毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3的基因克隆和原核表达分析

为研究毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3的酶学特征和生理功能,本实验对PtCP3进行了基因克隆和原核表达分析。从毛果杨(Populus trichocarpa Torr.Gray)中克隆得到半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3,将其克隆至pMD-18T载体。进一步构建原核表达载体pET30a-PtCP3,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功诱导表达重组蛋白,然后通过包涵体洗涤法对目的蛋白进行纯化。测序结果表明,PtCP3基因CDS序列全长1074 bp,含有木瓜蛋白酶的保守催化位点和组织蛋白酶B的保守结构域。序列分析结果显示,半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3编码357个氨基酸,预测N-末端含有长度为27个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽后蛋白酶大小为36.515 kDa,理论等电点为7.44。SDS-PAGE电泳结果显示,可以检测到大小约为42 kDa的目的条带,并可通过包涵体洗涤法在体外得到了高表达量、单一的重组蛋白PtCP3。     

棉花黄萎病拮抗细菌Bacillus subtilis ZL2-70抗菌蛋白的理化性质和抑菌机理

【目的】旨在研究棉花黄萎病拮抗细菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZL2-70抗菌蛋白的抑菌谱、理化性质以及抑菌机理,为棉花黄萎病生物农药的研制与开发奠定理论基础。【方法】采用抑菌圈法测定该抗菌蛋白的抑菌谱,以及温度、pH、无机离子、有机溶剂、蛋白酶对其稳定性的影响,并通过无菌小瓶等方法研究抗菌蛋白对大丽轮枝菌菌丝和孢子的抑制作用,测定了抗菌蛋白的纤维素酶和几丁质酶活力。【结果】棉花黄萎病拮抗细菌B.subtilis ZL2-70抗菌蛋白抑菌谱广,对19种植物病原菌表现出抑菌活性;该蛋白理化性质相对稳定,耐高温,在pH 5.0~10.0范围内抑菌活性较稳定,经EDTA处理后活性变化不大,对Fe3+敏感,对蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感;该抗菌蛋白对大丽轮枝菌的菌丝生长和孢子萌发有双重抑制作用,能使病原菌菌丝胞壁消融、原生质凝集渗漏、菌丝细胞泡囊化,并可抑制病菌孢子的萌发;抗菌蛋白具有纤维素酶和几丁质酶活性,且酶活力与抑菌活性有关。【结论】初步推断该抗菌蛋白通过多糖酶活力破坏大丽轮枝菌的细胞壁和抑制病原菌的孢子萌发而起到抑菌作用。     

屠宰血液废弃物分解菌的筛选和鉴定

筛选高效血液蛋白分解菌株,并进行鉴定和测定其微生物酶活,为进行屠宰血液废弃物的资源化利用提供试验材料。采用酪蛋白和哥伦比亚血琼脂平板培养基,以产生透明圈的比值大小作为判定的标准,从日喀则地区屠宰场的土壤中分离纯化出1株能高效降解蛋白质的菌株,编号为NwMCC01910045。在血琼脂平板培养基上,于37℃下培养24 h,通过福林酚法测得酶活力大小为88.69 U/mL。经生物学鉴定、生理生化测定和16S rRNA序列分析,并构建系统发育树,鉴定该菌株为吉氏库特菌(Kurthia sp.),是一株能有效降解血液蛋白的菌株。     

薏米蛋白的酶水解工艺优化

为确定蛋白酶水解薏米蛋白的最佳工艺条件,以氮溶解指数(NSI)和水解度(DH)为指标对中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶进行筛选,确定碱性蛋白酶为最佳水解用酶,并通过单因素和二次回归正交旋转试验,建立了碱性蛋白酶水解薏米蛋白的数学模型。结果表明,碱性蛋白酶在底物质量浓度39.95 g/L,酶用量1 201.75 U/g,温度54.61℃,pH值7.99,反应时间4 h的条件下,水解后的氮溶解指数可达95.79%。     

蛋白酶改性处理对小麦面筋蛋白溶解度和起泡性的影响

对小麦面筋蛋白进行蛋白酶改性,可以提高其溶解性及其他功能性质。研究了中性蛋白酶和碱性蛋白酶改性处理方式对面筋蛋白溶解性的影响。结果表明,相对于中性蛋白酶,碱性蛋白酶的水解速率更高。蛋白酶改性面筋蛋白的溶解度随着水解度的增大而增大,达到7.0mg/mL,均大于原谷朊粉,起泡性和起泡稳定性随水解度增加而降低,在水解度DH为4%时达到最大。     

大豆种子活力与贮藏蛋白关系的研究

选用不同基因型的6个大豆品种（系）为材料,通过研究种子萌发过程中贮藏蛋白（主要是球蛋白）的含量变化及降解规律,探讨大豆种子活力的生化机理。结果表明,不同基因型的大豆种子大小和贮藏蛋白含量与种子活力相关均不显著。而不同基因型的不同活力水平大豆种子萌发过程中,高活力种子的贮藏蛋白利用效率远高于低活力种子,且随着萌发天数的增加,高活力种子贮藏蛋白7S组分的降解远快于低活力种子。     

淀粉共生蛋白对淀粉水解的影响

以小麦面粉为原料,研究了淀粉共生蛋白对淀粉酶解性质的影响。对洗淀粉过程中影响蛋白含量的条件进行了单因素试验,用SDS溶液和蛋白酶进一步除去淀粉中的蛋白质成分,然后对制得的含氮量不同的淀粉样品进行酶解。试验结果表明,蛋白酶能有效地去除淀粉共生蛋白,而淀粉共生蛋白有助于淀粉的水解。     

双酶法水解米糠蛋白工艺优化的研究

以米糠为原料,经脱脂后,采用碱性蛋白酶和中性蛋白酶双酶法水解米糠蛋白。在单因素试验的基础上,通过正交试验研究温度、pH、米糠质量分数、两种酶的比例及水解时间比对米糠蛋白水解度的影响。结果表明,影响米糠蛋白水解度的因素主次顺序为:米糠质量分数温度时间比pH酶比;优化的双酶法水解米糠蛋白的工艺条件为:温度45℃,米糠质量分数3%,碱性蛋白酶处理时pH为9.5、中性蛋白酶处理时pH为6.5,时间比3︰1(即碱性蛋白酶4.5 h,中性蛋白酶1.5 h),加酶总量3%时的酶比(碱性蛋白酶︰中性蛋白酶)2︰1。在此工艺条件下,米糠蛋白的水解度达到56.28%。     

中性蛋白酶和碱性蛋白酶对玉米蛋白水解作用的研究

文章研究了中性蛋白酶和碱性蛋白酶对玉米蛋白粉中玉米蛋白的水解效果,结果表明,中性蛋白酶水解玉米蛋白的较佳水解条件是底物质量分数为2．5％、pH值为7．5、酶底比为2％、温度为50℃,水解4h水解度可达24．75％;碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉的较佳水解条件是底物质量分数为1．5％、pH值为10.0、酶底比为1％、温度为60℃,水解4h水解度可达31．04％。     

小麦种子萌发过程贮藏蛋白变化及其与活力关系的研究

选用烟农19与郑麦9023为材料，采用A-PAGE和SDS—PAGE电泳方法，研究了新、陈小麦种子萌发过程贮藏蛋白质的变化及降解速度，结果表明，高活力种子醇溶蛋白变化明显，降解较快，低活力种子醇溶蛋白变化不大，且降解迟缓：高活力种子与低活力种子的谷蛋白降解速度变化均不明显。本研究认为，通过种子萌发过程中贮藏蛋白质电泳图谱分析，可以直观地判断小麦种子的活力水平，其中通过醇溶蛋白电泳图谱判断更好。     

耐高温中性蛋白酶产生菌株KN1的部分酶学性质及发酵条件的研究

为了给酶的应用提供理论依据,采用Folin-酚法测定蛋白酶活性,通过单一变量控制对KN1菌株的蛋白酶酶学特性和发酵条件进行研究。该酶的最适作用温度为75℃,最适作用pH值为7.5,Cu2+离子对酶活有促进作用;EDTA对酶活有明显的抑制作用,而PMSF对酶活的抑制作用小,推测KN1菌株产生的是一种金属蛋白酶;经SDS处理后KN1的蛋白酶仍能保持较高的活性。KN1菌株的蛋白酶的最佳发酵条件为37℃培养4天,最佳碳源为玉米粉,最佳氮源为豆饼粉。KN1菌株的蛋白酶是一种耐高温中性蛋白酶,最适作用温度达到75℃,在最适合条件下,酶活性可达1498.84 U/mL,具有良好的应用前景。     

“两炖一停”烘烤工艺烤烟蛋白酶活性及蛋白质含量的动态变化

为研究“两炖一停”烘烤工艺烤烟蛋白酶活性和蛋白质含量动态变化与常规烘烤变化的差异,设置常规烘烤（对照）和“两炖一停”烘烤2种烘烤方式,研究烘烤过程烟叶的蛋白酶活性和蛋白质含量动态变化。2种烘烤方式烘烤过程中蛋白酶活性均呈升-降-升-降的“双峰曲线”变化规律,第一个峰值出现在变黄期,第二个峰值出现在定色期,以第一个峰值的酶活性更高;蛋白质含量呈下降趋势,在变黄期快速下降,定色期缓慢下降,干筋期变化不大,均以变黄期为蛋白质的主要降解时期,降解幅度均在80%以上。2种烘烤方式中“两炖一停”烘烤2个峰值的酶活性分别为208.5、199.26 U/mg,较对照高出19.46、30.63 U/mg,且峰值区间的酶活性平均值更高,持续时间更长,峰值出现也较对照晚;蛋白质降解以“两炖一停”烘烤的降解幅度更大,变黄期的降解幅度占总降解幅度的89.3%,较对照多8.5个百分点,烤后烟叶蛋白质含量也更低。可见,采用“两炖一停”烘烤的方式可提高烟叶蛋白酶的活性及持续时间,从而更利于蛋白质降解,减少烤后烟叶的蛋白质含量。     

Cd胁迫下生物质高粱SoHMA3基因克隆及表达分析

重金属转运P1B型ATP酶对促进金属离子的吸收、运输、积累、分配和解毒至关重要。其中HMA3蛋白可能通过将镉螯合至液泡从而有助于金属解毒,本研究以不同浓度Cd处理生物质高粱幼苗为材料,克隆获得了SoHMA3基因的全长序列,cDNA全长3179 bp,编码877个氨基酸,编码蛋白的理论分子量为94.44 kD,理论等电点为6.4,为跨膜蛋白,该蛋白属于HAD超家族成员,对该氨基酸序列进行聚类分析表明,其与玉米和水稻的同源性最高,而与芦笋最低。实时定量PCR分析表明,SoHMA3基因在生物质高粱地上部和地下部均有表达,不存在组织特异性;镉胁迫下,该基因在地上部无显著响应,在地下部有显著响应,表明生物质高粱SoHMA3的表达受到Cd胁迫的影响,参与了生物质高粱对Cd的解毒。本研究结果为进一步探究生物质高粱对Cd的吸收、转运及解毒机理提供基础资料。     

黑米发芽过程中蛋白酶变化的初步研究

采用分光光度计法,对黑米发芽过程中蛋白酶含量变化进行测定。实验表明,发芽前处理方法和发芽温度对蛋白酶活力的提高均有影响,黑米中的蛋白质可在蛋白酶的作用下发生水解,其水解产物是人体更容易吸收的氨基酸。     

Physical and Chemical Properties and Antifungal Mechanism of Antifungal Protein Produced by Antagonistic Strain Bacillus subtilis ZL2-70 against Verticillium dahilae

The aim of this study was to investigate inhibition spectrum, characteristics and antifungal mechanism of antagonistic protein of B. subtilis ZL2-70 which possesses strong antagonistic abilities to Verticillium dahilae Kleb., and to offer a theoretical basis for biological control of cotton Verticillium wilt and development of transgenic resistant varieties. The inhibition spectrum of antifungal protein was studied and effects of heat, pH, proteinase, EDTA, inorganic ion on inhibiting activity were also investigated. Furthermore, cellulase and chitinase of the crude antifungal protein were determined and the inhibition to mycelium and spores was studied by different methods. Results indicated that, antagonistic protein of B. subtilis ZL2-70 against Verticillium dahilae has broad inhibition spectrum, which had strong inhibition activity to 21 different plant pathogens. It was relatively stable, could tolerate high temperature, EDTA and proteinases and keep activity in the range of pH 5-10, but it was sensitive to Fe3+. The preliminary study on inhibition mechanism demonstrated that the antifungal protein could break down the mycelium and leak the protoplasm, turn the mycelium cells into bigger sacs and inhibit germination of conidia and the inhibition activity was consistent with cellulase and chitinase activity of antifungal protein. Therefore, the inhibition mechanism is deduced as mycelial growth and spore germination are inhibited by cell enzyme activity of the antagonistic protein.     

SH-110菌海藻糖合成酶基因克隆、表达及酶学性质研究

为找到理想的工业化生产海藻糖合成酶基因工程菌,以长白山温泉SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增编码Tres基因片段,克隆至pET-30a(+)原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),实验中采用IPTG和乳糖同时进行对比诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质研究。成功克隆了2912 bp的Tres基因,实验中发现加入IPTG和乳糖后,融合蛋白在胞内都得到了表达,而且添加乳糖诱导的蛋白表达量偏高。表达重组酶Tres相对分子量约为110 kDa,最适作用温度60℃,最适pH7.0。金属离子Ca2+、K+、Zn2+对重组酶有明显激活作用,Ba2+、Cu2+、Mn2+有明显抑制酶活作用。重组酶的动力学常数Km为8.823 mmol/L和Vmax为235.29 mmol/L。已成功在大肠杆菌表达重组Tres,为进一步研究利用基因工程菌生产大量海藻糖合成酶,进行大规模生产海藻糖提供理论依据。     

重金属污染土壤修复及其对作物效应

为了探讨不同的淋洗剂修复重金属污染的土壤效果,笔者研究利用水、石灰水、EDTA溶液、水+石灰水（即先用水淋洗后,再用石灰水淋洗）、水+石灰水+EDTA溶液（即先用水淋洗后,再用石灰水淋洗,最后用EDTA溶液淋洗）等5种淋洗方法处理尾矿重金属严重污染的土壤。结果表明：水、石灰水以及EDTA溶液等均能提取污染土壤中的重金属,其中EDTA提取的能力最强,水其次,而石灰水最弱;水稻、玉米、大豆和南瓜等4种作物在不经过修复的污染土壤上不能正常发芽生长,而在修复后的土壤上都能正常发芽,但水处理和EDTA溶液处理的土壤,种子发芽后很快死亡,而其他处理的作为仍可继续生长;石灰水或水+石灰水处理的土壤,作物生物量较高;在污染土壤上生长的作物均能吸收重金属,其中大豆和水稻吸收能力较强。这些结果表明,可以利用石灰来修复重金属尾矿污染的土壤,在修复的土壤上生长的大豆和水稻重金属含量较高,在作物布局上要尽量避免种植这2种作物。     

蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究

从养牛厂附近的土壤中分离得到一株产蛋白酶性质优良的菌株,初步鉴定为芽孢杆菌,对其最适产酶条件进行了研究。试验表明,最适碳源为玉米粉,最适氮源为玉米浆,300mL摇瓶最适装液量为60mL,最适接种量为2%,起始pH值为4.5和6.5时有2个产酶高峰,并对其进行酶学性质的研究。该酶最适温度为65℃,最适pH值为7.5,该酶在50℃以下保温30min酶活仍较高,在70℃以上酶活全部丧失。在pH值7.0～9.0时比较稳定,而在pH值5.0以下时酶活下降很快。金属离子Pb2+,鳌合剂EDTA能抑制蛋白酶的活性,而Fe2+能激活蛋白酶活性。     

The Effect of Cultivar and Environment on β-amylase Activity is Associated with the Change of Protein Content in Barley Grains

Eight malt barley cultivars were grown in seven locations with wide ecological differences in China for two successive years to study the cultivar and environmental variation of β‐amylase activity and its association with the change of protein content in grains. The results showed that the variation in β‐amylase activity was mainly attributable to the environment (location and year), although the effect of cultivar was also highly significant. The response of β‐amylase activity to the environment differed markedly among cultivars, reflected by large difference in coefficients of variation for the cultivars grown across diverse locations. The effect of cultivar and environment on protein content showed a pattern similar to that on β‐amylase, but the variations caused by cultivar and, in particular, environment were relatively smaller for protein content than for enzymatic activity. Regression analysis showed that there was a highly significant correlation between protein content and β‐amylase activity for all cultivars but ZAU 3. However, an obvious difference existed in the constants and regressive coefficients of the equation among cultivars, suggesting genetic differences in the effect of the changed protein content on β‐amylase activity.     

能源甜菜BvGST基因在大肠杆菌体内对镉逆境的应答特性分析

为了进一步研究BvGST基因(LOC104898671)在能源甜菜耐受重金属镉逆境胁迫过程中的功能，明确其在细胞解毒镉离子中的作用和应答特性，本研究以780016B/12优为植物材料，通过RT-PCR的方法将BvGST基因克隆并构建于大肠杆菌原核表达载体pEASY-Blunt E1上，并转化到大肠杆菌BL21中。SDS-PAGE电泳表明，通过1 mmol/L IPTG诱导，在重组菌BL21总蛋白的25.9 kDa左右的位置上，获得了大肠杆菌his tag-BvGST的融合蛋白。当施加0.5 mmol/L CdCl2逆境胁迫后，表达BvGST蛋白的重组菌表现出优于对照菌的生长状态；与此同时，大量表达BvGST的大肠杆菌体内的GST酶活性也要远高于对照。这说明，能源甜菜BvGST基因通过在E. coli体内大量表达高活性的谷胱甘肽转移酶，来解毒细胞内由镉胁迫带来的氧化伤害，从而提高大肠杆菌的Cd耐受性。研究结果暗示了能源甜菜BvGST在镉逆境胁迫分子机制中发挥着重要作用。