高粱转录因子SbWRKY71基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究通过基因克隆的方法,从高粱BTx623中克隆得到一个WRKY转录因子基因(SbWRKY71),该转录因子基因全长1 335 bp(phytozome登录号:Sb04g005520),编码364个氨基酸,分子量为38.95 kDa;预测该转录因子定位于细胞核,具有WRKY转录因子典型的保守结构域,且该蛋白属于WRKY蛋白家族的第Ⅱ组成员。系统进化树分析表明,高粱SbWRKY71氨基酸序列与禾本科作物玉米ZmWRKY71的亲缘关系最近,为75%;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测表明,SbWRKY71基因表达具有组织特异性,在叶中表达丰度最高,茎中最低。经激素水杨酸(SA,1 mmol·L^-1)、吲哚-3-乙酸(IAA,10 μmol·L^-1)和脱落酸(ABA,200 μmol·L^-1)处理后,SbWRKY71的表达量呈现先下降后升高再下降的趋势;在γ-氨基丁酸(GABA)和甘露醇(D-Mannitol,300 mmol·L^-1)模拟干旱胁迫以及氯化钠(NaCl,250 mmol·L^-1)盐胁迫处理下,SbWRKY71的表达量均先升后降,分别在3、6和9 h达到最大值;高粱经病原相关分子模式(PAMPs)flg22(100 nmol·L^-1)、翻译延长因子(elf18,100 nmol·L^-1)处理后,SbWRKY71表达均受到抑制,但在几丁质(Chitin,8 nmol·L^-1)处理下,SbWRKY71受到诱导表达。本研究为进一步探索SbWRKY71基因在调节高粱抗性、响应激素以及逆境胁迫应答等过程中的作用机制提供了基础。     

高粱SbJAZ1基因克隆与表达分析

JAZ1基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为克隆高粱SbJAZ1基因及研究其响应胁迫表达特性,本试验以高粱品种BTx623为研究材料,提取其总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板扩增SbJAZ1基因,并对其进行生物信息学、基因表达和原核表达分析。结果显示,SbJAZ1基因全长606 bp,编码201个氨基酸,蛋白质等电点为7.70,分子量大小为21.15 kDa;SbJAZ1与玉米相应同源基因亲缘关系最近,为亲水性蛋白;二级结构中α螺旋占25.37%、延伸链占9.95%、β转角占4.98%,无规则卷曲占59.70%。qRT-PCR分析表明,SbJAZ1在高粱根、茎、芽和叶组织中均有表达,且具有组织表达特异性,在茎中表达量最高;茉莉酸(JA)处理1 h后,SbJAZ1在高粱茎中表达量最高;吲哚乙酸(IAA)和PEG-6000可诱导SbJAZ1的表达。原核表达结果显示,SbJAZ1在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株诱导表达的最佳条件为:温度30℃,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol·L^-1。本研究结果为SbJAZ1基因的生物学功能研究提供了基础。     

薄壳山核桃CiSULTR2.1基因的克隆与表达分析

为探究薄壳山核桃CiSULTR2.1基因功能及表达特征,以一年生薄壳山核桃实生苗为材料,利用RT-PCR和PCR技术克隆CiSULTR2.1基因全长,利用RT-qPCR技术分析其在不同浓度硒酸盐处理下的表达情况。结果表明,克隆得到1 902 bp的序列,经分析此序列属硫转运蛋白基因CiSULTR2.1全长开放阅读框的cDNA,编码633个氨基酸。CiSULTR2.1蛋白分子质量为68 943.37 Da,为疏水性的非分泌蛋白,无信号肽,结构稳定,二级结构主要由α-螺旋(51.18%)、延伸链(12.64%)和无规则卷曲(31.28%)构成,包含硫转运蛋白典型的Sulfate-transp结构域(PF00916)和STAS结构域(PF01740)。RT-qPCR分析结果表明,CiSULTR2.1在薄壳山核桃幼苗根与叶中均有表达,40、80 μmol·L^-1硒酸盐处理下,12 h出现表达高峰,此后表达量明显下降;而0.5 μmol·L^-1硒酸盐处理下,CiSULTR2.1表达高峰出现时间延后至48 h。硒酸盐浓度过高时,CiSULTR2.1表达量显著下降且低于对照。CiSULTR2.1基因能够快速响应40、80 μmol·L^-1高浓度硒酸盐的诱导,而0.5 μmol·L^-1低浓度硒酸盐需要较长时间才能诱导其高表达。高浓度硒酸盐处理较长时间对植物产生毒性效应,植物对硒酸盐的吸收减少,硒含量降低。本研究结果为薄壳山核桃CiSULTR2.1基因功能及硒吸收机制的研究提供了理论依据。     

巴哈雀稗PnDREB2基因克隆及时序表达图谱构建

脱水反应元件结合蛋白(DREBs)在植物非生物逆境胁迫中可调节下游一系列抗逆基因的表达。为探究巴哈雀稗DREB2基因在逆境胁迫下的功能,本研究采用RNA-Seq结合RT-PCR技术从巴哈雀稗中获得一个DREB2基因CDS区全序列,命名为PnDREB2(GenBank登录号:MH150946)。核苷酸序列分析表明,该基因开放阅读框全长774 bp,编码257个氨基酸,相对分子质量为28.09 kD,理论等电点为5.25;该植物蛋白中具有DREB类基因家族典型的保守域AP2结构域,属于DREB2类转录因子A类中A2亚类的亚型1。进化和聚类分析结果表明,巴哈雀稗PnDREB2基因与高粱、割手密、玉米、谷子及牛鞭草亲缘关系较近,氨基酸序列同源性分别为91.10%、89.50%、88.20%、87.60%和87.60%。RT-qPCR和生物信息学分析表明,PnDREB2基因在茎中表达量最高,幼穗次之,叶最低;表达产物定位于细胞质中,具有26个磷酸化位点,并具有结构和功能的特异性。PnDREB2表达量受干旱(PEG-6000,20%)和高温(40℃)的强烈诱导,同时也受到高盐(NaCl,300 mmol·L^-1)、低温(4℃)、脱落酸(ABA,100 μmol·L^-1)和赤霉素(GA,100 μmol·L^-1)等非生物胁迫和激素的不同程度诱导,随着处理时间的延长,整体上均呈先增加后降低的趋势。本试验为巴哈雀稗抗逆分子机理研究与抗性增强的转基因材料培育奠定了理论基础。     

高粱抗病基因SbSGT1的克隆及原核表达

为探究高粱抗病基因SbSGT1的功能,以高粱BTx623为材料,利用RNA反转录得cDNA,以cDNA为模板扩增出全长SbSGT1基因,并对其进行生物信息学分析。进一步构建pET-28a-SbSGT1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导浓度进行了优化。结果表明,SbSGT1全长1 095 bp,编码364个氨基酸,蛋白理论分子大小约为40.45 kDa,蛋白质等电点为5.0。进化树分析表明,SbSGT1与玉米和水稻的亲缘性较高;蛋白质序列分析表明,SbSGT1蛋白为亲水性蛋白,定位在细胞质中;二级结构预测发现其α螺旋和无规则卷曲占比最高,分别达到43.41%和45.88%。原核表达结果表明,SbSGT1最佳表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3),最佳诱导温度和IPTG浓度分别为25℃和0.8 mmol·L^-1。本研究为进一步探究SbSGT1基因在高粱抗病机理中所发挥的生物学功能奠定了基础。     

锶对菠菜幼苗生长、光合和抗氧化酶活性的影响

为探究锶对植物生长生理的影响,以菠菜幼苗为试验材料,研究不同浓度(0、0.1、0.5和2.5 mmol·L^-1)锶处理对菠菜幼苗的叶片鲜重、叶片锶浓度、光合指标和抗氧化酶活性的影响。结果表明,0.1 mmol·L^-1 SrCl₂处理对菠菜幼苗生长和各项生理指标均未产生明显影响,叶片锶浓度在35 mg·kg^-1左右。0.5 mmol·L^-1 SrCl₂处理对菠菜幼苗生长表现为先促进后抑制;处理20 d后,抗氧化酶活性明显上升,丙二醛(MDA)、净光合速率(Pn)和叶片鲜重相较于对照组分别增加了24%和降低了15%、10%,叶片锶浓度达到318.33 mg·kg^-1。2.5 mmol·L^-1 SrCl₂处理下,植株生长受到明显抑制,抗氧化酶系统的响应更为强烈,处理20 d后MDA增加了68%,Pn和叶片鲜重分别降低了30%和48%,叶片锶浓度达到857.51 mg·kg^-1。综上,低浓度锶处理对菠菜生长未产生明显影响,但随着锶处理浓度的增加和胁迫时间的延长,植物生长受到的胁迫作用加剧。本研究为明确锶对菠菜生长生理的调控机理提供了理论依据。     

海藻糖对转C4型PEPC水稻种子萌发耐旱性的影响

为揭示海藻糖参与高表达转玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(C₄-PEPC)水稻(Oryza sativa)(简称PC)在干旱胁迫下种子萌发的生理机制,本研究以PC及其未转基因野生型受体Kitaake(简称WT)种子为材料,研究外施不同浓度海藻糖联合干旱处理下,其种子活力、萌发过程中可溶性糖和脯氨酸含量、α-淀粉酶活性,以及α-淀粉酶、PEPC、糖信号、部分海藻糖相关基因的表达。结果表明,干旱处理均显著抑制了两材料的发芽率,并且抑制了芽的生长;外施低浓度海藻糖可缓解干旱对种子萌发的抑制,与WT相比,PC对海藻糖更加敏感,当海藻糖浓度为0.5 mmol·L^-1时已表现出明显的缓解效应,且较10 mmol·L^-1海藻糖对WT的缓解效果更佳。外施0.5 mmol·L^-1海藻糖联合干旱处理可以维持水稻的种子活力、种子内渗透调节物质含量以及α-淀粉酶活性,尤其有益于PC。外施0.5 mmol·L^-1海藻糖通过上调PC内依赖钙信号的CBL1-OsSnRK3.1/3.23基因的表达,激活OsK1a-OsMYBS1/2-OsAmy3/8途径;同时诱导OsTPP1/7合成海藻糖,上调蔗糖和葡萄糖含量,进而增强糖代谢,维持种子萌发。此外,海藻糖也上调了SAPK8/9/10和C₄-PEPC的转录水平,使PC在芽期表现耐旱。本研究结果为改善直播稻田的发芽率和“C₄稻”的创制提供了新线索。     

γ-氨基丁酸对低温胁迫下桃果实蔗糖代谢的影响

为探讨γ-氨基丁酸(GABA)对低温胁迫下桃果实蔗糖代谢的影响,以湖景蜜露品种水蜜桃为试验试材,采用5 mmol·L^-1外源GABA和100 μmol·L^-1 GABA-T抑制剂(VGB)处理桃果实,比较分析水蜜桃出汁率、GABA含量、可溶性糖含量、蔗糖代谢中间产物以及蔗糖代谢相关酶基因的变化。结果表明,外源GABA处理和GABA复合VGB处理通过提高桃果实贮藏后期内源GABA含量和蔗糖含量,从而有效抑制桃果实在低温贮藏期间冷害的发生。此外,外源GABA处理抑制了贮藏后期蔗糖降解相关酶基因PpSUS5的表达,减缓了桃果实中蔗糖含量的降低速率,从而提高了果实抗冷害的能力。外源GABA复合VGB处理增强了贮藏后期蔗糖合成相关酶基因PpSPS1、PpSPP1和PpSUS3的表达,从而维持桃果实较高的蔗糖含量,抑制果实冷害发生。本研究结果为桃果实采后贮藏保鲜提供了理论依据。     

玉米转录因子ZmBES1/BZR1-7基因克隆及功能分析

BES1/BZR1蛋白是油菜素内酯信号途径的唯一转录因子,在植物生长发育及逆境应答中发挥重要作用。为了探究玉米ZmBES1/BZR1-7基因的功能,从玉米自交系B73中克隆到ZmBES1/BZR1-7基因,并对其功能进行初步分析。序列分析结果表明,ZmBES1/BZR1-7基因无内含子,开放阅读框(ORF)长975 bp,编码324个氨基酸。ZmBES1/BZR1-7蛋白N端高度保守,包含bHLH结构域,与水稻OsBZR1-1相似性达75.95%。实时荧光定量PCR结果表明,ZmBES1/BZR1-7在玉米叶和根中的表达受渗透与盐胁迫诱导显著;16% PEG-6000和100 mmol·L^-1 NaCl处理12 h,叶片中ZmBES1/BZR1-7表达量分别为对照的17.8倍和19.8倍。酵母激活试验结果表明,ZmBES1/BZR1-7蛋白具有转录激活活性。共相关分析结果表明,玉米中有72个基因与ZmBES1/BZR1-7基因的表达相关性较高,启动子区均含有E-box或BRRE元件,推测可能是ZmBES1/BZR1-7转录因子调控的靶基因,主要参与细胞、细胞组分、细胞代谢过程等。本研究结果为深入解析玉米ZmBES1/BZR1-7的功能及其调控网络奠定了基础。     

离子液体[C3mim]BF4对小白菜幼苗抗氧化特性的影响

为探讨离子液体1-丙基-3-甲基咪唑四氟硼酸([C₃mim]BF₄)对植物种子萌发、幼苗生长及生理生化的影响,采用水培法检测不同浓度(0、100、200、300、400、500 mg·L^-1)[C₃mim]BF₄条件下小白菜幼苗的生长状况、活性氧水平、抗氧化酶活性及相关抗氧化酶基因表达。结果表明,浓度高于400 mg·L^-1的[C₃mim]BF₄显著抑制种子萌发;500 mg·L^-1 [C₃mim]BF₄显著抑制幼苗生长。[C₃mim]BF₄处理使小白菜叶片活性氧$\mathop{{O}}_{2}^{{\mathop{}_{\ ·}^{-}}}$、H₂O₂)水平及丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)含量升高,且随着[C₃mim]BF₄浓度的增加均呈逐渐升高的趋势。[C₃mim]BF₄使小白菜叶片谷胱甘肽还原酶(GR)活性显著升高;浓度≤300 mg·L^-1的[C₃mim]BF₄对过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)生成有一定的促进作用,而浓度高于400 mg·L^-1 [C₃mim]BF₄处理显著抑制小白菜 APX活性,高于500 mg·L^-1 [C₃mim]BF₄处理显著抑制小白菜 CAT活性;100~500 mg·L^-1[C₃mim]BF₄处理显著抑制小白菜叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性,且各处理组的SOD活性均显著低于对照。400 mg·L^-1 [C₃mim]BF₄处理0~3 h,小白菜Gu/Zn-SOD和APX基因表达量升高,处理13 d时其SOD和APX基因表达量均显著低于对照;处理0~12 h时 CAT基因表达上调,处理24 h处理后CAT表达下调。本研究结果为揭示咪唑类离子液体毒性机理提供了理论依据。     

欧洲缬草不定根悬浮培养及其有效成分的测定

为高效生产欧洲缬草有效成分,通过分析培养基pH值、碳源、糖浓度、盐浓度、总氮(N)浓度、总磷(P)浓度等因素对其不定根悬浮培养生长的影响,确定欧洲缬草不定根悬浮培养的适宜条件,并测定在该培养条件下不定根的生长状况,同时比较正常不定根、褐化不定根、无菌苗根中缬草三酯、乙酰缬草三酯和缬草烯酸3种有效成分的含量。结果表明,欧洲缬草不定根的最佳培养条件为2倍大量元素浓度、48.46 mmol·L^-1总N浓度、1.5 mmol·L^-1总P浓度的RCM培养基,添加40 g·L^-1蔗糖、0.5 mg·L^-1 萘乙酸(NAA),pH值5.7,温度25±2℃,转速100 r·min^-1暗培养,28 d后收获。最佳培养条件下的欧洲缬草正常不定根中缬草三酯、乙酰缬草三酯、缬草烯酸的含量均最高,分别为7.222、0.355、4.016 mg·g^-1,褐化不定根中成分含量显著降低,无菌苗根中成分含量最低。本研究结果可为欧洲缬草不定根及其有效成分的规模化生产提供参考。     

马来甜龙竹种胚培养增殖芽芽尖再生体系建立

为建立马来甜龙竹高效稳定的再生体系,本研究以马来甜龙竹种胚培养增殖芽的芽尖为试验材料,研究不同植物激素、有机添加物以及弱光处理对其再生体系建立的影响。结果表明,马来甜龙竹芽尖愈伤组织诱导较适宜培养基为添加0.5~1.0 mg·L^-1 NAA和3 mg·L^-1 2,4-D的MS培养基,致密颗粒状愈伤组织诱导率达61.7%;较适宜的分化培养基为添加1 mg·L^-1 6-BA、1 mg·L^-1 KT和0.25 mg·L^-1 NAA的MS培养基,10 μmol·m^-2·s^-1弱光处理6 d,分化率达46.67%,再生苗伸长生长良好;较适宜的生根培养基为添加3 mg·L^-1 IBA的1/2 MS培养基,生根率为55%,根较粗,其中部分根长有侧根。试管苗移植到混合基质中,成活率为83.33%。本研究初步建立了马来甜龙竹种胚培养增殖芽芽尖再生体系,为马来甜龙竹遗传转化体系的研究和应用奠定了基础。     

盐胁迫下草麻黄电阻抗图谱参数的变化及离子平衡机制

为探讨草麻黄对盐胁迫的适应性,以2年生草麻黄苗为试验材料,采用盆栽法测定在不同NaCl浓度、不同胁迫时间下草麻黄苗各项电阻抗图谱参数(EIS)变化及5种矿质离子含量,并分析各电阻抗参数、相对电导率及矿质离子含量之间的相关性。结果表明,随着NaCl浓度的增加和胁迫时间的延长,草麻黄地上部相对电导率逐渐升高,其中200 mmol·L^-1NaCl胁迫28 d以上时的相对电导率显著高于对照,200、300、400 mmol·L^-1盐胁迫下的相对电导率分别为对照的1.43、1.52、1.65倍;电阻抗图谱参数高频电阻率(r)、低频电阻率(r₁)、胞内电阻率(r_i)、胞外电阻率(r_e)、弛豫时间(τ)及弛豫时间分布系数(Ψ)均呈先下降后上升再下降或先下降后上升的变化趋势,其中r、r₁、r_e、r_i、Ψ均在NaCl浓度超过200 mmol·L^-1时出现再次下降,且呈不可逆的下降趋势。随着胁迫天数的增加,草麻黄地上部和根中Na⁺含量逐渐增加,K⁺含量逐渐下降,K⁺/Na⁺显著降低。盐胁迫下,草麻黄地上部Zn、Fe、Mg含量均有不同程度的降低。相关性分析结果表明,K⁺/Na⁺与r_e、r、r₁均呈极显著正相关,与r_i呈显著正相关,其中 K⁺/Na⁺ 与r_e的相关性最高,相关系数为0.985;5种阳离子总量与r_e、r、r₁均呈显著负相关。盐胁迫影响了草麻黄体内离子的运输和平衡,细胞内外离子浓度的变化引发电阻抗参数的变化,分析相对电导率电阻抗图谱参数的变化发现NaCl胁迫下,草麻黄的忍耐极限浓度为200 mmol·L^-1,表明草麻黄具有较高的耐盐能力。本研究结果为盐碱地区草麻黄的推广栽培提供了理论依据。     

铜胺氧化酶基因PpCuAO4在桃成熟中的功能鉴定

为明确铜胺氧化酶(CuAO)在桃果实成熟过程中的作用,分别采用1.0、5.0和10.0 mmol·L^-1的CuAO抑制剂氨基胍(AG)对黄水蜜桃果实进行喷施处理,并于桃果实成熟后测定果实硬度。结果表明,5 mmol·L^-1 AG处理组桃果实的硬度保持效果最好。进一步采用5.0 mmol·L^-1 AG处理黄水蜜桃果实,并测定果实成熟相关生理指标。结果表明,AG处理下桃果实在采后7 d内果实硬度均显著高于对照水平,乙烯释放量和呼吸强度均显著低于对照水平,表明抑制CuAO介导的多胺分解可显著延缓桃果实成熟。AG处理显著抑制乙烯合成、生长素转运和细胞壁降解相关基因PpACO1、PpACS、PpPIN1、PpGH3.3、PpPG和PpPME1的表达水平。为进一步明确CuAO在桃成熟中的功能,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术沉默腐胺(Put)分解关键基因PpCuAO4。结果显示,转基因桃果实PpCuAO4表达水平仅为对照的18%,Put含量和果实硬度显著高于对照水平,而乙烯释放量和呼吸强度均显著低于对照水平。上述结果表明,PpCuAO4介导的Put分解可以促进桃果实成熟。本研究为进一步深入解析多胺(polyamine)调控桃果实成熟的机制提供了重要的理论依据。     

荆芥幼苗对盐胁迫的生理响应

为探究盐胁迫对荆芥幼苗生理特性的影响,采用盆栽砂培试验,研究不同浓度盐胁迫(0、25、50、75和100 mmol·L^-1 NaCl)下荆芥幼苗生长、质膜稳定性、渗透调节、抗氧化酶系统、离子吸收和分配的变化。结果表明,随着盐浓度的增加,荆芥盐害指数逐渐升高,幼苗株高增加速率和比叶面积均逐渐降低,单株干重和叶绿素含量均呈先增加后减少的趋势,且均在25 mmol·L^-1 NaCl处理下达到最大;叶片中丙二醛(MDA)含量和电解质渗漏率均显著增加;可溶性蛋白和脯氨酸含量均呈先增加后减少趋势,且分别在50和75 mmol·L^-1 NaCl处理下达到最大,而可溶性糖含量则不断上升;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性均呈先上升后下降的趋势,在25 mmol·L^-1 NaCl处理下达到最大,而过氧化物酶(POD)活性则持续下降。盐胁迫下,荆芥的根、茎、叶大量积累Na^+,但主要集中在地上部分,同时各部位K^+、Ca²⁺含量及K^+/Na^+、Ca²⁺/Na^+值均显著下降。综上,荆芥幼苗对盐胁迫极为敏感,但对低浓度的盐胁迫(25 mmol·L^-1 NaCl)具有一定的耐受性。本研究结果为荆芥的规范化栽培和抗逆驯化研究奠定了理论基础。