示,外源基因At-pri-miR828 已成功整合到转 基因番茄基因组中,共获得9 个转基因株系,67 株转基因植株。定量PCR 检测结果显示,与野生型番茄 植株相比,转基因植株中miR828 的表达量显著增加,而生物信息学所预测的miR828 靶基因Sly-myb-like1 的表达水平则相应降低。花青素含量测定结果显示,miR828 过量表达的转基因番茄植株花青素含量明显 低于野生型植株,表明miR828 参与了番茄花青素的生物合成调控。     

山茶花CjAPL1基因正义表达载体的构建及对拟南芥的转化分析

 为研究山茶花CjAPL1基因对于重瓣花形成的作用,构建了pCAMBIA1300-CjAPL1正义植物表达载体,酶切结果显示,CjAPL1基因正向插入pCAMBIA1300的启动子和终止子之间,表明CjAPL1植物表达载体构建成功。将pCAMBIA1300-CjAPL1采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,获得转基因阳性植株65株。随机挑选表型变异明显的3株进行PCR扩增都得到了目的条带,Southern杂交鉴定进一步确认为转基因阳性植株。同时荧光定量检测到在转基因植株中CjAPL1基因表现出较对照显著提高6 ~ 25倍的表达量。转基因阳性植株表型变异明显,花柱和雄蕊数相比野生型各增加1枚和1 ~ 4枚,萼片边缘发育成白色的瓣化状,表明在拟南芥中过量表达CjAPL1基因可以引起花器官形态的变异和数量的变化,因此该基因在花器官形成和重瓣花发育中具有显著的调控功能。     

利用amiRNA 技术沉默矮牵牛查尔酮合成酶基因

 转基因介导的基因沉默技术是进行基因功能分析和利用基因工程改良作物的重要手段。在植物中,amiRNA（artificial microRNA）是具有高度特异性的基因沉默技术。根据amiRNA设计的原则设计了用于沉默矮牵牛查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）基因的amiRNA：amiRchs1,用拟南芥miR319a的前体作为表达amiRchs1的骨架,重叠PCR扩增,将天然miR319a序列替换成amiRchs1,合成的DNA片段置于35S启动子之后,转化导入矮牵牛。转基因植株花色变淡,花冠出现弥散的白色斑点或不规则的白色斑块,严重的几乎呈纯白色,花色素苷含量明显下降,CHS的mRNA含量明显降低,表明拟南芥miR319a的前体作为表达amiRNA的骨架在矮牵牛中可行,且能有效沉默结构基因。     

枣树ZjSOD1基因参与非生物胁迫响应的研究

【目的】克隆1个枣树超氧化物歧化酶基因ZjSOD1,并对其功能进行研究,为其在枣树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础。【方法】采用PCR克隆ZjSOD1 cDNA序列,运用实时定量RT-PCR方法研究其在高盐和PEG6000胁迫下转录水平的变化。构建ZjSOD1过量表达载体转化拟南芥,研究其在拟南芥中响应非生物胁迫应答的功能,测定氧化酶活性及生理指标。【结果】ZjSOD1基因cDNA序列开放阅读框全长为699 bp,编码232个氨基酸,理论等电点为8.59,属于Fe-SOD家族成员。在转录水平上,ZjSOD1明显受NaCl和PEG6000诱导。在拟南芥中过量表达ZjSOD1基因导致植株对干旱、高盐更加敏感,但对H_2O_2耐受性显著增强。在NaCl、PEG6000和H_2O_2胁迫条件下,过量表达ZjSOD1转基因植株中SOD、CAT和POD酶活性、脯氨酸和丙二醛含量、电解质渗透率均显著发生改变。实时定量RTPCR结果显示参与活性氧(ROS)、高盐和干旱胁迫相关信号通路的基因在ZjSOD1转基因株系中表达量发生明显改变。【结论】ZjSOD1在植物生长发育过程中参与氧化、干旱、高盐胁迫应答。     

苹果MdGA20ox1 基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

 以苹果砧木SH40[（Malus × domestica）× M. honanensis]为试材,采用RT-PCR 结合RACE 技术从SH40 茎尖中克隆得到一个赤霉素合成关键酶基因（GA20–氧化酶基因）,命名为MdGA20ox1, 其cDNA 全长1 579 bp,编码392 个氨基酸。该基因在GenBank 登录号为KC493633。氨基酸序列同源性 分析表明：MdGA20ox1 与玉米、拟南芥、梨等植物GA20ox 具有55.9% ~ 96.7%的相似性。洋葱表皮细 胞瞬时表达显示,MdGA20ox1 蛋白定位于细胞核与细胞质膜。植株生长量测定和相对定量表达结果表明, MdGA20ox1 基因在砧木SH28、SH40 和M26 自根苗的表达呈先下降再上升然后下降的趋势,这与其生长 动态基本一致。嘎啦/SH28 的植株生长量和MdGA20ox1 表达量最高,嘎啦/M26 次之,嘎啦/SH40 最低, 初步表明该基因的表达有与苹果植株矮化程度呈负相关的趋势。MdGA20ox1 在嘎啦/SH40 和嘎啦/SH28 不同组织中的表达模式一致,且半矮化类型砧木SH28 嫁接‘嘎啦’,其茎尖、幼叶、成熟叶和枝皮中的 表达量均高于矮化类型SH40 嫁接‘嘎啦’。     

GhMADS3基因组成型表达对矮牵牛花形和花色的影响

 利用农杆菌介导法将GhMADS3基因转入矮牵牛。对14株转基因植株进行分析鉴定, GUS染 色表明外源基因在转基因植株中表达, PCR检测显示GhMADS3整合到矮牵牛的基因组中, RT-PCR分析表 明GhMADS3在转基因植株中表达。转基因植株花器官普遍较野生型小, 花萼膨大、顶尖向内弯翘, 花冠深 裂且边缘伴有不规则褶皱, 柱头裸露在外, 花器官颜色较野生型变淡甚至完全白化。测定花瓣、花萼中花 色素苷和花萼中叶绿素含量, 结果表明转基因植株均较对照偏低。说明GhMADS3的导入使得矮牵牛花形、 花色发生改变。     

拟南芥NCED4基因的克隆及初步功能鉴定

以拟南芥为试材,采用PCR及DNA重组技术,从野生型拟南芥中克隆出NCED4基因,并构建植物表达载体pBI-NCED4,最终获得具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株,研究NCED4基因超表达对植物体的影响,并对其中4个再生植株进行PCR和荧光定量RT-PCR分析。结果表明:目的基因转入拟南芥基因组中,并在转基因拟南芥中成功过量表达;NCED4基因受外源激素的影响较为敏感,其作用可能与激素的调控有关。     

转基因草莓植株cNHX1基因表达水平和拷贝数的Real Time PCR分析

分析了转cNHX1基因的草莓不同植株的外源基因表达水平和cNHX1基因的拷贝数。结果表明：不同转基因株系cNHX1基因表达水平存在差异，而且这种差异随盐胁迫时间的延长而更明显。在6个株系中，T6株系有最高和最稳定的cNHX1基因表达水平，而T2株系的表达水平最低。对转基因植株基因组cNHX1基因拷贝数的分析表明，T3、T6、聪和T14的含量相似，而与T2株系相差289％～310％，推测T3、T6、T8和T14株系为单拷贝植株，而T2株系为3拷贝株系。     

过量表达tMEK2基因的大岩桐植株对温度胁迫的反应

 构建番茄中MAPKK基因tMEK2的过量表达载体并转化到大岩桐中,通过PCR和Southern blot鉴定出转基因株系并对其进行抗性分析。结果表明,转基因植株与对照相比叶片变小,叶片的叶绿素含量显著增加,在4 ℃低温和40 ℃高温胁迫之后的恢复能力明显比对照增强。     

苹果SUPERMAN家族基因的组织特异表达及MdSUP3的功能分析

通过半定量RT-PCR分析SUPERMAN家族基因在‘富士’苹果（Malus × domestica Borkh.‘Fuji’）叶芽、幼叶、花芽、花蕾、花、皮部组织和幼果中的表达模式,通过MdSUP3自主启动子驱动的GUS基因表达和MdSUP3异位表达分析其功能。结果表明,MdSUP3、MdSUP11和MdSUP9a在所检测的组织器官中均有表达,MdSUP9b主要在营养器官中表达,MdSUP5a、MdSUP1b主要在生殖器官中表达。MdSUP3启动子驱动GUS基因在植株根尖、幼叶、幼茎和花等器官中表达。超表达MdSUP3的转基因烟草植株矮化、节间缩短、叶片卷缩、花器官颜色改变和部分花器官形态异常;与对照相比,转基因烟草中ABA合成酶基因NtNCED3-2,花青素合成途径的NtDFR2和NtANS1基因表达显著上升,细胞分裂素氧化酶基因NtCKX和赤霉素氧化酶基因NtGA2ox4表达显著下降。异位过量表达删除C端DLELRL基序的MdSUP3基因不影响转基因烟草的生长发育,证明DLELRL是基因必不可少的功能域。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。     

中国水仙NTMADS1基因表达分析及转化拟南芥研究

 利用RT-PCR技术分析了中国水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）花器官特征基因NTMADS1在花期不同器官及花不同部位的表达模式。结果表明，该基因只在花器官中表达，且在雄蕊和副冠中的表达量高于雌蕊，在花瓣中未检测到该基因的表达。将该基因置于CaMV 35S启动子控制下，构建到载体pBI121的多克隆位点，获得了包含35S启动子、NTMADS1基因的编码区和NOS终止区域的植物表达载体。在农杆菌介导下将该基因转入模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，获得了卷叶、花期提早和花型改变的转基因植株。     

月季扩张素蛋白基因在花朵开放过程中的表达及功能分析

以切花月季‘Samantha’为试材,明确了外层花瓣主要在花朵开放前期扩展。从花瓣中克隆鉴定了3个具有α亚族扩张素保守特征域的基因：RhEXPA5、RhEXPA6和RhEXPA7。在月季花朵1 ~ 6级的开放过程中,3个扩张素蛋白基因都有表达,其中RhEXPA7的表达与花瓣快速扩展密切关联;在2级花朵花瓣中RhEXPA5和RhEXPA6的表达几乎不受乙烯影响,而RhEXPA7的表达被乙烯显著抑制。进一步利用35S启动子在拟南芥中过表达RhEXPA7,采用外源ACC处理可明显增加转基因植株幼苗的根毛密度;转RhEXPA7基因种子萌发对ABA的敏感性明显降低,而对NaCl的胁迫耐性明显增加。RhEXPA7与月季花朵开放中花瓣快速扩展进程密切关联,参与了乙烯信号的响应,并可以提高过表达拟南芥的胁迫耐性。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

超表达MdFLS2的拟南芥fls2突变体识别细菌鞭毛蛋白,提高对轮纹病菌的抗性

以红肉苹果‘紫红3号’愈伤组织为试材,克隆了细菌鞭毛蛋白受体基因MdFSL2,研究了其与拟南芥AtFLS2对细菌鞭毛蛋白敏感性差异以及对苹果轮纹病抗性的影响。进化树分析表明,MdFLS2与拟南芥AtFLS2亲缘关系较远,处于不同的进化树分支,与梨PbFLS2的亲缘关系最近。时空表达特异性研究表明,在苹果叶片中MdFLS2表达不随组织衰老而产生差异,能够被外源SA处理诱导,不受IAA、ACC处理影响;在根系中表达量最高,而在花与果实中表达量较低。在拟南芥中异源过表达MdFLS2,显著抑制植株生长,并出现叶片边缘枯死或细胞死亡的表型。在转基因拟南芥中受SA诱导的病程相关基因AtPR1、AtPR2和AtPR5,及衰老相关基因AtORE1和AtNAP的表达水平均显著高于野生型。为研究MdFLS2是否具有感知细菌鞭毛蛋白的能力,进行拟南芥根系生长抑制试验,MdFLS2超表达恢复了细菌鞭毛蛋白N端22个保守氨基酸肽段(flg22)对拟南芥fls2突变体根系生长的抑制作用,但flg22分别处理30和60 min,或20和40 min,flg22诱导的标志性基因表达水平及MAPK激酶活化水平在过表达MdFLS2的fls2突变体中显著低于同样处理的野生型。超表达MdFLS2提高了拟南芥叶片对轮纹病菌的抗性,并增强了拟南芥突变体fls2对假单胞菌DC3000的抗性。研究结果说明苹果MdFLS2是一个有功能的免疫相关基因,MdFLS2与AtFLS2在具体执行功能与作用机制上可能存在差异。     

蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。