使君子内生真菌杀线虫活性菌株的筛选及其培养条件的研究

以松材线虫Bursaphelenchus xylophilus为靶标,从249株使君子Quisqualis indica内生真菌中筛选到活性较强的菌株10个,其中菌株FDYS-1活性最高,培养滤液对线虫的致死率达99%;培养滤液杀线活性热稳定性好,121℃处理20min仍不失活,而且活性物质的产生能力遗传稳定,连续继代6代后致死率仍达90.43%。单因子试验和正交试验结果表明,在PD培养液、初始pH5~8、150r/min、装液量100ml/500ml、接种7块菌饼（φ=5mm）的条件下培养3d,菌株FDYS-1生长最好,滤液杀线活性最强,稀释3倍后对松材线虫的致死率仍高达96.45%。正交试验极差分析表明,培养时间是影响培养滤液杀线活性的关键因子。形态学观察和ITS序列分析初步确定菌株FDYS-1为炭角菌属Xylaria sp.真菌。     

小孢拟盘多毛孢PM-1菌株的液体发酵及除草活性物质的分离

前期研究发现分离自毛竹的小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora PM-1菌株具有较强的除草活性,为了明确其产生除草活性物质的最佳液体发酵条件,对培养基种类及成分、培养温度、培养时间和培养方式进行了探讨,并利用薄层层析(thin-layer chromatography, TLC)和高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)对除草活性物质进行了分离。小孢拟盘多毛孢在含硫酸亚铁的PD培养基中,30 ℃黑暗静止培养15天,得到的粗提物除草活性最强;除草活性物质经TLC分离获得7个条带,其中条带6具有较强的除草活性,HPLC分析发现该条带含有7个组分,其中组分3对马唐的活性较强,其保留时间为46.3 min。研究结果表明,利用最佳液体发酵条件对PM-1菌株进行发酵培养,可分离获得除草活性化合物——组分3。     

具杀松材线虫活性的苏云金芽胞杆菌筛选及其毒力测定

松材线虫是松树萎蔫病的主要病原,为了筛选到具有较高杀线虫活性的苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis菌株,采用直接触杀法对苏云金芽胞杆菌发酵液进行杀线虫活性以及稳定性的检测,并对筛选出的高活性菌株通过扩增16S rDNA片段进行菌株的鉴定。结果表明,4个菌株中具有最高活性的菌株D发酵液处理松材线虫8 h的死亡率超过70%,24 h其死亡率达到100%;在温度为-20、25、40、60、80和121℃条件下处理的菌株D发酵液,其对松材线虫的毒力都在85%以上;在pH 5.0~10.0时,菌株D发酵液对松材线虫的毒力都在85%~94%,并无显著的差异;将菌株D发酵液进行蛋白酶K处理后,其对松材线虫的毒力仍在98%以上;在4℃环境下保存50 d,菌株D发酵液的毒力没有明显下降。通过16S rDNA 1.5 kb片段的序列分析,初步得出菌株D可能是苏云金芽胞杆菌KNU-07。可见,菌株D发酵液具有耐热、耐储藏和对蛋白酶K稳定的特性,是一株具有开发潜力和应用前景的高毒力菌株。     

木霉D5菌株的鉴定及其杀线活性测定

通过形态学和分子生物学方法鉴定了1株杀线木霉D5菌株的种类,并评价了其孢子悬浮液和发酵液对禾谷孢囊线虫Heterodera avenae 2龄幼虫的毒杀活性。结果表明,木霉D5菌株为绿色木霉Trichoderma viride(ITS序列登录号：OL661629;TEF序列登录号：ON241311)。浓度为1.0×10⁷ cfu/mL的D5菌株孢子悬浮液和发酵液原液处理2龄幼虫72 h后,线虫死亡率分别为85.20%和86.57%。在温度为20～80℃范围内以及pH为2～10时,发酵液均具有较高杀线活性。     

除草活性放线菌DN5发酵条件及发酵产物理化性质的研究

为了提高放线菌DN5发酵液活性物质的产量,通过单因子试验和正交试验,对其摇床发酵培养基成分及发酵条件进行研究;同时测定其发酵产物的性质.单因子试验结果表明:发酵培养基的最佳碳源为可溶性淀粉,氮源为硝酸钾,添加无机盐的种类为硫酸镁、硫酸亚铁和氯化钠时,放线菌DN5发酵液抑制活性较高.正交试验结果表明,发酵培养基各组分的最佳配比(质量分数)为:可溶性淀粉2.0%、硝酸钾0.15%、硫酸镁0.025%、硫酸亚铁0.001%、氯化钠0.075%、磷酸氢二钾0.075%.菌株DN5发酵的优化条件为:初始pH7.0,发酵时间96h,接种量1%,装液量80mL/250mL,温度28℃.菌株DN5发酵产物具有良好的热稳定性和光稳定性,在中性及弱碱性条件下较稳定,在4℃可储藏120d.杀草谱和作物安全性试验结果表明,DN5菌株发酵液对苘麻Abutilon theophrasti、萝藦Metaplexis japonica和铁苋菜Acalypha australis等的种子萌发有抑制作用.供试作物中,高粱Sorghum bicolor、玉米Zea mays和莴苣Lactuca sativa对其敏感;大豆Glycine max和小麦Triticum aestivum等对其不敏感.     

放线菌菌株MY02的鉴定及发酵液中抗真菌活性组分的分离

从东北地区蔬菜保护地土壤中筛选分离到一株放线菌菌株MY02,通过对其形态学特征及16S rDNA序列分析,初步鉴定其为龟裂链霉菌龟裂亚种Streptomyces rimosussub sp.rimosus。该菌株的发酵液具有抗真菌活性。发酵液经离心、过滤、萃取、硅胶柱层析等步骤分离纯化其活性物质,并进行高效液相色谱(HPLC)分析,表明其活性物质中含有两种抗真菌活性组分。对活性组分的正丁醇溶液进行紫外光谱扫描,结果表明该活性组分具有四烯类抗生素的典型特征吸收峰。     

玉米内生菌YY1菌株抗菌蛋白的稳定性和活性组分分析

为探究枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis菌株YY1抗菌蛋白的基本特性,采用硫酸铵分级沉淀法对蛋白粗提液进行提取,测定温度、酸碱性、蛋白酶和金属离子对抗菌蛋白稳定性的影响,利用阴离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析对其组分进行分离,通过MALDI-TOF质谱对其活性组分进行初步鉴定。结果表明,当硫酸铵饱和度为50%时,菌株YY1产生的粗蛋白对玉米大斑病菌Setosphaeria turcica的抑制效果最好,抑菌圈半径达2.20 cm。该粗蛋白具有较高的热稳定性,90℃处理120 min其抑菌活性未受到明显影响,121℃处理120 min其抑菌活性仍可保持原有活性的85.0%。该粗蛋白具有较好的耐碱性,pH 5～11条件下其抑菌活性稳定,pH 3～4条件下其抑菌活性显著下降。该粗蛋白对蛋白酶K和胰蛋白酶不敏感,两者处理后的抑菌活性分别为对照的97.5%和98.9%;不同浓度金属离子对其抑菌活性的影响存在差异,Cr³⁺可使该粗蛋白完全失活,Zn²⁺、Li⁺、K⁺、Na⁺、M...     

生防细菌YC-10的杀线虫活性及其鉴定

 从烟草中分离出1株对根结线虫和胞囊线虫有较高生物活性的内生细菌菌株-YC-10。将该细菌发酵滤液原液及5、10、20和40倍稀释液处理南方根结线虫,96 h后线虫死亡率均达到100%,处理大豆胞囊线虫96 h,致死率大于90%,在植物线虫生物防治上显示出巨大的应用前景。通过形态特点、理化特征以及16SrDNA序列同源性分析将菌株YC-10鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。对发酵液活性成分理化性质研究表明,活性成分对热稳定,高温、蛋白酶K处理不影响其杀虫活性,而酸性条件下杀线虫活性比碱性中更强。为后续杀线虫活性成分的分离及杀线虫机理研究奠定基础。      

高原草地杀蝗菌株嗜烟碱节杆菌Arthrobacter nicotinovorans的分离鉴定及发酵条件优化

从青藏高原采集的土壤中筛选到一株具有杀蝗虫活性的细菌，根据菌株形态和生理生化特征，结合16S rRNA序列分析，鉴定为嗜烟碱节杆菌Arthrobacter nicotinovorans，编号GZ1-6。室内测定了菌株GZ1-6对东亚飞蝗若虫的致病力，结果显示菌株GZ1-6菌悬液对若虫的校正死亡率达到75.56%。测定了碳氮源、温度、初始pH、装液量以及培养时间对菌株GZ1-6生长和杀虫活性的影响，得到菌株GZ1-6分别在以蔗糖和酵母浸膏为碳氮源，pH 7.5、恒温35℃的条件下生长最好，培养2 d，杀蝗活性较优化前提高了7.77%。菌株GZ1-6能够有效侵染东亚飞蝗并将其致死，可作为优良菌株进行杀蝗虫生物农药的进一步研发。     

水稻拟禾本科根结线虫生防细菌的分离鉴定与防治效果评价

为获得对水稻拟禾本科根结线虫具有较高杀线虫活性的生防细菌,初筛以马铃薯腐烂茎线虫、复筛以拟禾本科根结线虫2龄幼虫为靶标线虫,采用直接触杀法对土壤分离细菌进行筛选。获得8株具有较高杀线虫活性的菌株,其中D45菌株发酵液的杀虫活性最好。其发酵液上清5倍稀释液处理24、48 h后,马铃薯腐烂茎线虫和拟禾本科根结线虫2龄幼虫的死亡率分别为69.8%、72.1%和60.9%、70.4%。盆栽试验和田间试验表明,在拟禾本科根结线虫侵染前采用D45菌株发酵液进行土壤处理,可显著减少水稻根结数。D45高活性菌株产生的杀线虫物质对蛋白酶稳定,但不耐热和酸。经生理生化测定结合16S rRNA基因序列分析,D45菌株为巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium。D45菌株对防治水稻拟禾本科根结线虫具有应用潜力。     

粗皮侧耳生物学特性及其与杀线虫毒力的关系

 本文报道粗皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的生物学特性,尤其是生物学特性与杀线虫毒力的关系。该菌的野生型、驯化型、单孢分离株及孢子分离株的菌丝均能迅速杀死线虫。在固体培养条件下,成熟菌丝产生丰富的毒素球,幼嫩菌丝不产生毒素球;该菌在多种固体培养基,甚至营养缺乏的水琼脂上也生长良好;生长的最适条件为24~28℃、pH5.6~8.0、固体或液体遮光培养。尽管营养、温度、pH及光照等对菌丝生长均有显著影响,但并不影响其对线虫的毒力,各菌株间毒力无差异,线虫与菌丝接触48h,死亡率均达90%以上;液体培养滤液能杀死线虫,但其对线虫毒力的强弱却与菌株、滤液浓度及培养时间等有关。首次以实验证明了该菌在液体培养条件下可产生杀线虫毒素。     

拟青霉云南菌株的杀线虫作用

测定了来自云南部分地区的拟青霉36株菌株对全齿复活线虫的杀虫作用。结果表明，除已知种淡紫拟青霉对线虫有毒杀作用外，拟青霉属中其余菌株对线虫也有一定的杀虫作用。其中，采自昆明西山的环链拟青霉．11号菌株对线虫有很强的降解作用，在CMV和沙氏培养基上，24h对线虫的致死率分别为68．7％和90．8％；一株待定种A-43-1菌株对线虫有很强的致死作用，在CMA培养基上，24h对线虫的致死率达94．7％，并且其分泌的红色素能被线虫吸收，使虫体变红。     

日本曲霉ZW1发酵滤液的杀线虫活性和发酵条件优化

根结线虫是一类严重为害作物的寄生线虫，分布于世界各地，且寄主范围广。前期试验表明，日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1发酵滤液对南方根结线虫Meloidogyne incognita 2龄幼虫（J2）具有毒杀作用，发酵过程中产生表面光滑球形菌丝体和表面辐射状球形菌丝体，且两种菌丝体发酵滤液的杀线虫效果具有显著差异。表面光滑球形菌丝体的发酵滤液处理南方根结线虫J2的校正死亡率在24 h达100%，显著高于表面辐射状球形菌丝体发酵滤液处理的死亡率（12.7%）。本研究通过对菌株ZW1发酵的温度、转速、培养基、光照和黑暗等条件优化表明，菌株ZW1的最优培养温度25℃和转速150 r/min，以Czapek培养基为基础培养基的最优碳源为蔗糖30 g/L和氮源KNO₃3 g/L，光照和黑暗条件下培养不影响菌株ZW1杀线虫活性；评价煮沸和4℃保存发酵滤液的杀虫效果结果表明，发酵液杀线虫活性随着贮藏时间发生变化，发酵液煮沸对菌株ZW1发酵液的杀线虫活性无影响，4℃保存1年的发酵滤液处理J2的校正死亡率仍保持87.8%。菌株ZW1代谢产物对南方根结线虫J2具有良好的毒杀作用，值得进一步研究和开发利用。     

Nematicidal activity of essential oils and their components against the root-knot nematode

ABSTRACT Nematicidal activity of essential oils extracted from 27 spices and aromatic plants were evaluated in vitro and in pot experiments. Twelve of the twenty-seven essential oils immobilized more than 80% of juveniles of the root-knot nematode Meloidogyne javanica at a concentration of 1,000 mul/liter. At this concentration, most of these oils also inhibited nematode hatching. Essential oils of Carum carvi, Foeniculum vulgare, Mentha rotundifolia, and Mentha spicata showed the highest nematicidal activity among the in vitro tested oils. These oils and those from Origanum vulgare, O. syriacum, and Coridothymus capitatus mixed in sandy soil at concentrations of 100 and 200 mg/kg reduced the root galling of cucumber seedlings in pot experiments. The main components of these essential oils were tested for their nematicidal activity. Carvacrol, t-anethole, thymol, and (+)-carvone immobilized the juveniles and inhibited hatching at >125 mul/liter in vitro. Most of these components mixed in sandy soil at concentrations of 75 and 150 mg/kg reduced root galling of cucumber seedlings. In 3-liter pot experiments, nematicidal activity of the essential oils and their components was confirmed at 200 and 150 mg/kg, respectively. The results suggest that the essential oils and their main components may serve as nematicides.     

天然杀线虫先导化合物Waltherione A类似物的合成及杀线虫活性

为了找出天然杀线虫先导生物碱Waltherione A的关键药效基团并简化其结构,以2,3-二甲氧基苯甲醛和3,4-二甲氧基苯甲醛为原料,经过分子内傅克烷基化反应形成苯并七元氧桥环,并用不同的取代基与桥环相连,合成了12个Waltherione A类似物,其中8个化合物未见文献报道,所有目标化合物的结构均通过核磁共振氢...     

和田鞘氨醇杆菌AMCC 100218菌株的筛选、鉴定及杀线虫特性

为筛选对南方根结线虫具有致死效果的生防细菌,从山东省10个县市蔬菜主产区番茄根际土壤中分离可培养细菌,采用离体杀线虫试验测定分离菌株对南方根结线虫Meloidogyne incognita的致死活性,结合生理生化特征及分子生物学方法对高效杀线虫菌株进行分类鉴定,同时对其杀线虫特性进行表征,并通过盆栽试验进一步验证其生防潜力。结果显示,从山东省蔬菜主产区番茄根际土中分离到1株高效杀线虫菌株AMCC 100218,结合生理生化试验与16S rRNA序列分析,鉴定此菌株为和田鞘氨醇杆菌Sphingobacterium hotanense;该菌株对南方根结线虫2龄幼虫的致死效果可达88.87%,其杀线虫活性物质具有较好的热稳定性和储存稳定性,且耐碱不耐酸;盆栽试验结果表明,该菌能够显著减少土壤中的虫口密度,降低番茄发病率。表明和田鞘氨醇杆菌AMCC 100218菌株是1株具有防治根结线虫病潜力的生防细菌。     

Screening and isolation of a nematicidal sesquiterpene from Magnolia grandiflora L

The ethanolic extracts from 30 plant species were tested for their nematicidal activity against nematodes Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle and Panagrellus redivivus (L.) Goodey. The leaf extract of Magnolia grandiflora L. exhibited the strongest nematicidal activity against both nematodes, causing 73 and 100% mortality respectively within 48 h at 5 mg mL(-1). A new nematicidal sesquiterpene was obtained from the leaves of M. grandiflora. The compound was determined to be 4,5-epoxy-1(10)E,11(13)-germacradien-12,6-olide, based on spectroscopic methods including 2D NMR techniques. The median lethal concentrations (LC50) of the compound against B. xylophilus and P. redivivus were 71 and 46 mg L(-1) respectively at 48 h. This is the first report of Magnoliaceae species with nematicidal activity.     

Nematicidal activity of Ochradenus baccatus against the root‐knot nematode Meloidogyne javanica

Ochradenus baccatus is a widely distributed shrub in desert regions of the Middle East and North Africa. This plant's nematicidal activity against the root‐knot nematode Meloidogyne javanica was evaluated because it has been found to contain exceptionally high levels of glucosinolates. In in vitro assays with aqueous extracts of the plant, 100% of second‐stage juveniles were immobilized after exposure to 4% root‐core extract for 48 h; 8% root‐core extract suppressed their hatching by 87%, whereas stem, flower and root bark showed lower activity. Incorporation of root core or bark into the soil, as fresh or dry powder at 1 and 0·5% (w/w), respectively, reduced the number of nematodes recovered from the soil by 95–100%, whereas the flower and stem were much less effective. Results from further pot experiments indicated that only the root bark consistently contains nematicidal compounds which are effective in soil, whereas the nematicidal activity of the root core in soil was inconsistent. The presence of non‐volatile lipophilic and lipophobic nematicidal compounds in the root bark was suggested by extraction with different polar solvents, but these compounds do not seem to be isothiocyanates – glucosinolate‐hydrolysed compounds with nematicidal activity. Very poor host status of Ochradenus baccatus to M. javanica, M. incognita and M. hapla, but with root‐penetration rates of juveniles similar to those in tomato roots, suggest that this plant may be used as a cover plant or trap plant to reduce nematode populations in the soil.     

枸杞炭疽病菌毒素的初步研究

枸杞炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)可产生有致病力的外毒素,其毒素可引起枸杞叶片形成黑色坏死斑,类似于病原菌侵染形成的症状。Czapek-Dox培养液适于枸杞炭疽病菌的生长和产毒,其适宜温度为25～28℃,初始pH为6,通气条件促进其生长和产生毒素。试验结果表明该毒素为多聚糖类物质,毒素液对不同品种枸杞的致病作用存在明显差异,与品种对枸杞炭疽病的抗性有关。