发根农杆菌诱导毛酸浆毛状根条件的优化

以4种发根农杆菌A4、C58C1、R1601、ATCC15834为诱导菌株侵染毛酸浆叶片、茎段,研究了发根农杆菌种类、外植体类型、不同预培养时间、不同侵染时间、不同共培养时间和乙酰丁香酮对毛酸浆毛状根诱导率的影响,并用PCR检测rolB基因。结果表明:4种发根农杆菌均能诱导毛酸浆外植体产生毛状根,ATCC15834的诱导率相对较高,叶片优于茎段;最佳侵染时间为6~8min;预培养和共培养时间均为2~3d时诱导率较高;乙酰丁香酮(AS)浓度为100μmol·L~(-1)有利于促进毛状根的产生,经PCR检测证明,rolB基因已整合到毛酸浆毛状根基因组中。     

钩藤毛状根的诱导及其钩藤碱含量的测定

为建立钩藤毛状根的培养体系,以钩藤组培无菌苗为试材,利用发根农杆菌A4、ATCC15834、R16011侵染钩藤外植体,探讨了不同钩藤外植体、菌液浓度、AS浓度、干燥处理时间对毛状根诱导率的影响。结果表明:以钩藤叶片作为外植体,预培养3 d,以OD600=0.6的A4菌株浸泡30 min后,干燥处理1 h,转入含100μmol·L-1乙酰丁香酮无激素WPM培养基中共培养3 d,在含600 mg·L-1头孢克肟筛选培养基上能获得较高的毛状根诱导率,毛状根诱导率达53.66%。PCR扩增鉴定表明,钩藤细胞核基因组中已成功整合发根农杆菌的发根基因。钩藤毛状根在无激素1/2MS液体培养基中培养20 d后,部分毛状根中钩藤碱含量明显提高,最高含量是带钩枝条中的2.06倍,达1.211 mg·g-1。     

恒山黄芪毛状根遗传转化体系的建立及活性成分含量测定

以恒山黄芪叶片为试材，采用发根农杆菌侵染诱导产生毛状根的方法，研究了不同菌株对恒山黄芪叶片诱导毛状根的能力和恒山黄芪毛状根的遗传转化体系，包括恒山黄芪不同外植体、菌液浓度、共培养时间、抗生素类型和浓度、乙酰丁香酮浓度对毛状根诱导率的影响，并测定规模培养的毛状根中总黄酮和总皂苷的含量，建立稳定的恒山黄芪毛状根体系，以期为进一步建立积累活性成分的恒山黄芪毛状根液体培养体系提供参考依据。结果表明：以OD₆₀₀=0.6的发根农杆菌LBA9402为菌种，侵染恒山黄芪叶片30 min,转入含100μmol·L^-1乙酰丁香酮1/2MS培养基中共培养3 d,在含500 mg·L^-1头孢克肟的筛选培养基上对于恒山黄芪叶的诱导能力最好，毛状根诱导率达54.1%,经PCR扩增鉴定，发根农杆菌LBA9402的发根基因整合到了恒山黄芪叶的基因组中。恒山黄芪毛状根在液体培养扩增后，总黄酮和总皂苷含量均明显提高，分别是自然根中含量的1.72倍和2.31倍。     

黄瓜‘中国龙’毛状根诱导体系的建立

黄瓜是全球范围内重要的经济作物。建立黄瓜基因组测序品种‘中国龙’的毛状根诱导体系,可为今后分析黄瓜基因功能、挖掘黄瓜优良基因提供技术支撑。本文以‘中国龙’为材料,从种子表面灭菌方法、发根农杆菌的侵染浓度和共培养时间3方面,研究发根农杆菌菌株K599对‘中国龙’毛状根诱导的情况。结果表明,75%(φ)的乙醇先处理种子30 s,再用5%的次氯酸钠灭菌5~10 min的种子消毒方法,农杆菌菌液OD_(600)值在1.2左右时进行侵染,共培养2天,是获得‘中国龙’毛状根的适宜组合方法。PCR扩增结果证实,经这样诱导出的黄瓜毛状根中,发根农杆菌Ri质粒的rol C基因已在黄瓜毛状根基因组中整合并得到表达。试验探索出了一套适合‘中国龙’毛状根诱导的方法。     

根癌农杆菌介导蓝猪耳转化系统的建立

 通过对影响根癌农杆菌介导蓝猪耳转化效果各种因素的研究, 建立了蓝猪耳高效稳定的遗传转化系统。研究结果表明, 农杆菌侵染叶片外植体效率最高; 外植体预培养不利于农杆菌的侵染; 乙酰丁香酮能大大提高根癌农杆菌转化蓝猪耳的效率。另外, 菌液浓度、侵染和共培养的时间及再生的途径等均对转化效率有一定的影响。叶片外植体与农杆菌共培养后, 经过抗性芽的诱导、根的再生, 70 d左右就可以获得抗性苗。抗性植株经GUS染色、PCR分析和Southern blot检测, 外源基因已经整合到蓝猪耳基因组中, 转化频率为7%～8%。     

发根农杆菌介导的荔枝LcMYB1转化烟草叶片的研究

利用荔枝果皮花青苷生物合成的关键调节基因LcMYB1为标记,构建植物表达载体pBA002-LcMYB1,电转法转入发根农杆菌A4菌株,通过叶盘法转化烟草K326。结果表明,烟草叶片侵染一周后长出白色的毛状根,约3周后部分毛状根逐渐变成红色,毛状根诱导率为100%,红色毛状根诱导率为19.9%。当筛选培养基中添加5 mg ? L-1 Basta,毛状根诱导率降低为33.3%,但红色毛状根诱导率提高到75%。高效液相色谱分析表明,红色毛状根中积累矢车菊素–3–葡萄糖苷和矢车菊素–3–芸香糖苷,PCR检测证实红色毛状根是由LcMYB1的转入引起的。实时荧光定量PCR表明转LcMYB1可以诱导烟草毛状根中花青苷生物合成相关的结构基因和调节基因表达。     

发根农杆菌介导山定子遗传转化及发根再生植株

为了提高山定子的生根能力,用发根农杆菌转化山定子,诱导产生发根,并由发根诱导出再生植株。通过对不同发根农杆菌株系、培养基、共培养时间以及添加乙酰丁香酮（AS）的研究,优化了发根农杆菌转化体系。当用添加AS（100μmol﹒L-1）的菌液侵染植株切段30 min,共培养3 d,在无植物生长调节剂的固体1/4MS培养基上诱导产生发根时,发根诱导率最高,达到88.89%。将发根根段在MS+BA 2.0 mg﹒L-1 +IBA 0.1 mg﹒L-1+GA3 0.1 mg﹒L-1的再生培养基上,通过愈伤组织的诱导得到再生植株,再生率3%。     

农杆菌介导的番茄遗传转化研究进展

介绍了农杆菌介导的番茄遗传转化影响因素,包括番茄的基因型、农杆菌类型、外植体类型、预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、分化培养基中的生长调节剂与抗生素浓度、筛选剂浓度、乙酰丁香酮浓度及外源基因等重要因素。同时综述了番茄转基因技术的应用及研究成果,以期为农杆菌介导的番茄遗传转化奠定理论基础。     

超声波辅助发根农杆菌对黄瓜遗传转化的影响

 由于超声波处理可增加农杆菌与外植体之间的接触面积, 提高农杆菌对外植体的转化频率。本试验用野生型发根农杆菌A4 菌株感染黄瓜无菌苗的子叶和下胚轴, 建立了黄瓜的发根遗传体系。并对超声波处理时间、外植体放置方向、预培养时间、外植体类型、乙酰丁香酮等影响因素进行了优化。     

甜蛋白基因MBLII 对莴苣的遗传转化

 以4 日龄莴苣(Lactua sativa L.) 无菌苗子叶为外植体, 通过根癌农杆菌介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLII 对莴苣的遗传转化。抗生素浓度和子叶外植体与农杆菌的共培养时间是影响转化的重要因素。附加卡那霉素( Kan) 50 mg/ L 的诱芽培养基MS I(MS+ NAA 0. 1 mg/ L+ 6􀀁BA 0. 1 mg/ L+ 羧卞青霉素500 mg/ L) 最适于侵染后子叶外植体的诱芽培养。在外植体与农杆菌共培养0~ 7 d 的范围内, 以共培养3 d 最佳( 生芽率58. 3%, 白化率29%) 。1~ 2 cm 再生芽移入诱根培养基MS II (MS+ NAA 0. 05 mg/ L+ Kan 50 mg/ L+ 羧苄青霉素300 mg/ L) 中, 诱根率可达100%。获得的抗性植株经组织化学及PCR 特异扩增鉴定和统计, 7. 6%阳性。Southern blot 结果证明MBL II 基因已整合到莴苣基因组中。