辣椒GMS育性相关miRNA的鉴定和表达分析

研究辣椒花药中sRNA分布,筛选育性相关miRNA,通过miRNA及其靶基因的表达分析探讨miRNA对雄性育性的调控。利用高通量测序技术对辣椒细胞核雄性不育两用系处于小孢子单核靠边期的花药进行sRNA测序,同时分析两材料间miRNA的表达差异。通过qRT-PCR技术验证差异分析结果,并对miRNA及其靶基因在小孢子发育不同时期的表达模式进行分析。在构建的不育株和可育株两个文库中共发掘出857个可信度高的miRNA;筛选得到42个表达差异显著的miRNA;通过靶基因预测与注释,预测出的差异表达miRNA的靶基因中与繁殖有关的基因有152个,与生殖过程有关的基因有151个。通过qRT-PCR验证了选出的9条miRNA的存在,其表达差异与测序分析结果基本一致;单核靠边期多数miRNA负调控其靶基因,不同发育时期其调控模式会发生变化。本研究为揭示辣椒miRNA与雄性育性的关系提供了重要信息。     

基于microRNA深度测序的猕猴桃性别分化初探

利用新一代高通量测序技术,对猕猴桃雌花和雄花中表达的小RNA进行了测序,分别得到雌花18 408 610条序列和雄花11 191 469条序列。通过生物信息学分析,共鉴定和预测得到39个保守miRNA家族和400个新的miRNA家族,其中有170个miRNA家族在雌、雄花样品间显著差异表达。对差异表达miRNA进行靶基因的预测及注释,结果显示,靶基因产物具有包含核苷三磷酸水解酶的磷酸环结构域的miRNA数量最多。在猕猴桃25号连锁群（Chr25）上共预测得到3个miRNA,其中novel-ach-miR362的靶基因Achn298021可能与猕猴桃花的性别发育有关。     

microRNA参与柑橘生长发育和抗逆的研究进展

microRNA(miRNA)是在转录后水平调控基因表达的一类非编码的小分子RNA。植物miRNA最早于2002年在拟南芥中发现,柑橘miRNA的研究始于2005年,现已发现了许多保守的miRNA和新的miRNA。对参与柑橘生长发育及对生物学胁迫和非生物学胁迫应答过程的miRNA进行了归纳,并对cis-miR156、cis-miR396和cis-miR3954在柑橘中的功能研究进行了总结。与模式植物和大田作物相比,柑橘miRNA的功能研究相对滞后,新发现miRNA的功能有待深入研究。最后对利用柑橘特异的病毒载体和基因定点编辑技术加快柑橘miRNA功能研究进行了展望。     

梨花芽休眠相关miRNA的鉴定和差异表达分析

为了探究梨花芽休眠进程中miRNA的表达模式和靶基因,利用Solexa测序技术、生物信息学分析和实时荧光定量PCR（qPCR）技术,对内休眠、内休眠解除和生态休眠解除3个时期梨花芽的miRNA进行高通量测序、筛选和鉴定。结果表明,内休眠、内休眠解除和生态休眠解除时期3个样本文库中分别有12 276 226、10 135 952、11 453 981条Unique序列。miRNA主要分布在21 ~ 24 nt之间,其中长度为24 nt的数量最多。共检测到151个已知的miRNA,属于39个不同的家族,并利用生物信息学软件预测到了209个新的miRNAs。比较分析从内休眠进入到生态休眠解除的整个休眠转换时期差异表达的miRNA,筛选出8个miRNA（ahy-miR156b-5p、cpa-miR319、aly-miR172c-3p、aau-miR396、mdm-miR858、aly-miR171b-3p、bdi-miR160f和hbr-miR166a）,其靶基因主要参与转录调控、信号传导等过程。利用qPCR验证了8个miRNA及其8个靶基因的表达。     

番茄茉莉酸缺失突变体灰霉菌侵染响应miRNA及其表达分析

为揭示miRNA对番茄灰霉菌胁迫的响应机制，以番茄茉莉酸（JA）缺失突变体def1、spr2及其野生型（CM）为试验材料，构建了3个材料接种灰霉菌前后（0 h、48 h）2个时期的miRNA文库，并采用Illumina平台测序，对测序数据进行生物信息分析，结合实时荧光定量检测目的miRNA及其预测的靶基因表达情况。结果表明灰霉菌侵染番茄后，JA缺失突变体def1和spr2的病情指数显著高于CM，H2O2含量低于CM。高通量测序鉴定了130个已知miRNA和811个新miRNA。进一步筛选出8个保守miRNA（Sly-miR156e-3p、Sly-miR166c-5p、Sly-miR171f、Sly-miR172b、Sly-miR319a、Sly-miR390b-5p、Sly-miR399b、Sly-miR482d-5p），其在6个样本中表达模式各异。预测差异miRNA靶基因122个，结合qRT-PCR技术分析了8个miRNA和8个靶基因的表达情况，与高通量测序结果基本一致。推测Sly-miR156e-3p、Sly-miR390b-5p、Sly-miR399b、Sly-miR482d-5p通过依赖JA信号途径参与番茄对灰霉病的抗性。     

库尔勒香梨9个新miRNA克隆鉴定

利用在小RNA高通量测序试验中筛选出的脱萼组与宿萼组差异表达新miRNA基因,采用 Stem-loop法对总体表达量居前20位、在脱萼组和宿萼组中具有显著性差异表达、在子房和萼片组织中具有显著性差异表达的新miRNA进行成熟体的克隆鉴定、前体序列二级结构分析、qRT-PCR试验以及靶基因预测。结果显示,在不同的样本中有9个新miRNA（novel_miRNA）的成熟体序列以及4个novel_miRNA的表达量与高通量测序结果完全一致,并且预测得到大量具有生物学功能的靶基因。新发现的miRNA可能与‘库尔勒香梨’萼片脱落和宿存有密切关系。     

辣椒(Capsicum annuum L.)果实发育及品质相关新microRNA的鉴定与分析

MicroRNA(miRNA)是一种非编码的小RNA,在各种生物过程中起着重要的调节作用。前人研究表明,模式植物中miRNA与果实发育相关。然而,人们对辣椒(Capsicum annuum L.)果实品质及发育相关的miRNA了解尚不清楚。本研究利用二代测序技术(Next-generation sequencing technology)比较了不同品种辣椒果实在不同发育时期的小RNA。利用miRDeep2软件从4个样本中共鉴定出了59个已知miRNA和310个新miRNA。预测了新miRNA的靶基因,共656个,并对其中402个靶基因进行了注释。GO分析和KEGG途径表明,某些靶基因与淀粉糖、氨基糖以及核糖代谢相关。qPCR表明一些miRNA的表达模式与其靶向基因相反,该结果为今后研究miRNA调控果实发育和品质形成提供了重要基础。     

基于高通量测序发掘番木瓜果实成熟相关miRNA

【目的】番木瓜是典型的呼吸跃变型果实,外源乙烯处理使番木瓜呼吸跃变提前,促进果实成熟。分离番木瓜果实成熟相关miRNA,为深入了解呼吸跃变型果实的成熟分子机制奠定基础。【方法】利用高通量测序技术对乙烯(ETH)、1-MCP和清水对照(CG)处理的番木瓜果实进行miRNA和转录组高通量测序,然后对测序获得数据进行生物信息学分析,进行miRNA鉴定和靶基因预测,并与转录组测序结果进行关联分析。【结果】乙烯、1-MCP和对照处理分别获得10 734 196、16 486 803和16 067 290条纯净序列,共鉴定出523个miRNA。其中,已知miRNA个数为1-MCP(303)、CG(214)和ETH(239),新miRNA个数为1-MCP(184)、CG(188)和ETH(114)。与对照相比,在乙烯处理中上调和下调表达的miRNA分别是123和72条。靶基因预测共获得5 053个靶基因,KEGG功能富集分析显示它们参与了戊糖、葡萄糖醛酸转换、淀粉和蔗糖代谢、卟啉和叶绿素代谢、类胡萝卜素合成等代谢途径。筛选出的番木瓜果实成熟衰老相关候选miRNA,包含4个果实软化调控相关miRNA(miR167-y、miR4993-x、miR3946-x和miR5059-x)、3个果实颜色调控相关miRNA(miR4993-x、miR815-y和miR7810-x)、3个激素调控相关miRNA(miR4993-x、miR8004-x和miR9722-x)和4个转录因子调控相关miRNA(miR5641-y、miR9722-x、miR838-y和miR319-y)。【结论】筛选的番木瓜果实成熟衰老相关miRNA为今后果实成熟衰老调控网络研究提供了可能的线索。     

利用转录组信息揭示刺芹侧耳单核和双核菌丝中小RNA的表达差异

利用Illumina HiSeq 2500高通量测序平台,对刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)双核菌株‘杏韩’及其原生质体单核化菌株‘181’和‘183’菌丝的小RNA文库进行测序分析。将测序获得的高质量reads与Rfam数据库和刺芹侧耳基因组测序数据进行比对,发现来源于rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等非编码RNA的reads占47.4%,来源于mRNA降解的reads占15.5%。将剩余的37.1%reads与miRBase数据库比对,发现946条小RNA匹配数据库中其他物种的成熟miRNA。进一步对这些小RNA在单核菌株和双核菌株中的表达量进行比较,发现双核菌株中高表达量的小RNA比单核菌株中多19.4%。单核和双核菌株差异表达小RNA分析结果显示,单核菌株中只有39条小RNA表达量上调,而双核菌株中有196条小RNA表达量上调。     

金星无核与其短节间突变体紫金早生的节间长度差异机制初探

【目的】探索金星无核短节间突变体紫金早生节间长度短缩的形成机制。【方法】以金星无核(JXWH)及其短节间突变体紫金早生(ZJZS)为研究材料,借助扫描电镜、LC-MS/MS和高通量测序分析两种材料在细胞形态、内源激素含量和miRNA上的差异。调查外源激素处理(JA及其合成抑制剂DIECA)下突变体节间长度的变化。【结果】紫金早生节间长度和节间细胞数量显著低于金星无核;紫金早生中JA、JA-ILE和SA含量显著提高,而ICA和ICAld含量显著降低;小RNA测序结果发现2种材料中共有21个差异miRNA,GO注释分析发现它们主要参与细胞分裂、茉莉酸代谢、蛋白代谢、环境应答和器官发育等过程。外源DIECA处理后,紫金早生节间伸长,外源JA处理抑制了紫金早生节间长度的伸长。【结论】紫金早生短节间突变性状与茉莉酸信号通路的调节有关,茉莉酸可能受miR319的调控。     

Cloning and identification of novel miRNAs in the flower organs of Korla fragrant pear at anthesis

The objective of the study was to learn more about some newly identified miRNAs related to calyx persistence in Korla fragrant pear (Pyrus sinkiangensis Yu). Small RNAs were subjected to high-throughput sequencing after extraction from the ovaries and sepals of flowers with either a deciduous or a persistent calyx. Differentially expressed miRNAs were screened, and 73 new miRNAs were obtained. Twenty of these new miRNAs were selected to further validate all of the new miRNAs. Their mature miRNAs were cloned and identified, the secondary structures of the precursor miRNAs (pre-miRNAs) were analysed, and then qRT-PCR analysis was conducted. The results showed that the mature sequences of nine new miRNAs (novel_miRNA) in different samples were consistent with the results of high-throughput sequencing. Overall, this study improved current methods for the molecular cloning and identification of fruit tree miRNA. Nine new miRNA types were identified. This study laid a good foundation for elucidating the biological functions of these new miRNAs.     

Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small non-coding RNAs with a critical role in development and environmental responses. Efficient and reliable detection of miRNAs is an essential step towards understanding their roles in specific cells and tissues. However, gel-based assays currently used to detect miRNAs are very limited in terms of throughput, sensitivity and specificity. Here we provide protocols for detection and quantification of miRNAs by RT-PCR. We describe an end-point and real-time looped RT-PCR procedure and demonstrate detection of miRNAs from as little as 20 pg of plant tissue total RNA and from total RNA isolated from as little as 0.1 μl of phloem sap. In addition, we have developed an alternative real-time PCR assay that can further improve specificity when detecting low abundant miRNAs. Using this assay, we have demonstrated that miRNAs are differentially expressed in the phloem sap and the surrounding vascular tissue. This method enables fast, sensitive and specific miRNA expression profiling and is suitable for facilitation of high-throughput detection and quantification of miRNA expression.     

花椰菜中器官早期发育调控相关的miRNA(Bra-miR07)的克隆及功能研究

在前期通过高通量小RNA测序获得若干在花椰菜器官早期发育过程中呈现差异表达的未知功能miRNA基础上,重点对其中1个在花椰菜下胚轴和子叶中表现为显著差异表达的miRNA(命名为Bra-miR07)进行克隆鉴定及功能分析。研究表明,Bra-miR07前体序列全长为270 bp,可形成稳定的二级发夹结构。Bra-miR07在花椰菜子叶中呈现显著高表达。进一步构建了Bra-miR07的过表达载体并采用浸花法转化拟南芥,获得Bra-miR07过表达的转基因拟南芥株系。表型分析显示,Bra-miR07过表达可显著影响拟南芥植株生长。与野生型相比,过表达Bra-miR07株系表现为生长缓慢,植株矮小,育性降低等发育受阻特征。因此,上述结果预示着Bra-miR07可能也在花椰菜器官发育过程中发挥重要作用。     

柑橘病毒类病害诊断技术研究进展

柑橘病毒类病害对世界柑橘产业造成了严重的损失。诊断技术是防控柑橘病毒类病害的重要保障。对指示植物鉴定、电镜技术、血清学方法、核酸杂交、（RT-）PCR以及新近出现的环介导恒温扩增、基因芯片和高通量测序等技术在柑橘病毒类病害诊断中所取得的进展进行综述,并对今后的发展方向进行了展望,旨在为更好地防治柑橘病毒类病害提供借鉴。     

植物环状RNA研究进展

环状RNA(circularRNA,circRNA)是一类经反向剪接后、由3′末端和5′末端共价结合形成的单链非编码RNA分子,广泛存在于多种生物体中,具有结构稳定、细胞或组织特异性等特征。circRNA具有多种功能,可作为miRNA"海绵"调控miRNA表达;促进来源基因转录;通过与蛋白互作参与相关途径调控等。多种植物circRNA的研究结果暗示其在生物胁迫、非生物胁迫及生长发育中发挥重要作用。对植物circRNA分子特征和作用机制的研究现状进行综述,并结合动物中circRNA的研究进展,讨论植物circRNA的潜在作用机制,并提出植物中尚未解决的问题及其未来的应用前景。     

施用不同根际促生菌对辣椒生长和土壤微生物群落的影响

以辣妹子和新羊角为试材,采用盆栽试验方法和高通量测序技术,研究了施用根际促生菌对辣椒生长和根际微生物群落的影响.结果表明,P1贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株对2个品种辣椒植株株高、干质量、叶片叶绿素含量、植株全氮和全磷含量的促进作用均显著高于其它4个菌株处理,并改变了根际土壤细菌和真菌群落...     

根际微生物防治土传病害研究进展

摘要：土传病害是世界性的难题，为了解决化学杀菌剂对环境的破坏以及病原菌抗性增强的诸多问 题，利用植物根际微生物防治土传病害已成为近年来的研究热点。通过对根际微生物的种类、防治土传 病害的机理的综述，指出在研究方法上要加强高通量测序技术、宏基因组学、生物信息技术的应用，同 时研究探索更有效的菌株分离培养技术；在生产实际中要在考虑菌群协同作用的基础上提高生防菌的杀 菌效率，以期为正确利用根际微生物促进植株营养吸收、抵抗土传病害、适应环境胁迫，促进农业可持 续发展提供研究思路。     

简化基因组测序技术在观赏植物中的应用研究进展

简化基因组测序（Reduced-representation Genome Sequencing，RRGS）是在二代高通量测序技术上，通过限制性内切酶对基因组进行打断，对基因组特定区域进行高通量测序，得到大量遗传多态性标签序列，进而展现整个基因组序列特征的技术。该方法建库过程简单，费用较低，能有效降低基因组复杂度。目前简化基因组测序已广泛应用在观赏植物分子标记开发、群体遗传及系统发生学、高密度遗传图谱构建、数量性状定位等研究中。综述了简化基因组测序技术原理及其在观赏植物中的研究进展，并讨论了研究中所存在的问题及对其发展前景进行了展望。     

病毒诱导的基因沉默在植物中的应用现状

传统的病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)是一种小干扰RNA(Small interfering RNAs,siRNA)介导的RNA沉默技术(SIR VIGS),作为一种有效的反向遗传学技术广泛的用于植物基因组功能的鉴定。另外,VIGS技术开始用来研究植物内源miRNA(microRNA)的功能,这为miRNA的功能研究提供了快速有效的方法。随着基因沉默技术的应用和改进,将会有越来越多的植物基因组功能得到快速有效的验证。