人工锌指蛋白随机库的构建及其在锌指核酸酶筛选中的应用

利用开源式(Oligomerized pool engineering,OPEN)方法筛选具有较高特异性和亲和性的锌指蛋白(Zinc finger protein,ZFP).以已知三锌指蛋白为框架,使单个锌指关键位点氨基酸编码序列产生随机突变,构建3个人工锌指蛋白随机库,建立和完善应用人工锌指蛋白随机库筛选特异性锌指蛋白的技术平台.以人DYRK1A基因为例,测试和验证该技术平台的可行性和效率,分别获得对DYRK1A基因靶序列中左侧和右侧位点具有较高亲和性的50个三锌指蛋白;然后将得到的锌指蛋白与非限制性核酸内切酶FokⅠ连接,构建DYRK1A锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN),应用酵母验证系统测试DYRK1A锌指核酸酶的活性,结果表明,90％的组装锌指核酸酶能够在靶位点进行切割.     

锌指核酸酶技术在动物转基因中的应用

锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)具有特异性识别并敲除DNA片段中特定基因的特点,通过对DNA片段上的特定基因进行靶向修饰产生新型细胞,是能够应用于动物转基因上的一种新技术.该技术已在一些动物的研究上取得了一定的成果,相对于传统的转基因技术,该技术在简化操作程序、缩短操作时间及提升成功率上都有很大的提高.就常用的动物转基因方法、锌指核酸酶技术的作用原理以及在动物转基因上的应用及其前景进行了论述.     

锌指核酸酶技术在基因治疗中的应用研究进展

锌指核酸酶技术是一种新兴的基因高效靶向修饰和调控技术,目前该技术已在人类疾病的基因治疗中得到应用,通过敲除致病基因使其丧失致病性或者通过修复突变基因使基因表达正常,实现了对多种人类疾病的基因治疗。基于提高锌指核酸酶效率、特异性和降低细胞毒性等方面的研究较少的现状,特就人工锌指核酸酶介导的基因敲除和基因同源重组修复等在人类疾病基因治疗方面的应用及存在问题进行了综述,并对相关研究的开展进行了展望。     

锌指核酸酶及其应用研究进展

锌指核酸酶由锌指和非限制性切割酶两部分组成,锌指能特异性结合基因组双链DNA,非限制性切割酶能造成染色体上双链DNA的断裂,通过机体的修复机制可以使目的基因突变或外源基因插入,进而应用于转基因动物的制备.综述了锌指、切割酶及采用锌指核酸酶制备转基因动物的研究进展,主要包括锌指的发现、结构及与DNA结合时的碱基分布和结合方式,锌指的筛选和设计方法;切割酶的研究进展包括FokⅠ的发现及切割特点,基因修饰后的异源二聚体切割特异性等.     

动物转基因新技术研究进展

 动物转基因技术是将外源基因导入动物体内,外源基因随机整合或定点整合（打靶）在染色体基因组上并得到表达和遗传的生物技术。该技术自发现以来,在畜牧业、医药产业、环境保护以及新型生物材料等领域已得到了广泛应用。本文主要就近年来迅速发展起来的慢病毒载体导入法、精原干细胞法、锌指核酸酶介导的基因打靶、RNA干扰介导的基因沉默等新的高效转基因技术进行了概述。     

基因编辑新技术研究进展

基因编辑是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术,目前主要有人工核酸酶介导的锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)技术和RNA引导的CRISPR-Cas核酸酶(CRISPR-Cas RGNs)技术。它们都能特异性地识别靶位点,对其单链或双链进行精准切割后,由细胞内源性的修复机制来完成对靶标基因的敲除和替换。本文比较了这3种基因编辑技术,并对其应用进展做了介绍。     

水稻锌指蛋白基因OsZRL过表达对根系发育的影响

锌指蛋白是目前研究最为深入的一类转录因子,在植物的生长发育调控中发挥重要作用。本研究克隆了水稻的一个锌指蛋白转录因子基因(OsZRL),并构建OsZRL基因过量表达载体,通过农杆菌介导法转入野生型水稻品种日本晴,获得转基因阳性分化植株。其中一些转基因小苗因根系不能正常发育而死亡,经定量分析这些转基因株系中OsZRL基因表达量显著高于野生型,初步表明锌指蛋白基因OsZRL与水稻根系发育有关。     

小菊'类锌指蛋白'基因植物表达载体构建及对烟草的转化

为了建立耐盐碱小菊(Chrysanthemum morifolium)中克隆到的'类锌指蛋白基因'CmSTZF(DQ864730)的烟草遗传转化体系,并研究其抗逆特性。本研究借助Gateway技术构建了小菊'类锌指蛋白'基因CmSTZF的过量表达载体pH7WG2D-CmSTZF,并以烟草NC89(N.plumbaginifolia'NC89')的叶片为试材,通过农杆菌介导的转化,成功地建立了烟草遗传转化体系,经PCR-Southern鉴定获得CmSTZF的转基因烟草株系。     

猪CFTR基因特异性锌指核酸酶的筛选与鉴定

【目的】获得靶向猪囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因的特异锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN),为建立CFTR基因敲除猪细胞系提供技术支持。【方法】通过开源式(Oligomerized pool engineering,OPEN)方法筛选,首先以已知三锌指蛋白为框架,随机突变单个锌指关键位点氨基酸编码序列,建立人工三锌指蛋白随机库;然后应用细菌双杂交技术,从库中筛选出能够结合CFTR基因靶位点的三锌指蛋白;最后将获得的锌指蛋白与非限制性核酸内切酶FokⅠ组装成特异ZFN,通过酵母验证体系,检测ZFN靶向切割其识别序列的效率。【结果】获得3个人工三锌指蛋白随机库,每个库约含有2×10⁶个单克隆,通过2轮细菌双杂交筛选,分别获得48个针对CFTR基因左右两侧靶位点的三锌指蛋白。ZFN活性验证结果表明,约90%的ZFN能够在酵母细胞内实现靶向切割,获得了高效特异的ZFN。【结论】获得了猪CFTR基因高效特异的ZFN。     

人工锌指蛋白文库的构建

【目的】以猪基因组为模板,扩增天然锌指,以此建立人工锌指蛋白文库,为猪基因组的定点操作及基因表达研究奠定基础。【方法】利用质粒JMB378和JMB440构建锌指文库骨架载体JMB378-ZF1-MCS,然后根据天然锌指蛋白接头序列的保守性,设计5条简并引物扩增猪基因组中的天然单锌指结构域,将其与JMB378-ZF1-MCS载体上的人工锌指ZF1中识别GGC的锌指蛋白连接,构建二锌指蛋白文库,通过酶切方式再将天然单锌指结构域插入到二锌指蛋白文库中,构建三锌指蛋白文库。测定锌指库容量及阳性率,并通过酶切和测序检测锌指库的多样性。【结果】构建了基于猪天然锌指模块的包含ZF1的三锌指蛋白文库,库容量达到1.5×106 CFU。该文库中含有一个人工锌指蛋白ZF1和2个天然型锌指蛋白,能够对基因组中所有以GGC起始的9bp靶序列进行筛选。【结论】构建了基于天然单锌指模块的三锌指蛋白文库,为构建新型锌指蛋白提供了一种可行的方法。     

植物CCCH型锌指蛋白研究进展

锌指蛋白是具有典型锌指结构特征的超蛋白家族,几乎参与了生物体生长发育的各个阶段,其中CCCH型锌指蛋白包含一个或多个由三个半胱氨酸和一个组氨酸组成的基序。本文综述了植物CCCH锌指蛋白的结构、作用方式、功能等方面的研究进展,并对其应用前景进行了展望。     

大豆C2H2型锌指蛋白基因STF-2的克隆及结构分析

大豆是我国重要的粮油经济作物,是众多行业中必需的原材料。锌指蛋白是一种重要的转录因子,其中双锌指的植物C2H2型锌指蛋白多数与植物的非生物胁迫相关,可以利用生物技术手段提高作物对非生物胁迫的耐受能力。该文利用生物信息学和同源克隆的方法克隆得到了大豆C2H2型锌指蛋白基因STF-2,并且利用软件对其蛋白结构进行了初步分析。     

玉米锌指蛋白基因ZmAN14过表达转基因烟草对非生物胁迫的响应

【目的】ZmAN14是玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族成员,该家族在水稻中广泛参与非生物胁迫应答。通过分析玉米旱21（H21）及转ZmAN14烟草在非生物胁迫下的表达情况,为玉米ZmAN14及其家族的功能和分子机制的全面解析提供新信息。【方法】通过对ZmAN14进行序列分析,发现其属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。以玉米自交系H21为研究材料,在三叶期时对其进行非生物胁迫和ABA诱导处理,0、1、3、6、12和24 h时取整株样品,同时在玉米不同生长期取根、茎、叶、胚芽鞘、雌蕊、雄蕊、花丝、苞叶等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法对ZmAN14的组织表达谱和非生物胁迫及ABA诱导的表达谱进行分析,并结合启动子区顺式作用元件分布情况进行对比分析。将ZmAN14编码序列克隆至GFP表达载体pMDC85,利用亚细胞定位技术验证ZmAN14在胞内的定位情况。将ZmAN14克隆至GAL4 DNA结合结构域载体,并转化酵母,将其涂布在缺陷培养基上观察酵母生长情况,分析其有无转录激活活性。将ZmAN14编码区与植物表达载体p1300-221连接构建超表达载体,并将其转入烟草,选择ZmAN14 mRNA 表达量高的T₂纯合体株系进行盐、干旱胁迫和ABA诱导,观察其对非生物胁迫的应答。【结果】序列分析表明,ZmAN14开放阅读框（ORF）为516 bp,编码一个171个氨基酸的蛋白,预测分子量为18.3 kD,等电点是8.28。ZmAN14具有A20和AN1结构域,属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。实时定量荧光PCR结果表明ZmAN14在叶中大量表达,受NaCl、干旱胁迫和ABA诱导上调。ZmAN14与GFP融合蛋白定位于细胞质和细胞核中,定位结果与ZNF216 和ZmAN13类似,而ZmAN14本身并没有核定位信号,暗示ZmAN14与其他蛋白结合进入细胞核中发挥其生物学功能。ZmAN14在酵母中表达时不能在酵母缺陷培养基（SD/-Leu-His medium）上生长,因此,未发现其具有转录激活活性。将ZmAN14在烟草中过表达会增加烟草苗期对盐和干旱的抗性。【结论】ZmAN14属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。ZmAN14主要在叶中表达,受非生物胁迫和ABA诱导,在烟草中过表达可以提高烟草苗期对盐和干旱的抗性。ZmAN14可能通过与其他蛋白的互作行使功能。相比较于其他的A20/AN1型锌指蛋白,在转基因烟草中,ZmAN14也参与非生物胁迫应答。ZmAN14与ZmAN13具有高同源性,但在盐和干旱胁迫时,二者却具有向反方向调控的功能。     

锌指蛋白转录因子Di19参与调控大豆干旱响应的研究进展

干旱是人类面临的最主要自然灾害之一,是影响农作物生产最主要的环境因素。锌指蛋白指含有锌离子、具有手指状结构域的一类蛋白质,是植物中发现种类最多、调控作用最显著的一类转录因子,在植物干旱响应中发挥重要作用。Di19是最新发现的一类小分子锌指蛋白,其含有两个C2H2型锌指结构域,受干旱和高盐诱导,在植物的抗旱响应中起积极作用。大豆根系不发达,需水量多,对干旱敏感,水分亏缺是制约其产量提高和品质提升的最重要环境因子。本文评述了大豆耐旱性研究现状,锌指蛋白及其家族最新成员Di19在大豆耐旱性响应过程中发挥的作用,以期为大豆耐旱性改良提供参考。     

拟南芥Atfin1锌指蛋白的细胞定位

[目的]确定拟南芥锌指蛋白基因Atfin1的效应部位。[方法]用Trizol提取拟南芥叶片的总RNA,根据GeneBank数据库中Atfin1cDNA全序列设计引物,进行Atfin1的PCR扩增,克隆Atfin1基因,并进行同源性比较,构建pBI-Atfin1-EGFP融合表达载体,对Atfin1进行定位。[结果]克隆得到的拟南芥Atfin1蛋白氨基酸序列同紫花苜蓿Atfin1蛋白氨基酸序列的同源性达78.60%,在接近C-末端区域形成锌指结构的8个氨基酸残基高度保守,与周围的氨基酸残基共同形成典型的C4HC3基序。融合有Atfin1的绿色荧光蛋白只在细胞核区域表达,而未做融合的绿色荧光蛋白在整个细胞内呈弥散状分布。Atfin1没有典型的核定位信号,但仍然能够准确地在细胞核内表达。[结论]Atfin1在细胞核内表达,符合作为转录因子的表达特征。     

CRISPR/Cas9技术在家禽育种方面的应用

作为一种重要的基因工程技术,基因编辑自出现以来一直倍受关注.近年来,基因编辑技术发展更为迅速,从锌指核酸酶技术(ZFN)的开发利用到转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术的熟练运用,再到规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)技术的发现,基因编辑技术在不断地自我更新和完善的过程中推动着生命科学的发展和进步.综述了...