中国野生毛葡萄芪合酶基因抗白粉病功能分析

中国野生毛葡萄（Vitis quinquangularis）‘丹凤–2’白藜芦醇含量高，并抗白粉病。以此为材料，利用同源序列克隆技术获得两个芪合酶基因 VqSTS12 和 VqSTS25。以欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织为受体材料，通过农杆菌介导法进行遗传转化，分别获得 7 个 VqSTS12 和 5 个 VqSTS25‘无核白’葡萄转基因植株。实时定量 PCR 分析发现，与野生型植株相比，转基因植株中芪合酶基因 STS 与下游白藜芦醇糖基转移酶基因 RSGT 表达量升高，与 STS 有底物竞争关系的查尔酮合酶基因 CHS 表达量降低。STS 的表达产物中主要的芪类物质反式云杉新苷含量增加。选择芪类物质含量高的转基因植株接种白粉菌发现，转基因植株对白粉菌的敏感性降低，发病较晚，病情较轻，在转基因植株上部分孢子萌发受抑制，菌丝发育迟缓。转基因植株中 VqSTS12 和 VqSTS25 受白粉菌诱导表达：在接菌后 1 ~ 3 d 内表达量显著升高，随后略有下降，在 6 ~ 7 d 表达量再次上升。同时高效液相色谱（HPLC）检测到 STS 的表达产物白藜芦醇、云杉新苷、葡萄素与紫檀芪含量增加。研究结果表明‘丹凤–2’毛葡萄拥有的 VqSTS12 和VqSTS25 及其表达的芪类物质具有抑制白粉菌的作用。     

苹果NBS-LRR1 基因的鉴定与表达分析

 NBS-LRR 蛋白是植物细胞内普遍存在的主要抗性蛋白家族,该家族的蛋白包含有NBS 结构域和LRR 结构基序,在植物抵御各种病原物的侵袭中发挥重要作用。从‘嘎啦’苹果中鉴定了一个NBS-LRR 类基因,命名为MdNBS-LRR1,（GenBank 登录号：JX126858）。该基因全长为3 116 bp,包含一个2 826 bp 的开放读码框,编码包含941 个氨基酸残基的蛋白质;其氨基酸序列含有典型的NBS-LRR类抗病基因所具有的NB-ARC 结构域。Blast 分析发现MdNBS-LRR1 与大豆NBS-LRR 类抗性蛋白具有较高的氨基酸序列一致性（60%）。RT-PCR 分析结果表明,MdNBS-LRR1 在‘嘎啦’苹果的幼叶、茎、功能叶、芽、皮和花等组织中均有表达,在幼叶中的表达量最高,茎中最低。苹果轮纹病病原菌侵染可促进MdNBS-LRR1 基因表达上调,接种后24 d 表达量最高,是对照的10.6 倍左右,另外,在‘嘎啦’苹果幼苗叶片中,SA、MeJA 和ACC 均可诱导该基因的表达,表明MdNBS-LRR1 基因的表达受到与抗病相关信号转导途径的调控。     

中国野生葡萄病原菌诱导响应VqSAP基因的克隆及表达分析

【目的】为了验证SAP基因在葡萄抗病防御机制中的作用,【方法】在前期通过抑制消减杂交技术(SSH)获得中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’衰老相关蛋白(SAP)基因EST序列的基础上,采用RT-PCR从毛葡萄‘商-24’中分离到SAP基因cDNA序列,并通过实时定量PCR和半定量PCR分析了SAP基因的表达特异性。【结果】序列分析表明该基因具有完整的的开放阅读框,序列长度为819 bp,编码272个氨基酸残基,相对分子质量为30.56 ku,等电点为8.78,将其命名为VqSAP。多重比较结果显示VqSAP基因与油棕、玉米、萱草、拟南芥、水稻等植物SAP基因的同源性为65%~74%。实时定量结果表明,在白粉菌诱导初期,抗病的毛葡萄株系‘商-24’和感病的华东葡萄株系‘湖南-1’VqSAP基因表达量均升高,这可能是因为它参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程。水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(Eth)处理表明衰老相关蛋白基因表达受激素分子调节,但在抗病和感病株系中基因的表达量有所差异。在嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同葡萄组织中的表达表明VqSAP基因的表达具有空间差异性。【结论】这些结果暗示着VqSAP的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控,很有可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。     

水杨酸对草莓炭疽病响应基因FaNBS20 表达的影响

 以栽培草莓（Fragaria × ananassa Duch.）‘久香’叶片为试材,采用同源克隆和RT-PCR 方 法,克隆FaNBS20 全长cDNA 序列,并利用实时荧光定量PCR 技术检测外源SA 处理协同草莓炭疽病病 原菌侵染对FaNBS20 表达的影响。结果表明,FaNBS20 的开放阅读框为3 573 bp,编码1 190 个氨基酸, 预测的蛋白质分子量为134.5861 kD,含有1 个TIR 结构域、1 个NB-ARC 结构域和1 个亮氨酸的富集区, 与森林草莓（Fragaria vesca subsp. vesca）抗烟草花叶病毒蛋白（XP_004292718）同源性高达99%。接种 草莓炭疽病菌对草莓抗炭疽病品种‘甜查理’FaNBS20 的表达影响显著,易感病品种‘久香’FaNBS20 的表达则一直处于较低水平,表明该基因可能与对炭疽病的抗性相关。两个草莓品种在SA 处理后对草莓 炭疽病的抗性均明显增强,且持续期可以达到10 d 以上。在SA 和草莓炭疽菌协同诱导下,FaNBS20 基 因的表达量在抗性品种‘甜查理’和易感品种‘久香’中分别达到接种前的38 倍和7.2 倍。以上结果表 明,水杨酸能提高草莓对炭疽菌浸染的抗性,表达水平和炭疽病抗性水平相关的FaNBS20 基因可能是水 杨酸参与的对炭疽病抗性响应途径中一个重要的成员。     

山葡萄应答霜霉病侵染过程中叶绿素荧光成像的变化

以抗霜霉病的‘左山一’和易感病的‘双丰’山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）为试材,离体叶片接种霜霉病菌后观察叶绿素荧光成像及参数变化。结果显示：叶绿素荧光成像系统可在接种霜霉病菌3 d时观察到病斑;霜霉病侵染叶片组织会显著改变叶绿素荧光参数;接种7 d时病斑与不接种对照相比,抗病品种‘左山一’Fv/Fm、ФPSⅡ、Y（NPQ）与Y（NO）的变化幅度（–73.42%、–100%、–49.64%、+ 3285.21%）均大于易感病品种‘双丰’的变化幅度（–22.98%、–28.17%、+ 5.62%、+ 26.18%）,‘左山一’病斑周围组织的ФPSⅡ与rETR高于对照,而‘双丰’低于对照。由此可见,‘左山一’能够较早形成枯斑,快速改变病斑处的荧光参数,并提高病斑周围组织的ФPSⅡ与rETR值,从而增强对霜霉病的抗病性。因此,病斑周围组织的ФPSⅡ与rETR可以作为初步筛选山葡萄抗霜霉病种质的指标。     

猕猴桃花青素合成途径基因AcCHS 和AcLDOX的克隆与表达分析

 根据物种水平上蛋白保守序列设计特异引物,扩增获得‘红阳’猕猴桃花青素合成途径中查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）和无色花青素双加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX）基因的特异片段,用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆出这两个基因的cDNA全长,长度分别为1501 bp（AcCHS）和1381 bp（AcLDOX）,分别编码389个和355个氨基酸。通过比对发现AcCHS与棉花（Gossypium hirsutum）、山茶（Camellia japonica）和黄蜀魁（Abelmoschus manihot）的CHS序列相似性较高,达到95%,与葡萄（Vitis vinifera）和苹果（Malus × domestica）的相似性分别为94%和93%;AcLDOX与山葡萄（Vitis amurensis）和葡葡的相似性分别高达94%和93%。用实时荧光定量PCR分析AcCHS和AcLDOX在‘红阳’（红肉）、‘金魁’（绿肉）和‘金农’（黄肉）3种不同果肉颜色的猕猴桃内果皮中的表达,发现AcCHS的表达量在‘红阳’果实转色期（花后65 d）较高,而在‘金农’开花后表达量呈持续下降趋势;AcLDOX在‘红阳’果实发育早期呈上升趋势,花后65 d后迅速下降,在‘金魁’果实发育后期呈明显上升趋势,在‘金农’开花后呈持续下降趋势。     

菊花叶绿素a/b结合蛋白基因CmLhcb1及其启动子的克隆和表达分析

 以切花菊品种‘公子’cDNA为模板克隆出叶绿素a/b结合蛋白同源基因cab,其开放阅读框为798 bp,编码266个氨基酸。经多物种间比对分析,确认其属于cab基因家族的Lhcb1类,命名为CmLhcb1。同源克隆菊花品种‘清露’Lhcb1基因,氨基酸序列与‘公子’完全相同。CmLhcb1在叶片中的表达量比在茎、花和根中高,弱光和GA₃处理使CmLhcb1表达上调,多效唑处理后CmLhcb1表达量受到抑制。CmLhcb1的表达受昼夜节律调节,白天表达量显著高于夜间。通过high-efficiency TAIL-PCR（hiTAIL-PCR）方法克隆到‘公子’切花菊CmLhcb1起始密码子上游序列715 bp和‘清露’起始密码子上游序列716 bp,序列经PLACE数据库的比对分析,发现有很多与非生物和生物胁迫相关的元件,主要与光照、GA、ABA、水分、水杨酸和病毒相关,CmLhcb1启动子是光诱导型启动子,具有GT1-box和Z-box。     

葡萄SA 和JA 信号转导重要基因克隆及其对外源信号应答分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的叶片为试材,克隆了水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）信号转导途径中重要基因NPR1、PR1、COI1和LOX2,利用定量和半定量PCR法研究其在SA与JA处理后的表达情况,发现PR1特异地受到SA诱导,而施加JA后抑制其表达;LOX2特异地受到JA的诱导,SA处理抑制其表达。上、下游基因的表达情况说明,PR1和LOX2可作为葡萄SA和JA信号转导途径的标记基因,同时研究发现葡萄中NPR1、PR1、COI1和LOX2表达量的快速上升出现在SA和JA处理后6 ~ 24 h;SA与JA信号转导途径存在着协同或拮抗作用,它们之间的相对浓度决定着这种相互关系的变化。     

葡萄果实采后衰老及其相关基因表达的分析

对8 个葡萄品种果实采后衰老情况以及相关基因的表达进行了分析,发现欧美杂交种葡萄‘藤稔’、‘夕阳红’和‘信侬乐’VvNCED1、VvACO1、VvPG 基因表达水平高,葡萄果实耐压力、耐拉力下降明显,落粒数增加,其耐贮性较低;欧亚杂交种葡萄‘红地球’、‘黄意大利’和‘美人指’VvPOD2、VvMnSOD 基因表达水平高,果实的耐压力、耐拉力相对下降较慢,落粒数较低,其耐贮性也较高。表明葡萄贮藏过程中衰老相关基因的表达量能够反映出葡萄的耐贮性好坏。     

葡萄果实β–葡萄糖苷酶基因克隆、原核表达及活性检测

 以‘玫瑰香’葡萄着色期的果肉为试材,通过反转录技术克隆了ABA合成相关酶β–葡萄糖苷酶基因VvBG1的1 518 bp编码区核苷酸序列,其编码1个含有505氨基酸的多肽。生物信息学分析表明,VvBG1含有1个跨膜区和糖基水解酶1超家族保守域。通过BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶将除去信号的编码区克隆到原核表达载体pET28a（+）中,并转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）,成功诱导并纯化了VvBG1融合蛋白。经过透析复性和超滤浓缩得到了0.8 mg · mL^-1可溶的融合蛋白。通过纯化蛋白葡萄果肉均浆液孵育试验和GC–MS ABA含量分析证实了葡萄果实中β–葡萄糖苷酶VvBG1具有较高的生理活性。     

普通白菜1，5- 二磷酸核酮糖羧化/ 加氧酶小亚基基因BcrbcS 的克隆及表达分析

利用RACE 技术，从普通白菜抗霜霉病品种苏州青叶片克隆到1，5- 二磷酸核酮糖羧化/ 加氧酶小亚基（ribulose-1， 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit，BcrbcS）基因的全长cDNA 序列。采用qRT-PCR 分析该基因在普通白菜不 同组织的表达模式。利用SDS-PAGE 技术分析了该基因的原核表达特征。序列分析结果表明，BcrbcS 基因的cDNA 序列全 长为733 bp，其中开放阅读框长度为543 bp，共编码181 个氨基酸，分子质量为20.3×10³ Da，理论等电点为8.23。氨基酸 同源系统进化分析表明，普通白菜BcrbcS 基因与同科植物的进化关系相近。实时定量分析结果表明，BcrbcS 基因在普通白 菜叶中表达最强；在SA 和NaCl 处理下，BcrbcS 基因表达量均在处理24 h 后达到峰值。原核表达载体经IPTG 诱导表达出分 子质量约为20×10³ Da 的融合蛋白。     

CmMLO2：一个与甜瓜白粉病感病相关的新基因

 通过RT-PCR 方法从甜瓜中克隆得到白粉病感病相关基因CmMLO2 的cDNA 序列,GenBank 登录号为 FJ713542。该基因ORF 全长1 713 bp,可编码由570 个氨基酸组成的蛋白质,具有7 个跨膜螺旋结构,属于典型的 跨膜蛋白。RT-PCR 结果表明,CmMLO2 主要在甜瓜叶片中表达,具有组织特异性。在受到白粉病菌胁迫时CmMLO2 表达显著上调,表明CmMLO2 很有可能与白粉病发病有关。构建RNAi 表达载体pFGC1008-CmMLO2 后,利用叶 盘转化法转化甜瓜,获得了PCR 阳性植株,白粉病接种鉴定结果表明,转化植株对白粉病具有抗性,证明通过ihpRNAi 敲除CmMLO2,可以获得对白粉病具有抗性的甜瓜材料。     

植物内生放线菌防治西葫芦白粉病的初步研究

以西葫芦白粉病为对象,通过温室盆栽试验和叶盘筛选试验,从50个内生放线菌菌株中筛选出2个防病效果较好的菌株,叶盘筛选试验发现菌株GKSHJA和PR1-8的无菌滤液原液在接种病菌的同时使用防治效果最佳,分别达到60.98%和63.22%。温室人工接种白粉病菌的盆栽试验发现,GKSHJA无菌滤液原液在接种前、接种后24 h喷雾,相对防治效果分别达55.22%和16.44%;菌株PR1-8的相对防效分别为51.94%和24.39%,且GKSHJA和PR1-8无菌滤液的5倍稀释液在接种病菌的同时使用也有一定的防病效果,其病情指数分别比对照降低了27.81%和30.19%。在自然感病的田间试验中,菌株GKSHJA和PR1-8无菌滤液的5倍稀释液对西葫芦白粉病的相对防效分别达到56.33%和69.88%。这些结果表明,菌株GKSHJA和PR1-8作为防治瓜类白粉病的生防菌株,具有开发应用潜力和前景。     

籽用美洲南瓜白粉病病原菌生理小种鉴定及抗性遗传分析

利用形态学和分子生物学的方法对内蒙古不同地区籽用美洲南瓜白粉病病原菌种类进行鉴定，并采用国际通用的13 个甜瓜生理小种鉴别寄主和鉴别标准体系，对不同地区白粉病菌的生理小种进行鉴定。对20 份籽用美洲南瓜种质的抗病性进行鉴定，并采用苗期人工接种的方法对籽用美洲南瓜六世代群体进行抗性统计分析，开展白粉病抗性遗传研究。形态学鉴定结果表明，籽用美洲南瓜白粉病病菌具有成串的椭圆形分生孢子，具有纤维状体。系统发育树鉴定结果表明该白粉病菌ITS 序列与GenBank 中已公布的瓜类单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）的序列聚在一个分枝，确定内蒙古地区白粉病菌为单囊壳白粉菌P. xanthii。初步确定内蒙古地区籽用美洲南瓜白粉病存在4 个生理小种，分别为小种4、小种2F 和小种1，还有1 个未知的小种。种质抗性鉴定结果表明，20 份籽用美洲南瓜种质中有7 份抗病种质，4 份中抗种质，1 份高抗种质。内蒙古地区籽用美洲南瓜抗白粉病基因由1 对主效隐性单基因控制。     

黄瓜抗白粉病品系cDNA文库构建及EST分析

 采用SMART技术构建了高抗白粉病的黄瓜品系JIN5-508的叶片cDNA文库,并对其进行了质量鉴定。结果表明,该文库的重组率为95.3%,库容量为1.02 × 106 pfu · mL-1,平均插入片段为0.5 kb左右,是一个高质量的cDNA文库。利用该文库随机挑选的8 352个克隆从5′ 端进行单向测序,共获得8 035个有效的ESTs（expressed sequence tags）,序列的平均长度为838 bp。进一步的生物信息学分析表明：EST序列拼接出3 467个unigenes,其中包括953个contigs和2 514条singletons,文库冗余度较低,为56.9%;从文库中筛选出了大量的低丰度表达基因,约占unigene总数的72.5%,说明文库的复杂性较高;1 991个unigenes获得分子功能注释,其中与蛋白结合活性和催化活性相关的基因分别达到了41.34%和38.72%;在获得功能注释的unigene中,有部分抗病抗逆相关基因高丰度表达,其中3个unigenes与拟南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8和Mlo14高度同源,表明该文库可为进一步研究黄瓜抗白粉病相关的特异基因的克隆及功能验证奠定基础。     

农艺措施对酿酒葡萄主要病害的控制作用

研究了农艺措施对酿酒葡萄主要病害的控制作用。结果表明:葡萄展叶后通过清理第一道铅丝(30cm)下枝条,留出通风道口的措施可以很好控制葡萄灰霉病、葡萄白粉病和葡萄霜霉病病情的发生,甚至可以有效推迟病害发生的日期,葡萄白粉病可以推迟1个月左右。     

柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析

以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个Cs WRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。     

柑橘半胱氨酸蛋白酶基因CsCysP的分离、亚细胞定位及表达分析

以‘奥林达’夏橙[Citrus sinensis（L.）‘Olinda’]为材料,采用RT-PCR结合RACE技术从果萼离层中分离到1个半胱氨酸蛋白酶类基因,命名为CsCysP（GenBank登录号：KJ093387）。该基因的cDNA全长为1 485 bp,开放阅读框（ORF）为1 083 bp,推测可编码360个氨基酸残基的多肽。其基因组序列与cDNA比对后显示有3个内含子。分析发现,CsCysP属于papain-like（木瓜蛋白酶,C1A）家族的半胱氨酸蛋白酶,与拟南芥、大豆、烟草、杨树等的同源蛋白有73% ~ 83%的相似性。亚细胞定位结果显示CsCysP蛋白定位在细胞壁上。qRT-PCR结果表明CsCysP在老叶、成熟果实果萼离层和花中的表达量明显高于幼苗的根、茎、叶。CsCysP的表达被脱落酸、高盐和PEG6000诱导,低温、乙烯、芸薹素内酯、水杨酸和甲基茉莉酸可抑制其表达。利用基因工程手段获得了柑橘过表达CsCysP的5个转基因株系。