苦荞鼠李糖基转移酶FtF3GT1基因的克隆与转化毛状根研究

苦荞中的黄酮类化合物具有很高的药用价值和保健功能。以苦荞川荞1号为材料,克隆出FtF3GT1基因,其CDS全长为1 401bp,编码467个氨基酸。系统发育分析表明,FtF3GT1与甜荞中的FeUF7GT蛋白亲缘关系最近。组织特异性表达分析结果表明,FtF3GT1基因在各个组织中均有表达,在根部最低,在茎部最高;MeJA处理苦荞和转pCAMBIA3301:FtF3GT1pro::GUS毛状根中发现,FtF3GT1基因的表达量以及GUS的活性明显受MeJA诱导;转过表达FtF3GT1基因毛状根中,总黄酮含量明显升高,推测FtF3GT1基因可促进黄酮类物质的合成。     

OsWD40过表达水稻根系响应盐胁迫的转录组分析

盐胁迫是影响水稻产量的主要因素之一,开展水稻耐盐机制的研究十分必要。为了揭示OsWD40基因参与耐盐的分子机制,以日本晴和OsWD40过表达水稻株系为材料,用浓度为200mmol/L的NaCl分别处理0、12、24和48h,对其根系进行转录组测序分析。结果显示,比较日本晴和OsWD40过表达株系在盐胁迫相同时间（ST0与NT0、ST12与NT12、ST24与NT24、ST48与NT48）的基因表达量,分别检测到1950、1646、3499和1522个差异表达基因。其中,盐胁迫处理24h的差异表达基因多于0、12和48h处理。对4个比较组的差异表达基因分别进行GO功能富集分析和KEGG代谢通路分析,发现差异表达基因主要富集在盐胁迫响应、脱落酸响应和转录调控等GO条目中,富集的重要代谢通路主要是植物激素信号转导,植物MAPK信号传导途径和苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成相关的次生代谢途径等。同时,转录因子家族基因,如WRKY、MYB和bHLH等,在各比较组中呈现差异表达。由此推测,苯丙烷生物合成和类黄酮生物合成等植物次生代谢途径在OsWD40过表达水稻根系响应盐胁迫中发挥着重要作用,而且OsWD40可能介导响应脱落酸的基因转录调控,激活下游盐胁迫相关基因的表达。     

玉米ZmMGT0基因过表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究

CorA/MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白在维持植物镁离子平衡中具有重要作用。为探讨一个表达受缺镁胁迫诱导的玉米MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白基因ZmMGT10在缺镁胁迫中的功能,构建了ZmMGT10的过表达载体并遗传转化拟南芥,获得了转基因拟南芥株系。同野生型拟南芥植株相比,过表达ZmMGT10增加了低镁胁迫生长下转基因植株的生物量、根长和叶绿素浓度。进一步研究表明,在低镁生长条件下,转基因植株的根和叶中积累的镁离子含量均明显高于野生型植株。此外,在低镁生长条件下,转基因植株根对镁离子的吸收能力明显强于野生型植株。结果表明,过表达ZmMGT10基因可以增强转基因拟南芥植株对低镁胁迫的抵抗。     

大豆GmHDL57基因的克隆及抗盐功能鉴定

HD-Zip I类转录因子在植物抵御非生物胁迫过程中发挥重要功能, 本研究克隆得到1个大豆HD-Zip I类基因GmHDL57 (Glycine max homeodomain-leucine zipper protein 57)。序列分析表明, GmHDL57基因包含1个1038 bp的开放读码框, 编码345个氨基酸, 具有HD-Zip类家族蛋白典型的保守结构域。基因时空表达分析表明, 大豆GmHDL57基因在大豆植株的各个不同时期及不同器官中均有表达, 在花中表达量最高。采用实时荧光定量PCR技术分析了4种非生物胁迫(脱落酸、NaCl、PEG、冷)对幼苗期大豆根中GmHDL57基因表达的影响。结果表明, 该基因表达量受高盐胁迫诱导显著升高, 在脱落酸及干旱胁迫下上升幅度较小, 但在冷胁迫下呈下降趋势。盐胁迫前后GmHDL57基因在根中的表达量明显高于茎和叶, 在盐胁迫48 h时达到峰值, 72 h和96 h时表达量缓慢下降。此外, 构建GmHDL57基因的植物超表达载体, 利用根癌农杆菌转化法获得转基因百脉根, 200 mmol L ^-1 NaCl处理条件下, 转基因百脉根的株高、根长、叶绿素含量、根系活力以及阳离子K ⁺、Ca ²⁺含量显著高于野生型, 而丙二醛含量、相对质膜透性以及Na ⁺的含量明显低于野生型。以上研究结果表明, GmHDL57基因参与了大豆对非生物胁迫的应答过程, 过量表达GmHDL57基因能够显著提高百脉根的抗盐能力。     

芥菜型油菜BjA09.TT8和BjB08.TT8基因调节类黄酮的合成

bHLH类转录因子TT8具有调控植物类黄酮合成的功能。本研究采用同源克隆法,在芥菜型油菜紫叶芥中获得了2个TT8拷贝,分别命名为BjA09.TT8和BjB08.TT8,它们分别编码521和517个氨基酸。定量表达分析表明,这2个拷贝在叶中的表达量均显著高于茎和根中,且都响应茉莉酸(JA)信号,在50μmol L–1的茉莉酸甲酯处理0.5 h后表达量均达到峰值;利用毛状根体系过表达发现,BjA09.TT8和BjB08.TT8分别可使紫叶芥和绿叶芥菜型油菜四川黄籽的毛状根中总黄酮含量升高,同时对类黄酮合成基因Bj.CHS的表达具有促进作用,说明二者在功能上具有冗余性。分别在野生型拟南芥和拟南芥tt8突变体中过表达BjA09.TT8和BjB08.TT8发现,过表达拟南芥植株叶片颜色变紫,植株总黄酮和原花色素含量显著升高。本研究表明,BjA09.TT8和BjB08.TT8基因能够促进芥菜型油菜类黄酮的合成,为进一步解析芸薹属植物原花色素合成的调控机制提供了参考。     

R2R3-MYB转录因子GmMYB184调节大豆异黄酮合成

异黄酮是一类主要含在豆科植物中的次生代谢物, 在植物防御体系中发挥重要作用, 并与人类健康密切相关。大豆异黄酮含量受多基因和复杂代谢网络控制, 调控代谢途径上的结构基因不能显著改变大豆异黄酮含量, 与异黄酮代谢途径相关的转录因子的鉴定和应用可能会有效解决这个问题。本研究克隆了一个与大豆异黄酮合成相关的R2R3类型MYB转录因子GmMYB184, 并进行了初步的功能验证。亚细胞定位研究结果表明GmMYB184转录因子定位于细胞核。组织表达分析结果表明该转录因子基因与IFS2 (异黄酮合酶2编码基因)的表达模式相同。同时, GmMYB184和IFS2的表达模式与异黄酮的积累模式相似。谷胱甘肽诱导表达分析表明该转录因子基因与IFS2共同被诱导, 说明这两个基因可能参与同一或相似的生物过程。采用双荧光素酶报告系统分析其对异黄酮合成途径关键基因的转录激活活性影响, 发现GmMYB184能够促进IFS2和CHS8启动子表达活性分别提高5倍和7倍。最后, 通过发根农杆菌介导的遗传转化系统, 找到该转录因子在异黄酮合成调控中的直接作用证据。沉默GmMYB184导致大豆毛状根异黄酮含量的显著下降。但是, 过表达GmMYB184不足以显著提高毛状根中异黄酮的含量。总之, 本研究为大豆异黄酮合成分子机制探索及大豆异黄酮品质改良提供了理论依据。     

苦荞FtC4H基因克隆与生物信息学分析

克隆苦荞苯丙烷类物质代谢途径中的关键酶肉桂酸-4-羟基化酶基因（FtC4H）,为进一步研究其功能奠定基础。以云荞1号和小米荞为材料,提取不同发育期果壳RNA,利用RT-PCR法克隆苦荞FtC4H基因,运用生物信息学分析FtC4H蛋白的特征,构建FtC4H蛋白系统进化树,分析其基因表达。结果表明,克隆的FtC4H基因序列包含1299bp完整的cDNA开放阅读框,编码432个氨基酸,为亲水性不稳定碱性蛋白,具有P450超家族保守域,不具有跨膜结构域,有丰富的二级结构,三级结构预测显示FtC4H与6vby.1.A的序列相似度高。系统进化分析结果表明,本研究克隆的FtC4H与已报道的苦荞其他C4H基因不同。qRT-PCR结果表明,FtC4H在小米荞的花和叶中相对表达量显著高于云荞1号。     

amiRNA技术沉默C-3氧化酶编码基因StCPD对马铃薯抗旱性的影响

CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarf)基因编码C-3氧化酶, 为油菜素内酯(brassinosteroid, BR)生物合成途径中的限速酶, 在植物响应逆境胁迫过程中具重要调控作用。本研究利用人工microRNA (artificial microRNA, amiRNA)技术, 构建马铃薯CPD基因(StCPD)的干扰表达载体pCPB121-amiRcpd, 通过根癌农杆菌介导法将其转入马铃薯栽培品种“紫花白”, 获得转基因植株(Ci1~Ci5), 其中Ci1和Ci3的StCPD基因干扰程度分别为78%和90%。基因组织表达特异性分析表明, StCPD在马铃薯试管苗叶片中表达量最高, 是茎和根中表达量的3.05倍和1.65倍。转基因植株株高、茎粗、根长、鲜重及薯的大小和鲜重等指标均较非转基因(NT)植株显著下降, 表明StCPD基因干扰表达后, 植株的长势明显受到抑制。模拟干旱胁迫处理下, 转基因植株叶片中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著高于NT植株, 而脯氨酸含量显著低于NT植株。转基因和NT马铃薯中, StCPD基因的表达量、MDA和脯氨酸含量均显著高于对照; 且随着胁迫处理时间延长, 基因表达量呈持续增强趋势, MDA和脯氨酸含量随之增加。结果表明, StCPD基因干扰表达能明显降低马铃薯对干旱胁迫的抵抗能力, 为进一步研究BR对马铃薯生长发育和对干旱胁迫的响应奠定了基础。     

不同促根措施对皖南烤烟成熟期钾素代谢的影响

以大田正常施肥为对照（CK）,设置增施黄腐酸钾（TPFA）、γ-聚谷氨酸（TPGA）和豆浆灌根（TSRI）3个处理,研究不同促根措施对烤烟成熟期根系生理、烤后烟叶钾含量、烟株不同部位钾积累量、钾离子通道基因（NKT1、NtKC1、NtORK1、NtTPK1）和转运体基因（NtHAK1、NtKT12）表达量的影响。结果表明,处理的根鲜重、干重和体积均显著高于CK处理,TPFA和TSRI处理的根系活力显著高于TPGA处理;TSRI和TPGA处理可明显提高烤后烟叶的钾含量;不同促根措施可显著促进根、茎和中部叶的钾积累量;TSRI处理的根中NtORK1的相对表达量显著低于CK处理,TPGA和TPFA处理的上部叶和中部叶NtORK1的相对表达量极显著低于CK处理;TSRI处理根中NtTPK1的相对表达量极显著高于其他处理;3个处理根中NtHAK1的表达量极显著高于CK处理。综合来看,TPGA和TSRI处理不但能促进根系发育、提高钾积累量,而且成熟期烟株对钾的吸收和转运能力强,增加烤后烟叶的钾含量。     

转录因子BvM14-Dof3.4响应盐胁迫的功能研究

Dof(DNA binding with one finger)家族转录因子是植物特异的转录因子,在胁迫响应、种子发芽、氮同化、光合作用等多种生物学过程中发挥着重要作用。为了探究转录因子BvM14-Dof3.4在响应盐胁迫过程中的生物学功能,本研究以具有强耐盐特性的甜菜M14品系为试验材料,用花序浸染法将BvM14-Dof3.4基因在野生型拟南芥植株中异源表达,经150 mmol/L NaCl处理后发现,BvM14-Dof3.4基因的异源表达促进了盐胁迫下转基因拟南芥植株根的生长,提高了异源表达植株的鲜重和干重,与野生型拟南芥相比异源表达植株中K⁺/Na⁺比值增加1.3倍、甜菜碱含量增加1.1倍以及SOD和POD的酶活性分别上调1.3和1.2倍,从而减少了盐胁迫对异源表达拟南芥植株的损伤。这些结果表明了BvM14-Dof3.4基因响应盐胁迫,并且BvM14-Dof3.4基因的异源表达能够提高拟南芥植株的耐盐能力,该结果对甜菜M14品系优质基因资源的挖掘以及开展栽培甜菜抗逆性的遗传改良工作具有重要意义。     

苦荞漆酶基因的克隆与生物信息学分析

利用RT-PCR技术从苦荞中克隆出2条漆酶（laccase）基因,运用生物信息学技术对2个基因序列进行分析,预测结构域、二级和三级蛋白结构,进行蛋白同源比对及进化树分析。结果表明,FtLAC-1基因序列开放阅读框为1695bp,编码564个氨基酸,FtLAC-2基因序列开放阅读框为1707bp,编码568个氨基酸。FtLAC-1和FtLAC-2蛋白预测分子量分别为61.41和62.47kDa,理论等电点分别为9.45和9.41,为亲水性蛋白,2个基因序列相似性较低,氨基酸序列同源性不高。qRT-PCR分析出其在苦荞不同组织器官存在差异性表达。结论为进一步探索FtLAC-1和FtLAC-2在苦荞薄果壳形成中的功能提供理论基础。     

3个苦荞品种对盐胁迫的生理响应及耐受性评价

为研究不同苦荞品种对盐胁迫的生理响应及耐受性,以3个苦荞品种野鸡苦荞、宁苦2号和湖南苦荞7-2为材料,采用盆栽试验,分别用0、50、100、150mmol/L NaCl溶液处理,通过观察和测定幼苗叶片形态特征、幼苗生长指标和生理生化指标,采用隶属函数分析法对不同苦荞品种耐盐性进行综合评价。结果显示,在盐胁迫下3个苦荞品种叶片出现失水皱缩和黄化腐烂的症状,以高浓度伤害最明显;随NaCl浓度的升高,3个苦荞品种的鲜重、干重、株高、茎粗和根长均表现出下降趋势;叶绿素、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性呈先上升后下降趋势,以100mmol/L处理最高,过氧化物酶活性和相对电导率呈上升趋势,以150mmol/L处理最高;根系活力呈下降趋势,以150mmol/L处理最低。经过隶属函数分析及综合评价,3个苦荞品种耐盐性表现为宁苦2号>湖南苦荞7-2>野鸡苦荞。     

苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析

为深入研究液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白在植物耐盐中的作用,以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料,利用同源克隆方法得到NHX基因,命名为FtNHX1,并在Gen Bank中注册,登录号为KY438929;序列分析表明,该基因开放阅读框1 662 bp,共编码553个氨基酸,预测蛋白分子量61.24 kDa,等电点5.15。系统进化树分析表明,FtNHX1与拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麦(TaNHX1)的亲缘关系较近,氨基酸同源率分别为60.22%,58.95%和57.30%;荧光定量PCR分析表明,随着Na Cl胁迫浓度的增加,FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的相对表达量极显著增加,150 mmol/L NaCl胁迫下增加幅度最大,分别比对照增加了254.10%,311.35%和256.18%;Na Cl胁迫下FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的平均表达量分别比对照增加了109.46%,145.67%和155.94%,茎基部和叶片的平均表达量较高,说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫诱导和调节,FtNHX1基因与苦荞麦的耐盐性有密切联系。     

芥菜型油菜BjuB.KAN4基因调控类黄酮的途径

MYB类转录因子KAN4有调控植物原花青素合成的功能。为了探究芥菜型油菜中MYB转录因子KAN4对原花青素合成的调控机理,本研究以芥菜型油菜紫叶芥为实验材料,克隆了一个BjuB.KAN4基因,编码266个氨基酸,BjuB.KAN4蛋白包含一段高度保守的MYB-like DNA结合结构域,属于1R-MYB转录因子家族成员。基因表达分析表明, BjuB.KAN4在根中表达量显著高于叶和茎中, GUS组织化学染色分析试验推测,该基因可能在根茎叶的维管组织中表达。利用毛状根体系过表达BjuB.KAN4发现,类黄酮合成途径的部分关键酶基因Bju.CHS和Bju.DFR等的表达量在紫叶芥和四川黄籽的转基因根系中均显著增加,紫叶芥转基因根系中总黄酮含量为2.798 mg g~(-1),是对照组的1.3倍,四川黄籽中总黄酮含量为2.567 mg g~(-1),是对照组的1.2倍。在拟南芥中异源表达BjuB.KAN4发现,转基因植株总黄酮含量为0.237mgg~(-1),是野生型的1.5倍,原花青素含量为0.363mgg~(-1),较野生型含量下降。本研究表明,BjuB.KAN4基因参与调控芥菜型油菜类黄酮合成,为研究芸薹属植物原花青素合成的调控机理提供了参考。     

Production of phenolic compounds in hairy root culture of tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn)

Fagopyrum tataricum Gaertn (tartary buckwheat) is an excellent medicinal and nutrient-rich crop. It has a high content of rutin and other phenolic compounds. An experiment was conducted to investigate in vitro production of phenolic compounds from hairy root culture of tartary buckwheat. Hairy root growth was promoted by increasing culture time in MS medium. The highest hairy root growth reached up to 11.2 g/l dry weight at 18 d after placement. Transformation was confirmed by PCR using rol genes, rol A (304 bp), B (797 bp), C (550 bp), and D (1035 bp) genes which is transferred into hairy roots from the Ri-plasmid in Agrobacterium rhizogenes and is responsible for the induction of hairy root from plant species. Rutin, quercetin, (−) epicatechin, (−) catechin hydrate, gallic acid, ferulic acid, chlorogenic acid, and caffeic acid were identified both in hairy and wild type roots of tartary buckwheat. The main compound found in the both types of root was epicatechin followed by rutin. The concentration of phenolic compounds in the hairy roots of tartary buckwheat was several-fold higher compared with wild type roots of same species. Our results indicate that hairy root culture of F. tataricum is a valuable alternative approach for the production of phenolic compounds.     

甜菜M14品系BvM14-RIN4基因的克隆及应答盐胁迫分析

为了研究甜菜单体附加系M14品系RIN4基因耐盐功能,本研究以甜菜M14品系为实验材料,通过PCR技术获得BvM14-RIN4基因cDNA全长序列,对BvM14-RIN4基因进行了生物信息学分析、组织特异性和应答盐胁迫分析。BvM14-RIN4基因ORF长度为264 bp,编码87个氨基酸,蛋白分子量为 9.67 kDa,理论等电点为9.64,初步鉴定该蛋白为亲水性蛋白;BvM14-RIN4蛋白质二级结构主要由延伸链和无规卷曲组成;BvM14-RIN4蛋白质三级结构预测出该蛋白的保守结构域和疏水区;系统进化树分析结果表明BvM14-RIN4蛋白与菠菜SoRIN4和藜麦CqRIN4蛋白亲缘关系最近;荧光定量PCR结果显示,BvM14 -RIN4基因在根中表达量是叶的2.26倍,说明其具有组织特异性;该基因在200 mmol/L NaCl处理后的根中上调表达,说明它参与甜菜M14品系应答盐胁迫过程。本研究在挖掘甜菜M14品系优质基因和开展甜菜遗传改良工作等方面具有重要意义,为后续该基因的功能研究提供了重要参考。     

转录因子BvM14-GAI耐盐功能研究

转录因子在植物应答逆境胁迫过程中发挥着重要作用,GAI蛋白是植物转录因子家族的重要一员,对其研究主要集中在光响应机制领域,而该蛋白响应耐盐机制研究报道较少。实验室前期已经获得甜菜 M14品系盐胁迫转录组中上调表达基因BvM14-GAI的cDNA全长,本研究试图阐明该基因参与盐胁迫的功能。通过构建该基因植物表达载体,利用农杆菌介导花序浸染法转化拟南芥野生型和GAI基因突变株,检测150 mmol/L NaCl胁迫下异源表达和异源互补拟南芥植株的表型和生理生化指标。0 mmol/L NaCl处理时,以拟南芥野生型和GAI基因突变株为对照,异源表达和异源互补植株的根长、鲜重和干重均显著低于对照,说明BvM14-GAI基因为生长负调控因子;150 mmol/L NaCl胁迫处理后的根长、鲜重、干重及K⁺/Na⁺差异不显著,但甜菜碱、SOD和POD酶活性的含量显著增加,表明转录因子BvM14-GAI通过增强渗透调节和抗氧化酶系统提高异源表达和异源互补拟南芥植株的耐盐功能。研究结果不仅拓展了植物GAI基因响应非生物胁迫的功能,而且对阐明甜菜M14品系耐盐分子机制和培育耐盐作物品系具有一定研究价值。