过量表达小麦超氧化物歧化酶(SOD)基因对烟草耐盐能力的影响

利用前期克隆的小麦超氧化物歧化酶(SOD)基因TaSOD1.1和TaSOD1.2, 构建融合上述基因编码阅读框(ORF)的双元表达载体。采用农杆菌介导的遗传转化技术, 获得了过量表达TaSOD1.1和TaSOD1.2的转基因烟草植株。研究表明, NaCl处理下, 与对照相比, 转基因植株伤害较小, 叶片失绿面积较少, 植株长势明显增强, 叶片的SOD活性均明显提高, 而MDA含量明显降低。转基因植株的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量, 以及可溶性糖和可溶性蛋白含量也表现与SOD活性相同的趋势。表明在烟草中高表达小麦TaSOD1.1和TaSOD1.2基因, 通过外源基因在转录水平上的调节, 能增加植株SOD活性, 减轻盐分胁迫造成的细胞膜质过氧化, 增强植株抵御盐分胁迫的能力。     

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础.     

转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

AREB/ABFs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应。为了获得具有较高耐盐水平的棉花新种质材料,通过农杆菌介导法将耐盐转录因子基因(GHABF4)导入陆地棉中棉35中,通过对转化植株的卡那霉素初步筛选及T1、T2、T3目的基因PCR的分子检测,获得T3转基因棉花纯合系。通过盐胁迫试验对5个T3转基因棉花株系和非转基因棉花对照进行耐盐性分析。结果表明,在200 mmol/L Na Cl胁迫下,与非转基因对照相比,5个转基因棉花株系株高提高2.5~4.4 cm,地上部分的鲜质量增加3.6%~11.8%;且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量提高。在盐胁迫条件下,转GHABF4基因棉花表现出优良的生长和生理优势,转GHABF4基因能够提高棉花的抗盐能力。     

过量表达棉花GhACO2基因增强拟南芥抗逆性研究

乙烯在植物生长发育过程中起到非常重要的作用,ACO基因对于细胞内乙烯的合成起到关键的作用,然而乙烯在植物响应非生物胁迫方面的功能有很大的未知性。研究通过PCR方法从棉花基因组中克隆获得GhACO2基因,构建了植物过量表达载体p35S::GhACO2,通过花序侵染法转化拟南芥,用卡那霉素对转化植株进行初步筛选,进一步对阳性植株进行PCR和GUS组织化学分析检测,结果表明,在转基因拟南芥叶片中有很强的GUS活性,茎和根有微量表达;GhACO2基因已经整合到拟南芥基因组中,成功获得转基因拟南芥。经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株,利用NaCl和PEG6000对T2代植株进行盐胁迫和干旱胁迫处理,结果显示,与野生型拟南芥相比,转GhACO2基因拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性显著性的增强。研究结果为进一步探讨GhACO2的生物学功能和利用基因工程技术进行转基因育种质奠定了基础。     

拟南芥转录因子NAC103在内质网胁迫应答中的抗性分析

环境胁迫是影响粮食产量和品质的重要因素,在内质网胁迫条件下构建植物基因调控网络有利于粮食增产。为了分析拟南芥内质网胁迫应答过程中转录因子NAC103的生物学功能,本研究利用RNAi技术筛选到NAC103低量表达植株,并利用之前发表过的NAC103过量表达植株,发现低量和过量表达NAC103的转基因植株在内质网胁迫应答中具有不同的表现型。我们统计分析了含有真叶植株、只有子叶植株和没有子叶植株的百分率,结果表明:与野生型拟南芥相比,过量表达NAC103转基因植株对内质网胁迫的耐受性更高,而低量表达NAC103转基因植物对内质网胁迫更敏感。因此,拟南芥转录因子NAC103在抵御内质网胁迫的抗性应答中具有重要作用。     

玉米光敏色素A1基因(ZmPHYA1)在棉花中的转化及分子鉴定

为评价玉米ZmPHYA1基因在棉花种质资源改良中的价值,本研究利用农杆菌介导法在陆地棉(Gossypium hirsutum)R15材料中进行了玉米ZmPHYA1基因的遗传转化。经过愈伤组织诱导、抗性愈伤筛选、体细胞分化诱导后获得棉花转基因再生植株。通过田间草铵膦除草剂筛选鉴定抗性植株,并利用PCR扩增其草铵膦抗性基因和目的基因ZmPHYA1进行分子鉴定,发现阳性植株对草铵膦除草剂具较好抗性,并可扩增到256 bp的草铵膦抗性基因和217 bp ZmPHYA1基因的特异条带。进一步通过免疫印迹检测表明,3个不同转基因株系中外源ZmPHYA1基因可正常表达约170 kD大小的蛋白,且在不同组织中该外源蛋白均可正常表达。此外,对转基因植株的不同农艺性状分析表明,转基因株系株高明显低于受体对照,而铃重和纤维长度等性状无明显差异。本研究成功获得具有草铵膦抗性和外源ZmPHYA1基因的棉花新种质材料,为进一步利用光敏色素基因创新种质资源提供了材料来源。     

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达分析

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus) Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。     

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus)Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明,Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。     

转外源Trxs基因大麦耐盐性有关生理生化特性分析

以过量表达硫氧还蛋白s基因(Trxs)的转基因大麦株系(LSY-11-1-1)及其非转基因对照(CK)为试验材料,研究了50mmol/L盐胁迫条件下,Trxs过量表达对大麦幼苗耐盐性有关生理生化特性的影响.结果显示:盐胁迫下转基因大麦的鲜重与干重高于对照,而丙二醛(MDA)与羰基含量低于对照.盐胁迫下转基因大麦幼苗叶片的过氧化物歧化酶(SOD)活性与过氧化氢酶(CAT)活性普遍高于对照.转基因大麦类囊体中铁蛋白大量积累的持续时间比对照长.由此可以推测,Trxs至少可以通过两条途径缓解盐胁迫对大麦幼苗生长的抑制作用:一方面增强抗氧化酶活性、有效清除过量产生的活性氧;另一方面能促进铁蛋白含量的增加、抑制Fenton反应来减少活性氧的过量产生,从而赋予转基因大麦幼苗更强的抗盐胁迫能力.     

异源表达盐单胞属(Halomonas)周质磷酸盐结合蛋白基因PBP降低转基因烟草砷积累研究

为探讨PBP基因在异源烟草中的生物学功能,筛选出低砷(As)积累亲本烟草种质。以转PBP基因烟草T₂代种子和野生型烟草(Nicotiana tabacum K326)种子为材料,利用Real-time PCR分析外源PBP的时空表达模式,测定As胁迫下转基因烟株抗氧化酶(AOEs)活性变化及分析转基因烟草株系中As积累差异。AOEs活性测定表明,As胁迫第5天时CK植株中SOD和POD酶活性达到极值,分别为80.25 U/g和152.02 U/g,显著高于转基因植株;在胁迫后期(3～5 d) CK植株中H₂O₂和MDA含量也显著高于转基因植株。另外,在第7天和14天时转基因植株中As含量比CK植株均显著降低。离子转运蛋白基因表达分析表明,As胁迫不仅诱导转基因植株PBP基因表达显著上调,而且也引起转基因和CK植株中HAK1和PHT4等通道蛋白基因的显著上调,且CK植株中HAK1和PHT4的平均表达水平为转基因植株的1.5倍和3.75倍。外源PBP基因导入可有效降低转基因烟草对As的积累。     

AtDREB1A基因过量表达对马铃薯生长及抗非生物胁迫基因表达的影响

为明确AtDREB1A基因过量表达对马铃薯生长及基因表达的影响,以马铃薯品种陇薯3号(L3)及其AtDREB1A转基因株系T2为材料,采用盆栽试验,在马铃薯盛花期将盆土含水量控制为田间最大持水量(FWC)的45%～50%,观察转基因前后植株表型,并研究叶片MDA含量、RWC、SOD和POD活性及其基因表达的差异。结果表明,正常浇水条件下2个株系各指标差异不大。胁迫20 d后,转基因植株T2的表型明显好于对照L3,且RWC显著高于L3;各株系叶片的MDA含量、SOD和POD活性均明显上升,但转基因植株MDA含量上升幅度较对照小,抗氧化保护酶SOD、POD活性升高幅度较对照大,说明转基因植株细胞膜损伤和膜脂过氧化程度较轻,植株的耐旱性明显提高。转录组测序及生物信息学分析发现,转基因材料T2相对于L3的差异表达基因共430个,其中上调表达基因287个,下调表达基因143个。功能注释和显著性富集结果表明,差异表达基因富集涉及GO功能分类体系中生物过程、细胞组分和分子功能3个大类别,且大部分集中在细胞内和膜上,主要涉及信号传导、氧化还原、生物调解、应激反应、发育过程、系统免疫过程、核酸和蛋白结合转录因子活性、转运活性及催化活性。其中抗非生物胁迫相关蛋白PPR、HSP、P450、MLO等家族的大量基因表达量发生较大变化,说明这些基因在转AtDREB1A基因马铃薯抵御干旱过程中发挥着非常重要的作用。本研究为进一步解析AtDREB1A基因提高马铃薯抗旱性的调控网络奠定了基础。     

转G10eve基因棉花的获得及草甘膦抗性初探

【目的】为培育高抗草甘膦棉花新品种提供种质材料。【方法】对草甘膦抗性基因G10eve进行生物信息学分析,利用农杆菌介导的方式将G10eve导入到珂字棉312中。利用PCR(Polymerase chain reaction)、qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)方法分析G10eve的表达情况。对受体及转基因植株进行草甘膦喷施实验,测定其莽草酸含量,分析其抗性水平。【结果】最终获得28个独立的转基因阳性系,转化率及幼苗分化率分别高达49.3%、40.6%。PCR及qRT-PCR检测证明外源G10eve基因已经整合到棉花基因组中,且在不同转基因株系间表达量差异显著。在子叶期,转基因植株可耐受8 mL·L~(-1)浓度的草甘膦,而非转基因对照在2 mL·L~(-1)浓度草甘膦处理下已出现药害。草甘膦处理前后,转基因植株叶片莽草酸含量未出现明显积累,进一步说明其具有草甘膦抗性。【结论】过量表达G10eve基因能够提高受体材料对草甘膦的抗性,获得了高抗草甘膦的棉花株系。     

水稻BZIP类转录因子在逆境胁迫下的作用

BZIP类转录因子在植物的逆境胁迫下起着重要作用。本研究构建水稻转录因子OsBZIP88过量表达载体pHB-Osbzip88和干涉载体RNAi-Osbzip88,通过遗传转化获得转基因植株,并对转基因植株在逆境胁迫下的表型鉴定。结果表明,过表达转基因植株抗胁迫能力高于野生型和干涉转基因植株。对OsBZIP88定量表达实验表明:OsBZIP88在水稻各组织中均有不同程度表达,且在叶片中表达量最高。本研究初步探明水稻转录因子OsBZIP88在水稻逆境胁迫应答中具有重要的作用,过量表达转录因子OsBZIP88能够增强水稻的抗逆能力。研究结果为进一步了解BZIP类家族基因和挖掘水稻抗逆基因提供了一定的依据。     

转MvNHX1和MvP5CS基因棉花耐盐抗旱性比较与育种价值分析

通过对花粉管通道法获得的T7转MvNHX1基因的10个棉花株系和转MvP5CS基因的3个棉花株系与对照非转基因棉花D5在温室内盐和干旱胁迫下的发芽率、生理生化指标以及田间花期干旱胁迫下农艺性状和纤维品质进行分析发现:温室内盐和干旱胁迫后,转基因棉花叶片叶绿素含量、脯氨酸含量均高于对照,而丙二醛含量低于对照;田间花期干旱胁迫下,2种转基因植株果枝数、有效果枝数、铃数、有效铃数、铃重、子棉、皮棉、衣分、子指和衣指均高于对照,说明转MvNHX1基因和转MvP5CS基因植株在干旱逆境下的产量高于非转基因;经花期干旱胁迫后,2种转基因棉花的纤维断裂伸长率、短纤维率、马克隆值和纺纱一致性指数优于非转基因棉花D5。综合分析表明:2种转基因棉花的耐盐抗旱性均有提高,其中转MvNHX1基因棉花的耐盐性优于转MvP5CS基因棉花植株,而转MvP5CS基因棉花植株的抗旱性优于转MvNHX1基因棉花植株。     

p5CS基因在蒙农杂种冰草植株中的表达及耐盐性研究

为尽快培育出适宜我国干旱荒漠地区大面积推广的耐盐冰草新品种,试验以经PCR和Southern blot杂交检测的含有p5CS基因的蒙农杂种冰草植株为材料,用Northern blot检测目的基因在转化植株中的表达;并用1.5%NaCl盐溶液进行胁迫处理确定转化植株的耐盐性。结果表明:转基因冰草植株与DIG标记探针杂交呈现明显的杂交带;盐胁迫下,游离脯氨酸含量增加较快,质膜透性、丙二醛含量增加较小,SOD活性较高。说明p5CS基因能够在冰草基因组的转录水平上表达,表达植株的耐盐性明显增加。     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。     

干旱及复水条件下转基因甘薯抗氧化防御系统特性

以转铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因甘薯(TS)及未转基因甘薯(NT)为实验材料,研究在旱后复水条件下转基因甘薯及未转基因甘薯抗氧化防御系统变化。结果显示,连续36h胁迫条件下,TS和NT的SOD活性都先降低后升高,但TS的SOD活性始终高于NT。胁迫至24h时,TS的SOD活性约为NT的1.2倍,复水后二者SOD活性都下降。持续胁迫时,TS的APX活性先升高后降低,NT与之相反,复水后TS和NT的APX活性都是先升高后降低,复水12h,TS的APX活性是NT1.5倍。在水分胁迫条件下,TS抗氧化物质AsA、CAR增长速度较快,复水后,TS中的AsA含量仍显著高于NT水分胁迫条件下TS的膜质受伤害程度要轻于NT,胁迫24h,复水12h,NT的MDA含量均约为TS的1.2倍。实验结果表明,同时转入SOD、APX抗氧化基因后,在胁迫及复水条件下转基因甘薯的抗氧化系统可以更好的对植株体进行保护及修复。     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。     

转il-4基因番茄的分子检测及田间分析

通过花粉管通道介导il-4基因转化番茄L402、中疏4号、强力米寿和大黄4个品种.利用PPT抗性筛选、PCR扩增、PCR-Southern杂交和Western技术,对il-4基因转化番茄的后代进行检测,并对il-4基因在T3代番茄中的传递规律、T3代植株的田间表现进行调查.研究结果表明,T3代植株中il-4基因的分离情况不符合阳性植株数:阴性植株数=3:1的孟德尔分离规律,转il-4基因阳性植株数偏低.与非转基因植株(对照)相比,转il-4基因阳性植株的开花期延迟、田间抗病性下降、植株高度变矮、结实数/株减少、单株结果数减少,生长势和结实能力等综合农艺性状明显降低.而转基因阴性植株的综合农艺性状与非转基因植株(对照)相比,则差异不显著.花粉管通道法可以介导il-4基因转化番茄,il-4基因可以在转化后代中遗传.     

转甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草抗旱及耐盐性

将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因与组成型启动子CaMV 35S启动子融合,构建了植物表达质粒pBIBB。通过根癌农杆菌介导将BADH基因导入烟草,经PCR、Southern杂交、Northern杂交证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性,结果显示对照植株没有BADH酶活性,转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大,范围在0.1~1.0 U mg-1间。转BADH基因的烟草在盐胁迫和聚乙二醇（PEG）胁迫条件下生长状态良好,生长势强于未转基因植株,说明BADH基因能在异源植物中正常翻译、表达和用于植物抗旱、耐盐基因工程的研究。