绿色棉纤维发育过程中DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性分析

【目的】分析绿色棉纤维发育过程中DNA甲基化状态差异。【方法】利用2组限制性内切酶Eco RⅠ/HpaⅡ和Eco RⅠ/MspⅠ对绿絮棉1号纤维基因组甲基化位点进行识别和切割,并采用甲基化敏感扩增多态性引物对切割产物进行扩增,分析基因组内5'-CCGG-3'位点的甲基化状态;同时对扩增的差异片段进行测序,分析其生物学功能。【结果】66对甲基化敏感扩增多态性引物共扩增出4112个条带;平均每个样品共扩增出822.4个带型,平均每对引物扩增出12.46个片段。随着绿色棉纤维的发育,甲基化条带总数、甲基化条带比率、全甲基化条带百分比均逐渐升高;其中,开花后10、15、20和25 d时甲基化条带总数分别比开花后5 d时增加11.45%,13.86%,20.10%和33.13%。与开花后5 d相比,开花后10、15、20和25 d时纤维DNA发生甲基化变化位点的比例分别为3.15%,3.43%,3.65%和2.52%;而去甲基化位点的比例分别为12.87%,14.72%,13.31%和48.81%。通过测序和Blast分析表明,17个片段与已知的功能基因同源性较高,包括棉花线粒体基因组、丝氨酸蛋白酶基因和酯酶基因,且这些基因均在开花后25 d发生去甲基化。【结论】绿色棉纤维发育过程中DNA发生了甲基化与去甲基化现象。     

巴西橡胶树DNA甲基化的MSAP分析

本文采用"甲基化敏感扩增多态性"(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism,MSAP)的分析方法,在全基因组水平检测巴西橡胶树DNA甲基化位点,确定巴西橡胶树基因组DNA甲基化模式和水平。结果表明:16对MSAP引物选择性扩增,共扩增262条带,其中甲基化位点87个,甲基化比例为33.21%,其中,半甲基化位点为32个,比例为12.22%;全甲基化位点为55个,比例为20.99%。对部分巴西橡胶树基因组甲基化位点进行回收,最终分离了18条存在甲基化的基因组DNA序列。BLAST比对后,同源分析表明巴西橡胶树基因组中包括转录因子、蛋白激酶等在内的多种类型的DNA序列中均存在甲基化现象。本研究为深入研究巴西橡胶树的DNA甲基化奠定基础。     

苦瓜MSAP反应体系的优化及其种质资源表观遗传多样性

为研究苦瓜表观遗传多样性,通过正交设计方法优化了MSAP技术中预扩增和选择性扩增系统的关键因素,构建了适用于苦瓜的MSAP反应体系,并利用其对52份苦瓜种质资源的表观遗传多样性进行分析。结果表明:30μL MSAP双酶切反应体系中,加入Eco RⅠ和MspⅠ/HpaⅡ各10 U,于37℃水浴酶切4 h时使酶切完全;最佳预扩增反应体系20μL,包含连接产物4μL,10×PCR buffer 2.0μL(25 mmol/L),d NTPs0.3μL(2.5 mmol/μL),Taq酶0.1μL(5 U/μL),10 mmol/L上下游引物各1.0μL;最佳选择性扩增反应体系20μL,包含4μL稀释150倍的预扩增产物。从110对引物中选出扩增效果好,条带清晰的12对引物组合利用最佳反应体系对52份苦瓜种质资源进行MSAP扩增,共得到430条条带,其中多态性条带218条,多态性比率为50.70%。对DNA甲基化模式进行分析,其中类型Ⅰ(非甲基化类型)3109条,类型Ⅱ(半甲基化类型)633条,类型Ⅲ(全甲基化类型)606条,类型Ⅳ(外部甲基化)1250条,苦瓜甲基化模式主要为外部甲基化为主。Nei's基因多样性指数和Shannon信息指数分别为0.226 5、0.372 6,该结果表明试验中所用的苦瓜种质资源具有丰富的遗传多样性,遗传变异和进化水平较高。UPGMA聚类分析结果表明12个不同地区苦瓜种质资源在相似性系数0.88处可分为4大类,大部分种质被聚集在第1类中,又可以分为5个亚群,亚群Ⅰ:中国海南、中国广东、中国福建和日本;亚群Ⅱ:中国云南;亚群Ⅲ:泰国和格林纳达;亚群Ⅳ:中国北京;亚群Ⅴ:中国台湾。本研究通过利用正交优化建立MSAP反应体系,并对苦瓜种质资源甲基化表观遗传多样性进行研究,这种基因组结构水平上的研究将为苦瓜种质资源的种群分化及物种进化的进一步研究提供依据。     

马铃薯茎尖玻璃化法超低温保存后DNA甲基化的遗传变异

对青薯9号、大西洋、小白花和E1074种基因型的马铃薯茎尖进行玻璃化法超低温保存,并运用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析4种材料超低温保存前后DNA甲基化的的变异情况。结果表明:经玻璃化法超低温保存,四个品种的成活率分别为86.93%、78.03%、71.57%和65.82%。成活率和再生率因基因型而异,且不同基因型之间的差异显著。用MSAP技术分析超低温保存前后植株甲基化的结果显示:用16对引物组合对4个品种进行扩增,平均扩增出493条带;与对照相比,4个品种基因组的CCGG序列中有8.4%~14.3%DNA发生甲基化变化。经超低温保存后,去甲基化和甲基化都有发生,并以去甲基化变化为主要趋势。本文运用MSAP技术对马铃薯超低温保存前后植株进行胞嘧啶甲基化分析表明,使用MSAP检测超低温保存后再生植株DNA甲基化遗传变异非常有效。     

马铃薯不同株系之间的DNA甲基化变异研究

为探究马铃薯不同株系之间DNA甲基化变异情况,利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对来源于同一马铃薯品种的3个株系进行分析。结果表明:筛选出6对引物组合,3个株系(3-4,17-1,9)MSAP比率分别为31.7%,38.1%和36.4%,全甲基化率分别为19.2%,23.7%和21.5%。株系之间的甲基化变化模式包括甲基化和去甲基化变异。在甲基化变化类型中,偏向于产生由全甲基化到过甲基化的变化;而在去甲基化变化类型中,偏向于由全甲基化到无甲基化和由过甲基化到无甲基化。研究结果证实不同马铃薯株系之间DNA甲基化变化存在差异,为马铃薯新株系选育提供理论依据。     

栽培稻×药用野生稻种间杂种基因组DNA甲基化的遗传与变异研究

为了探索栽培稻与药用野生稻种间杂种体内异源基因组重组引起的DNA甲基化变异规律,及其生物学效应,利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对辽粳944、药用野生稻及其杂种F_1不同发育时期的叶片和小穗基因组DNA甲基化水平和模式的遗传变异特点进行了分析。结果表明,辽粳944、药用野生稻及其杂种F_1的叶片和小穗DNA的甲基化水平表现出相同的变化趋势,即随着生长发育的进行,DNA甲基化水平呈下降趋势,各组织的全甲基化率均显著高于半甲基化率(P=0.000);杂种在分蘖期、减数分裂期及开花期叶片DNA平均总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分别为20.19%,16.06%及4.13%,其甲基化水平高于双亲;而杂种在减数分裂期、小孢子发育期及花粉成熟期小穗DNA平均总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分别为17.38%,13.67%及3.71%,均比辽粳944高,而比药用野生稻低;杂种小穗的半甲基化率显著高于辽粳944(P=0.015)。杂种叶片和小穗DNA的甲基化模式均有5种类型。经过对94个甲基化特异片段的序列分析,有38个片段的序列与已知或假定功能的基因具有同源性。为进一步研究栽培稻与野生稻种间杂种不育机理奠定了基础。     

羽衣甘蓝自交不亲和与自交亲和系种子萌发期DNA甲基化的动态变化

自交不亲和系植株的种子往往出现退化现象,为了研究种子的退化现象是否与甲基化相关,因此本文采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism, MSAP)技术,以羽衣甘蓝自交不亲和系9^#种子、自交亲和系14^#种子为研究对象,对其生长发育过程种子基因组DNA甲基化水平变化情况进行研究。采用改良的CTAB法提取种子萌发不同时期DNA,然后通过MSAP分析、统计扩增条带,比较二者之间的差异。对9^#种子DNA甲基化状态分析表明,萌发前期(0~2 d)发生甲基化位点数目持续增多,但萌发后期(2~8 d)发生去甲基化的数目大量增加,整个萌发期去甲基化位点数目是甲基化位点数目的11倍,说明9^#种子萌发过程中DNA甲基化修饰是基因表达的重要调控方式之一;在相同发育时期,9^#在总甲基化、全甲基化、半甲基化水平上均不同程度高于14^#。随着种子的萌发,9^#全甲基化水平明显上升,半甲基化水平几乎不变,而14^#变化趋势与9^#相反,半甲基化水平明显上升,全甲基化水平几乎不变.     

冷驯化不同阶段茶树DNA甲基化模式的变化

低温胁迫是影响茶树产量、生长发育和地域分布的重要环境因子之一,需要通过冷驯化的诱导来提高其抗寒性。DNA甲基化是植物表观遗传的重要方式,环境胁迫会引起植物DNA甲基化状态的改变。为研究DNA甲基化是否参与茶树的低温响应,本研究利用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)和高效液相色谱法(HPLC),分析了不同冷驯化阶段茶树基因组DNA甲基化水平及状态变化。MSAP分析结果表明,50对选择性扩增引物在对照、驯化后和脱驯化样品中分别扩增出905、968和970个甲基化条带,总甲基化位点比例分别为50.6%、54.1%和54.2%。与未驯化的样品相比,冷驯化后和脱驯化的样品基因组DNA甲基化水平升高。HPLC的检测结果与MSAP结果类似。进一步分析甲基化模式发现,与对照相比,茶树冷驯化过程中同时发生了甲基化和去甲基化现象,但总体变化趋势表现为甲基化水平的增加。表明茶树在抗寒响应中出现DNA甲基化现象。     

小麦与叶锈菌互作前后基因组甲基化模式分析

首次使用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析两种小麦材料近等基凶系TcLrl9及其感病亲本Thatcher 的甲基化水平,同时比较了苗期接种叶锈菌生理品种THlTr前后基因组DNA胞嘧啶甲基化模式.60对选扩引物对接种前后的小麦DNA进行全基因组筛选,共得到3 554个片段.其中998个片段是两种甲基化模式中的一种,小麦近等基因系TcLr19及其感病亲本Thatcher的甲基化水平约为28.1%.在所有的引物中,并没有直接分离得到接菌前后的甲基化模式的差异.结果初步表明,叶锈菌可能并没有诱导植物基因组DNA胞嘧啶位点的甲基化模式变化.     

不同单株叶籽银杏DNA甲基化MSAP分析

利用MSAP(甲基化敏感扩增多态性)技术对11株叶籽银杏的胞嘧啶甲基化水平和模式进行评估。结果表明,叶籽银杏基因组的CCGG序列中检测到36.86%～46.43%的DNA发生甲基化。本研究从36对选扩增引物中筛选出14对引物组合,共得到2879条清晰可辨的带,叶籽银杏总体平均DNA基甲基化水平为42.14%,甲基化模式以内侧胞嘧啶为主,其中,外侧胞嘧啶甲基化水平为11.90%～23.90%,内侧胞嘧啶甲基化水平为17.03%～28.37%。UPGMA聚类分析和主成分分析结果一致,不同单株的叶籽银杏可分为3大类。推断叶籽银杏的变异机制可能与DNA甲基化有关。     

盐胁迫下棉花基因组DNA表观遗传变化的MSAP分析

盐胁迫是非生物逆境中对作物危害比较严重的自然灾害之一, 严重影响和制约作物的产量和种植面积。本研究以陆地棉品系YZ1为材料, 调查不同NaCl浓度下棉花幼苗生长及根基因组DNA的甲基化水平和变化模式。结果表明,对棉花幼苗的株高和根长生长100 mmol L^-1 NaCl有促进作用, 200 mmol L^-1 NaCl有显著抑制作用;100~200 mmol L^-1 NaCl胁迫严重抑制棉花幼苗的侧根数量。甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)分析表明, 经100、150和200 mmol L^-1 NaCl处理后根基因组DNA甲基化比率分别为38.1%、35.2和34.5%, 均低于对照(41.2%), 同时棉花幼苗根DNA的甲基化水平与NaCl处理浓度呈显著负相关(r = –0.986)。与对照相比, 100、150和200 mmol L^-1 NaCl胁迫下棉花幼苗根基因组DNA的甲基化和去甲基化分别为6.4%、7.6%、11.3%和12.7%、11.1%、8.2%。此外, 序列和RT-PCR分析表明, 与MSAP差异片段高度同源的基因的表达在处理与对照间差异显著。     

双胚苗水稻来源的单倍体、二倍体及其杂交F1的DNA甲基化位点分析

全基因组倍增或多倍化, 伴随着基因丢失和二倍化进程, 被认为是植物进化的重要推动力量。DNA甲基化与miRNA的表观遗传调控机制在植物生长发育及进化过程中起着重要的作用。本文采用MSAP (甲基化敏感扩增多态性)技术分析同一双胚苗水稻来源的单倍体、二倍体及其杂交F₁的基因组DNA 5'-CCGG位点胞嘧啶的甲基化及遗传特点。对部分甲基化位点进行切胶、回收、测序及功能注释, 并结合miRNA靶基因预测探讨特定甲基化位点的遗传特点及其与miRNA的相关性。16对选择性扩增引物在双亲及杂交F₁中共检测了462个DNA甲基化位点, 杂交F₁甲基化水平平均为43.20%, 与双亲相差不大(单倍体为46.75%, 二倍体为41.99%)。以TargetFinder软件分析发现其中的7个甲基化位点基因序列上存在1~4个miRNA的结合位点, 这些基因的功能注释包括逆转录转座子蛋白、ras相关蛋白、H2A/H2B/H3/H4核心组蛋白等。同时, 探讨了逆转录转座子在植物进化中的作用。研究结果为进一步阐明水稻基因组倍增过程中DNA甲基化与miRNA的关系提供了参考。     

青枯菌诱导下花生基因组DNA表观遗传变化的MSAP分析

以高感青枯病品种中花12号和高抗青枯病品种远杂9102为材料,调查青枯菌接种12 h后花生基因组DNA的甲基化水平和变化模式。甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)分析表明,正常生长的中花12号和远杂9102的基因组DNA甲基化比率均为35.1%,经青枯菌接种12 h后,中花12号降低到31.3%,而远杂9102的基因组DNA甲基化比率则升高至37.2%。与对照相比,青枯菌接种12 h胁迫下中花12号和远杂9102基因组DNA的甲基化和去甲基化分别为5.9%,12.4%,18.3%,11.9%。由此推测,高抗青枯菌的花生经青枯菌侵染后基因组DNA某些位点的甲基化状态发生变化而使基因表达发生了改变,产生或启动对青枯菌胁迫的能动应激机制。     

羊耳蒜遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立与初步应用

为研究羊耳蒜种质资源遗传多样性,建立并初步应用羊耳蒜AFLP反应体系。以羊耳蒜幼嫩叶片为材料,采用常规SDS法提取基因组DNA,通过优化AFLP反应体系中的几个关键因素,建立适合羊耳蒜的AFLP银染反应体系,并利用筛选出的引物组合对羊耳蒜的遗传多样性进行初步研究。经EcoRⅠ和MseⅠ酶组合37℃酶切3 h后可将500 ng基因组DNA完全切开;酶切产物和接头经16℃连接过夜后,用带有1个选择性碱基的预扩引物和带有3个选择性碱基的选扩引物分别进行扩增,扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染,能够得到清晰的扩增图谱。3对引物组合对8个羊耳蒜种群共185个体的扩增共得到221条条带,其中多态性条带195条,多态性条带百分率为88.24%。本研究结果表明建立的AFLP反应体系可用于羊耳蒜种质资源遗传多样性研究。     

杉木亲本自交系及其杂交种DNA甲基化和表观遗传变异

表观遗传调控包括DNA甲基化、染色质结构修饰和小分子RNA调控等机制可能在杂种优势形成过程中起重要作用.为了了解DNA甲基化对杉木杂交后代杂种优势的影响,本研究利用甲基化敏感随机扩增PCR技术(methylation-sensitive AP-PCR,MS-AP-PCR),选取40对引物组合对杉木亲本自交及其亲本的杂交组合后代群体的基因组DNA进行了扩增和分析.结果表明:杉木基因组的DNA甲基化模式主要以内侧胞嘧啶的甲基化为主:6个正反交组合总的甲基化百分率相对于亲本的自交系而言,甲基化率呈减少的趋势;同一组合正反交组合后代之间在CCGG位点胞嘧啶的甲基化水平上无明显差异;6个杂交组合在CCGG的位点上的甲基化位点数明显低于它们的亲本自交子代.对3种甲基化的表达类型与性状表型值、杂种优势值、配合力进行的相关分析结果表明,检测位点外侧胞嘧啶半甲基化、内侧胞嘧啶甲基化位点变化与杉木树高,胸径和材积性状的杂种优势均成显著负相关,即杉木基因组外侧胞嘧啶半甲基化程度越低、内侧胞嘧啶甲基化位点越少,3个生长性状的杂种优势愈明显;而其他甲基化程度的指标与杂种优势之间的相关均没有达到统计学的显著水平.     

人工异源六倍体小麦中甲基化差异的MSAP分析

利用MSAP方法分析了小麦从四倍体到六倍体进化过程中甲基化水平和甲基化遗传模式的变化。结果表明,人工异源六倍体小麦SCA/SQ(AABBDD)及其四倍体母本SCAUP(AABB)、二倍体父本粗山羊草SQ523(DD)的总甲基化水平分别为28.21%,27.53%,24.11%。37对引物检测到1 087条差异的扩增片段,对这些位点的甲基化遗传模式进行分析,结果表明,在人工异源六倍体中发生过甲基化的比例为18.95%,高于去甲基化的比例(2.58%)。这些结果揭示了小麦从四倍体到六倍体的进化过程中,通过对一些功能基因的甲基化来减轻异源多倍化造成的影响。     

苹果MSAP技术体系的优化及其应用

为建立适合苹果的MSAP(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism)反应体系,以‘嘎啦’为材料对MSAP技术中的关键因素进行优化筛选,并用于苹果叶片和愈伤组织的甲基化模式分析。经过不同因素水平摸索,结果表明：600 ng基因组DNA用EcoRⅠ,HapⅡ或MspⅠ各10 U,37℃保温12 h,即可酶切完全。最佳预扩增体系为：酶连产物1 μL、上下游引物各3 μL、2×PCR mastermix 10 μL（Taq酶1 U、dNTPs 5 mM、Mg2+ 30 mM）和ddH2O 3 μL。20 μL选择性扩增体系中,含有60倍稀释的模板DNA 2 μL、上下游引物各3 μL、2×PCR mastermix 10 μL（Taq酶1 U、dNTPs 5 mM、Mg2+ 30 mM）和ddH2O 2 μL。在该体系下选用2对引物对苹果叶片和愈伤组织进行甲基化模式分析,获得了清晰、重复性好的银染指纹图谱。平均每对引物可获得特异性条带12条,共获得特异性条带91条,表明该体系可用于苹果不同发育阶段DNA甲基化模式分析。     

茅苍术试管苗继代培养的ISSR及MSAP分析

为探究茅苍术试管苗在长期继代培养中的遗传稳定性与DNA甲基化变化,保证工厂化生产种苗品质。以茅苍术幼嫩顶芽为初始材料,建立高效离体快繁体系进行长期继代培养,并运用ISSR、MSAP分子标记技术对不同继代次数的试管苗进行分析试验。结果显示不同继代次数的10个样本遗传多样性较低,具有遗传稳定性较高。其中,第1代与第10代样本之间遗传相似系数最低,亲缘关系较远;从继代第4代开始,不同引物扩增图谱条带在个别位点发生变化,且随着继代次数增加变化愈明显。经过长期继代培养后,茅苍术试管苗的甲基化水平有所下降,去甲基化模式和甲基化模式并存,但以去甲基化模式为主。长期继代培养后出现变异现象可能是培养条件、培养时间的不同导致基因被重新活化和表达或抑制、去甲基化模式高于甲基化模式造成的。本研究结果为茅苍术种质资源保存和工厂化生产提供了一定的理论依据。     

马铃薯种质遗传多样性分析的AFLP反应体系优化与引物筛选

本试验主要对AFLP反应体系进行优化,并用该体系筛选适用于马铃薯种质资源遗传多样性分析的引物。酶切连接、预扩增和选择性扩增体系的优化结果表明,建立的马铃薯AFLP反应体系为:模板DNA160ng,37℃酶切连接12h;预扩增体系中dNTP浓度为0.2mmol/L,TaqDNA聚合酶用量为1U;选择性扩增体系中预扩增产物稀释20倍,引物终浓度为2.5ng/μL。利用优化后的AFLP反应体系,以5个马铃薯品种为试材筛选选择性引物,可以从81对引物组合中选出16对条带丰富且多态性较高的引物组合。本研究为种质资源鉴定、马铃薯遗传多样性以及马铃薯抗病性研究等奠定了良好的基础。     

芒属植物AFLP分析体系的建立与优化

对AFLP实验流程中的基因组提取、酶切等关键因素进行优化,建立了芒属植物的AFLP(扩增片段长度多态性)分析体系。本研究分别采用常规CTAB法和改良的CTAB法提取芒属植物基因组DNA,基因组分别用HindⅢ/MseⅠ系统和PstⅠ/MseⅠ系统进行酶切和连接一步反应,连接产物稀释20倍后进行预扩增,预扩产物稀释20倍后进行选择性扩增。结果显示:采用改良CTAB法提取的DNA质量优于常规CTAB法;采用PstⅠ/MseⅠ系统酶切的DNA多态性高于HindⅢ/MseⅠ系统。采用优化后的AFLP体系分析30份供试芒属植物材料,从64对引物中筛选出8对多态性较好的AFLP选择性扩增引物,多态性比率达到100%,表明优化后的AFLP体系适合于芒属植物的分子标记分析,为芒属植物种质遗传多样性的分子研究奠定了技术基础。