26例犬毛囊肿瘤的组织病理学诊断和免疫组织化学分析

本研究旨在为犬毛囊肿瘤的诊断提供最优的免疫标记物,提高肿瘤诊断的准确性,缩短肿瘤的病理学诊断时间,为犬毛囊肿瘤病的临床精准治疗提供帮助。作者收集了26例临床犬毛囊肿瘤病例,分别用免疫标记物CK5/6、CK8/18、CK19、P63、CD34、CD10、Vimentin对肿瘤样本进行免疫组织化学标记（IHC）。26例犬毛囊肿瘤的IHC染色结果表明,CD34在86.9%的毛囊肿瘤中呈瘤细胞阳性;CD10和CK8/18在毛上皮瘤中呈瘤细胞阳性,在其他毛囊肿瘤中均为瘤细胞阴性;CK19在良性和恶性毛上皮瘤中分别为强阳性和中阳性,CD34在良性和恶性毛上皮瘤中分别为中阳性和弱阳性;CD10在毛母细胞瘤中呈周边间质特异性阳性;Vimentin在毛囊肿瘤中呈瘤细胞阴性,间质细胞阳性。结果显示,CK5/6、P63可用作本研究中所有毛囊肿瘤的阳性标记物;CD34可用作除毛母质瘤和毛囊瘤外的其他毛囊肿瘤的瘤细胞特异性阳性标记物;CD10和CK8/18可用作毛上皮瘤的瘤细胞阳性标记物;共同使用CK19和CD34可用于区分毛上皮瘤的良恶性;CD10可用作毛母细胞瘤周边间质特异性阳性标记物;Vimentin可用作毛囊肿瘤的瘤细胞阴性标记物。     

云南半细毛羊毛囊干细胞无血清培养体系的建立

试验旨在研究云南半细毛羊毛囊干细胞（hair follicle stem cells,HFSCs）的分离、培养及鉴定方法,为下一步的诱导分化研究奠定基础。方法：采用组织块法原代培养云南半细毛羊HFSCs。并对分离得到的细胞进行免疫组化鉴定。培养结果：HFSCs为贴壁生长细胞,体积小,核质比高,呈典型的铺路石状,在显微镜下折光性强、胞体透亮。免疫组化分析结果表明：细胞表达K14、不表达CD271。证明所培养的细胞为HFSCs。结论：试验采用组织块培养法初步建立了云南半细毛羊无血清培养HFSCs,这对于探讨云南半细毛羊毛囊生长发育调控机制以及成体干细胞增殖分化特性具有非常重要的意义。     

细毛羊毛囊干细胞分离培养方法比较研究

试验旨在对细毛羊毛囊干细胞的分离培养方法进行初步研究,建立细毛羊毛囊干细胞体外培养体系。采用两步酶消化法、机械分离法和两步酶消化法+机械分离法3种方法分离培养细毛羊毛囊干细胞,通过测定毛囊干细胞的数量、克隆形成率及毛囊干细胞的增殖能力等综合评估3种培养方法的优劣,寻求既能方便获得大量毛囊干细胞,又能减少其分化的理想培养条件。倒置显微镜下观察3种培养方法获得的细胞均为铺路石状,均表达角蛋白K19和整合素β1,表明成功获得细毛羊毛囊干细胞,建立体外培养体系。采用"两步酶消化法和机械分离法"相结合的方法获得毛囊干细胞体外培养效果最优。     

延边半细毛羊羊毛细度测定及其CD200基因克隆与表达分析

本研究旨在了解CD200基因与延边半细毛羊毛用性状的相关性,为延边半细毛羊群体育种奠定理论基础。实验选择相同条件下饲养的体重相近的10月龄雌性延边半细毛羊20只,首先测定延边半细毛羊的细度,然后根据NCBI中绵羊CD200基因(登录号:XM_012190412)的CDS区序列设计引物,通过RT-PCR扩增并克隆CD200基因,采用生物信息学软件进行序列分析;通过免疫组化方法说明CD200在皮肤毛囊中的定位表达。结果显示:延边半细毛羊的羊毛纤维直径为(19.26±2.69)μm;实验成功克隆出CD200基因,长度为729 bp,编码242个氨基酸残基,预测到蛋白二级结构由α螺旋、延伸链、无规则卷曲构成,蛋白质三级结构为球形;免疫组化结果显示CD200在毛囊的外根鞘、毛囊干细胞及表皮层表达。本研究结果表明延边半细毛羊的羊毛细度较细,可用于细毛羊的育种;CD200可能参与调控羊毛细度的表达。     

羊驼毛囊干细胞分离、培养与鉴定

采用0.2%中性蛋白酶Ⅱ和0.25%胰酶∶0.02%EDTA(1∶1)"两步酶"消化法从羊驼背部皮肤分离得到羊驼毛囊干细胞。用无血清角质细胞培养基(K-SFM)培养进行形态学观察、细胞生长曲线克隆形成率及免疫组化染色检测。结果显示,细胞生长曲线表明,不同代次毛囊干细胞接种前3d生长缓慢,4⁶d进入倍增期,有无限增殖的趋势,所分离的羊驼毛囊干细胞具备毛囊干细胞特征(体积小、立体感强),呈现未分化特征;CK19、CK15、β1-integrin和CD34免疫组化染色阳性;第3、5、7、9代克隆形成率分别为(32.7±2.27)%、(47.0±3.46)%、(46.3±3.18)%和(43.3±3.76)%。结果表明,用"两步酶"消化法成功分离获得羊驼毛囊干细胞,无血清角质细胞培养基(K-SFM)可使羊驼毛囊干细胞体外维持未分化状态并传代至12代。     

云南半细毛羊毛囊干细胞微生物污染检测

为检测云南半细毛羊毛囊干细胞（hair follicle stem cells,HFSCs）是否受到微生物污染,为后续的诱导分化等研究奠定基础.用培养法检测细菌、真菌污染;利用荧光染色剂Hoechst33342检测支原体污染.结果表明：实验组细胞和阴性对照中均没有发现细菌污染,实验组中有25％的细胞受到霉菌污染;实验组细胞经Hoechst33342荧光染色后,仅细胞核显色,细胞表面及细胞周围干净、清晰,无荧光小点.说明云南半细毛羊HFSCs没有细菌、支原体污染,仅有25％细胞受到霉菌污染.霉菌孢子对环境的耐受力很强,普通的消毒液很难清除,所以对操作环境带来严重危害.     

湖羊FecB基因在新疆细毛羊胎儿成纤维细胞中的表达

为培育携带FecB多胎基因的高繁殖率新疆细毛羊,本研究提取了湖羊卵巢的总RNA,在此基础上反转录为cDNA,通过PCR扩增得到了湖羊的FecB基因,再与pMD19-T载体连接,构建了pMD19-T-FecB重组质粒。通过双酶切与真核表达载体pEGFP-N1连接,得到了pEGFP-N1-FecB真核表达载体。经测序与酶切证明,成功构建了pEGFP-N1-FecB真核表达载体,并转染新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,通过药物筛选获得了表达湖羊FecB基因的阳性新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,为培育高繁殖率的新疆细毛羊奠定基础。     

云南半细毛羊保种与利用

1 云南半细毛羊的基本情况 云南半细毛羊是在中央、省、市县各级党委、政府领导下,经几代畜牧科技工作者40年的艰辛工作培育而成的新品种.     

羊驼毛囊干细胞分离、培养与鉴定

采用0．2％中性蛋白酶Ⅱ和0．25％胰酶：0．02％EDTA（1：1）“两步酶”消化法从羊驼背部皮肤分离得到羊驼毛囊干细胞。用无血清角质细胞培养基（K-SFM）培养进行形态学观察、细胞生长曲线克隆形成率及免疫组化染色检测。结果显示，细胞生长曲线表明，不同代次毛囊干细胞接种前3d生长缓慢，4～6d进入倍增期，有无限增殖的趋势，所分离的羊驼毛囊干细胞具备毛囊干细胞特征（体积小、立体感强），呈现未分化特征；CK19、CK15、81-integrin和CD34免疫组化染色阳性；第3、5、7、9代克隆形成率分别为（32．7±2．27）％、（47．0±3．46）％、（46．3±3．18）％和（43．3±3．76）％。结果表明，用“两步酶”消化法成功分离获得羊驼毛囊干细胞，无血清角质细胞培养基（K—SFM）可使羊驼毛囊干细胞体外维持未分化状态并传代至12代。     

拟蜘蛛牵丝蛋白基因细毛羊毛囊特异表达载体的构建及其转基因细胞株的筛选

试验旨在获得具有毛囊表达特性的转蜘蛛牵丝蛋白基因细胞株。根据GenBank上发表的棒络新妇属蜘蛛的cDNA片段合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体S,加倍后连入pEGFP-N1框架载体以构建真核表达载体pK-2S,转染新疆美利奴细毛羊皮肤成纤维细胞后筛选单克隆,并通过PCR在DNA、RNA水平检测阳性克隆。基因合成后测序结果显示序列正确,酶切得到正确目的条带,筛选出阳性克隆并且可以在基因组及cDNA上扩增出目的片段。本研究成功将蜘蛛牵丝蛋白基因转入新疆美利奴细毛羊细胞,并在RNA水平表达,为培育毛囊特异表达蜘蛛牵丝蛋白基因并具有更高机械性能羊毛的新型细毛羊品种奠定基础。     

日粮钙水平对空怀期云南半细毛羊生长性能及血清生化指标和繁殖相关激素的影响

试验旨在探讨日粮钙水平对空怀期云南半细毛羊生长性能、配种前血清生化指标和繁殖相关激素的影响,为开展空怀期云南半细毛羊营养需要量研究提供参考。选用50只体况良好、体重相近、38月龄的经产2胎空怀云南半细毛羊,随机均分为5组,分别饲喂0.40%(无外源钙)、0.45%、0.53%、0.66%、0.85%5个钙水平的日粮。预试期14d,正试期30d。结果表明:0.53%钙水平组云南半细毛羊的总增重、平均日增重、平均日采食量、耗料增重比等指标相对优于其他组;0.40%钙水平日粮组的血清钙最高,血清碱性磷酸酶、甲状旁腺素、钙、磷组间差异不显著(P>0.05);繁殖相关激素各组间表现不一,0.40%钙水平组雌二醇水平最高(P>0.05)。在日粮磷水平为0.20%水平条件下,0.53%钙水平组的空怀期云南半细毛羊表现出较好的生长性能,可为临配种前生理生化和激素水平提供较好准备;增加日粮钙水平,未见对以上指标有明显的正向增强作用,可能与日粮钙磷比失衡有关。     

毛囊干细胞的研究进展

毛囊干细胞具有干细胞的一般特征,经研究将其定位于毛囊隆突部。毛囊干细胞具有自己特定的表面标志物,并经诱导可分化为各类细胞,笔者对毛囊干细胞在临床上的应用进行了阐述。     

云南半细毛羊生产性能测定

为探索云南半细毛羊在长期繁衍后有无种质退化现象。选择体重在14kg左右的云南半细毛羊春羔22只进行放牧饲养试验,以测定其生产性能及对牧草营养物质的利用效率。结果发现云南半细毛羊增重是生长后期高于生长前期;日采食量是生长前期略高于后期;每增重1g所需要采食牧草量生长后期低于生长前期;对采食牧草营养物质的消化率,其生长后期均小于前期;血清生化指标则是后期高于前期;血清生长激素和胰岛素的含量生长前期均高于生长后期,但甲状腺激素（T3、T4）则生长前期低于生长后期。从性别角度看,母羊的增重和采食牧草量低于公羊,但每增重1g所需要采食牧草量生长前期公羊低于母羊,后期公羊高于母羊;血清生化指标是母羊高于公羊,血清中的生长激素和甲状腺激素母羊含量均比公羊高,而胰岛素的含量则是在生长前期,母羊低于公羊,而在生长后期母羊高于公羊。说明母羊虽然营养物质合成较快,但其营养物质大部分都用在了氧化供能上,也就是说其基础代谢较为旺盛,而且公羊虽然营养物质合成较慢,但其基础代谢较缓慢,所以表现其体重增加比母羊快。     

云南半细毛羊毛囊干细胞生物学特性分析

为研究云南半细毛羊毛囊干细胞（hair follicle stem cells,HFSCs）的生物学特性,采用组织块法分离培养云南半细毛羊HFSCs,并对其细胞形态、生长动力学、冷冻与复苏、染色体核型等生物学特性进行分析.结果表明：HFSCs为贴壁生长,体积小,核质比高,呈典型的铺路石状,在显微镜下折光性强、胞体透亮.细胞生长曲线为“S”型.冻存前细胞活率98.2％,复苏后细胞活率96.4％.染色体中正常二倍体数目2n=54,其中,长染色体中有3对为中着丝点染色体,23对为端着丝点染色体,X染色体为最大的近端着丝点染色体,Y染色体为最小的亚中着丝点染色体.所得细胞呈现典型的HFSCs特征,细胞活性好,细胞系为稳定的二倍体细胞系.     

绒山羊毛囊干细胞的分离培养及诱导分化鉴定

试验旨在建立绒山羊毛囊干细胞体外分离培养方法,并对其生物学特性和多向分化潜能进行鉴定。利用两步酶消化法和差速贴壁法分离纯化毛囊干细胞,对其进行传代培养,测定生长曲线和克隆形成率,采用油红O和茜素红染色法对第5代毛囊干细胞向成脂和成骨分化情况进行鉴定。结果显示,分离得到的毛囊干细胞形态均一,体积小,呈典型的铺路石状生长,生长曲线呈S型,克隆形成能力强。成脂诱导后,细胞体积增大,细胞质增多,胞内出现小脂滴,诱导12 d后,脂滴逐渐增多,油红O染色呈阳性;成骨诱导后,细胞边缘模糊,出现颗粒状结节,经茜素红染色呈阳性。表明获得的绒山羊毛囊干细胞具有多向分化的潜能。     

CD34 glycoprotein identifies putative stem cells located in the isthmic region of canine hair follicles

It is widely documented that a pool of multipotent stem cells located in humans and mice hair follicle outer root sheath (bulge region) is involved in the restoration of the whole follicular unit during each anagen phase. To the authors' knowledge, data regarding the location and characterization of hair follicle stem compartment in dogs have not been reported in the recent relevant literature. In this study, we investigated the haematopoietic stem and progenitor cell antigen CD34 as a marker of putative stem cells located in a bulge-like region of canine hair follicles. The presence of CD34 mRNA and glycoprotein was assessed on formalin-fixed, paraffin-embedded canine skin samples by in situ hybridization technique and by standard immunohistochemistry, respectively. A strong expression of CD34 mRNA and glycoprotein was observed in a well-defined area of the hair follicle isthmic region and appeared uniformly concentrated at the level of the basal layer of the outer root sheath. These findings provide compelling support to the hypothesis that in dogs, a subpopulation of basal keratinocytes located in the hair follicle isthmic region and characterized by the selective expression of CD34 is potentially associated with the stem cell compartment of this skin appendage.