水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10⁶ ～1.0×10¹ copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10¹ copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^-2 pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。     

犬圆环病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立了犬圆环病毒(canine circovirus, CanineCV)EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法。用PCR方法克隆CanineCV Rep基因中的高保守区,扩增的目的片段大小为217 bp,将其克隆至pMD18-T载体上,构建PCR检测阳性参考质粒,并用阳性参考质粒,进行各项反应条件优化。建立的标准曲线呈现出较高拟合性的线性回归,R²值为0.999 5;该方法检测灵敏度为3.88×10¹ copies/μL;在重复性试验中,组内和组间重复变异系数均小于2%,表明该方法具有良好的重复性;该方法对犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬流感病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、犬冠状病毒等犬常见病原的检测均无交叉反应;临床样本检测表明,所建立的EvaGreen实时荧光定量PCR对CanineCV的阳性检出率为2.82%(5/177),高于普通PCR检测的CanineCV阳性率1.13%(2/177)。本研究成功建立了一种用于快速检测CanineCV的EvaGreen qPCR方法,该方法安全且具有较好的特异性、敏感性和重复性,可作为Canine...     

鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中鸭圆环病毒(DuCV)基因序列,在保守区设计了1对引物,建立了SYBER GreenⅠ荧光定量PCR检测鸭圆环病毒的方法。结果:该方法可检测到每个反应相当于1×102个拷贝的标准品DNA。与H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎病毒等不发生交叉反应,且具有良好的重复性。表明建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上DuCV感染的检测。     

鹅圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹅圆环病毒(GoCV)快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的GoCV全长基因组序列,在其保守基因区设计并合成1对引物,采用荧光嵌合法(SYBR GreenⅠ)建立检测GoCV的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法。以本实验室构建的含有GoCV永康株(GoCV-yk01)全长基因组的重组质粒为标准模板,经退火温度、循环次数等反应条件的优化,绘制GoCV real-time PCR的标准曲线,并进行融解曲线分析。试验结果表明:建立的GoCV real-time PCR方法特异性强,检测范围广(Ct值范围12～32),最低检出病毒拷贝数为1.46×102。该方法能够对组织中病毒进行定量检测,为快速检测GoCV提供了有效的技术手段。     

H1亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种检测H1亚型禽流感病毒(AIV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法.根据对GenBank中H1亚型AIV HA基因序列的分析,设计针对H1亚型AIV的HA基因特异性引物,并以H1亚型AIV的cDNA为模版,构建重组阳性质粒.采用梯度稀释重组标准品阳性质粒DNA的方法,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real-time PCR)标准曲线.敏感性试验结果显示,扩增效率和标准误差分别为100.9％和0.011 7,熔解曲线呈单一熔解峰.在35个Ct值内该方法可检测到100个拷贝的标准品DNA;特异性试验结果显示,该方法对于其他亚型AIV和禽呼吸道病原体不能检出;重复性试验结果显示,组内变异系数小于1％.建立的Real-time PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床上H1亚型AIV的检测.     

羊口疮病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测羊口疮病毒(ORFV)的方法,基于羊口疮病毒保守序列B2L基因合成一对用于建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的特异性引物,将ORFV B2L全长基因和pMD19-T质粒载体连接,构建重组阳性质粒,以构建的重组质粒DNA作为模板,建立ORFV SYBR Green I实时荧光定量P...     

羊传染性脓疱病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank已经发表的CEV参考毒株(登录号:AF097215)F1L基因序列,利用Primer Express 3.0软件设计合成1对特异性引物,以pMD19-T-63bp重组阳性质粒作为标准品,建立了羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。经过反应条件的优化,建立的羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.99,扩增效率E=1.18。该方法敏感性高且特异性强,最低检出下限为65.47拷贝/μL,与羊痘和口蹄疫病毒均不发生交叉反应,重复性好,组内和组间变异系数分别为0.17%~0.59%和0.74%~1.25%。运用该方法对2例羊传染性脓疱病例进行检测,结果均为阳性。因此,可将该方法应用于临床诊断,具有准确、高效、快捷、灵敏的特点。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立及应用

根据GenBank登录的猪流行性腹泻病毒株FJ473395的M基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出182 bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物Tm在85～85.5℃之间,灵敏度为5.875拷贝/μL,特异性和重复性较好。本试验建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断,并定量分析PEDV感染程度奠定了基础。     

犬瘟热病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。     

鹅圆环病毒TB Green实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

鹅圆环病毒主要感染宿主的淋巴细胞,导致其免疫功能下降,造成继发感染和共感染。为建立鹅圆环病毒分子检测方法,本研究根据NCBI数据库中GoCV基因特征,设计特异性引物,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法。结果显示,建立检测GoCV的TB Green实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为54.10拷贝/μL;特异性好,与水禽常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线仅GoCV出现1个特异性单峰,Tm值为（84.46±0.09）℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.26%～0.55%和0.23%～0.87%。利用建立的TB Green实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时对64份临床样品进行GoCV感染的检测,结果显示,常规PCR方法检出阳性样品15份,阳性率为23.44%;TB Green实时荧光定量PCR方法检出阳性样品18份,阳性率28.13%,且15份PCR阳性样品经TB Green实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究为后续开展GoCV感染的分子流行病学调查和致病机理研究提供技术支撑。     

荧光定量PCR检测2型猪圆环病毒方法的建立

通过克隆2型猪圆环病毒（PCV2）的开放阅读框2（0RF2）基因编码其核衣壳蛋白（Cap）的一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的靶序列设计一对引物和一条TaqMan探针.对PCR反应条件优化后,对构建的标准阳性模板定量,然后1 0＆#215;倍比稀释进行荧光定量PCR（qPCR）扩增并制作标准曲线,初步建立了PCV2检测的qPCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0＆#215;102拷贝/μ L,线性范围为101 ～ 109,达9个数量级,并且具有很好的特异性.对起始浓度为1.0＆#215;108、1.0＆#215; 106、1.0＆#215;104拷贝/μL的标准品的最终实际测得CT均值分别为12.77、19.72和26.89;变异系数分别为0.25％、0.10％和0.13％,均小于1％,说明此方法具有良好的准确性和重复性.     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×10²拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是10²～10⁹拷贝/μL,且具有良好的重复性。     

猪弓形虫实时荧光PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感、特异的猪弓形虫检测方法,根据弓形虫保守基因序列,设计一套特异性引物和FAM荧光素标记的MGB探针;通过对PCR反应体系和反应条件进行优化筛选,建立了猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法,并对此PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对60份疑似弓形虫感染的临床样品进行了检测。结果显示:建立的猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法在101～107拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对弓形虫重组阳性质粒出现阳性扩增信号,但对阴性对照的水和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自60份疑似猪弓形虫感染样品中检出32份阳性,并且和克隆测序结果一致。结果表明,本研究建立的猪弓形虫实时荧光定量PCR检测方法可用于猪弓形虫的快速检测,从而为猪弓形虫病的诊断提供了特异、敏感、高通量的方法。     

鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸭副黏病毒(DPMV)和鸭圆环病毒(DuCV)保守基因序列,设计了2对针对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的特异性引物和2条不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的二重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好,对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性分别达到160和140个拷贝数;该方法特异性强,对鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒和H9型禽流感病毒等病原体的检测全为阴性;应用该方法对118份临床病料进行检测,结果检出鸭副黏病毒和鸭圆环病毒阳性感染率分别为0.85%和8.47%,无混合感染。本试验建立的二重荧光定量PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,适用于鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的快速诊断和监测。     

Development of Real-time PCR Method for Rapid Detection of Vibrio parahaemolyticus

To establish a rapid assay for detection of Vibrio parahaemolyticus(VP), Real-time PCR method was developed targeting to toxR gene of Vibrio parahaemolyticus.The results showed that the test for 15 bacteria strains using the Real-time PCR method, only Vibrio parahaemolyticus test was positive, indicating that the method had high specificity.In addition, the sensitivity of Real-time PCR was 4.9 CFU/mL.Furthermore, a total of 3 positive samples for Vibrio parahaemolyticus were detected from 150 clinical samples by the Real-time method, which was in accordance with the testing result by GB 4789.7-2013 standard detection protocol.Therefore, the Real-time method provided a novel rapid and sensitive detection method with good practicality for Vibrio parahaemolyticus infection.     

副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的快速检测方法,本研究以VP toxR基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VP的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有VP检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为4.9 CFU/mL,利用该检测方法对采集的150份样品进行检测,共计检出3份VP阳性样品,与国标法(GB 4789.7-2013)检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

鸽白细胞介素8基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸽白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）基因实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank上公布的鸽IL-8基因序列,在保守区域设计1对特异性引物,以鸽子淋巴细胞提取的核酸为模板扩增鸽IL-8基因部分片段并克隆到pMD18-T载体上。提取重组质粒通过系列制备标准品,建立鸽IL-8基因SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,实时荧光定量PCR熔解曲线呈单一熔解峰,试验线性相关系数为1.0,IL-8基因的扩增效率为103%。敏感性结果显示最低可检测到16个拷贝数;用该方法检测其他鸽白细胞介素细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18）和双蒸水的结果均为阴性。批间、批内变异系数均≤1.52%。因此,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法可用于鸽IL-8 mRNA的检测,为病毒感染宿主细胞后细胞因子表达的定量分析奠定基础。     

Development of a Quantitative Real-time PCR Method for Detection of Pigeon IL-8 Gene

To develop a quantitative Real-time PCR method for detection of pigeon interleukin-8 (IL-8),a pair of specific primers was designed based on the conserved region of IL-8 gene sequence published on GenBank.A fragment of IL-8 gene was amplified from the pigeon lymphocytes template and cloned into pMD18-T vector.Plasmid DNA was extracted from the bacteria and was serially diluted to serve as a standard.A standard curve for the SYBR Green Ⅰ of quantitative Real-time PCR was established and the specificity,sensitivity and reproducibility of this assay were investigated.The results showed that the quantitative Real-time PCR melting curve only had one single melting peak.The assay was linear with R² values was 1.0;The reaction efficiency for the pigeon IL-8 gene was 103%.The detection limit of this assay was 16 copies per reaction.Other interleukin including IL-1β,IL-6 and IL-18 and double distilled water control were tested by this assay and the results were all negative.The CV values of intra- and inter-assay were less than 1.52%.The established quantitative Real-time PCR assay of this study was suitable for the detection of pigeon IL-8.It would provide basis for analyzing cytokine expression quantitatively after the host cell was infected by the virus.     

猪博卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的猪博卡病毒(PBoV)序列,通过VP1/2基因设计引物和Taq Man探针建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法与PPV、PRRSV及PCV均无交叉反应,具有较高特异性,在107 copies/mL～101 copies/mL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.997,最低可检测到101copies/mL的阳性质粒。说明所建立的PBoV实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好和精确性高等优点。     

猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立与Cap基因序列分析

建立一种检测PCV3流行毒株感染的PCR方法,并分析Cap基因序列变异情况,为PCV3流行病学调查提供技术支持.根据GenBank中公开的PCV3全基因序列,分别设计了质粒构建引物和检测引物,通过构建阳性质粒、灵敏度试验、特异性试验、临床样品检测试验以及测序分析,建立PCR检测方法.结果显示:建立的PCR方法检测的极限...