羊踯躅psy基因的克隆及表达分析

[目的]为了研究羊踯躅psy基因的功能及其在花瓣着色中的分子机理,[方法]以羊踯躅花瓣的cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE方法克隆得到1 638 bp的psy基因全长cDNA序列,命名为RmPSY (GenKank登录号为KX230461)。[结果]序列分析表明,RmPSY开放阅读框为1 296bp,编码432个氨基酸。羊踯躅PSY为亲水性的不稳定蛋白,无信号肽,属于非分泌蛋白;预测的蛋白质分子量48.91 kD,等电点为8.78。RmPSY与GenBank中收录的其它植物PSY蛋白氨基酸的相似性达到81%。构建系统进化树,结果显示羊踯躅PSY与葡萄PSY蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在羊踯躅花发育的不同阶段均有表达,在花蕾期表达量较低,在初开期表达量最高,盛开期表达量有所下降。[结论]试验结果为进一步揭示RmPSY基因参与调控羊踯躅花色形成的分子机制奠定基础。     

中国水仙八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的克隆及表达分析

八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是影响类胡萝卜素合成的一个重要限速酶,在植物花色发育过程中起着重要作用。采用RT-PCR技术从中国水仙（Narcissustazetta var.chinensis）幼嫩花蕾中分离到一个新的水仙花色发育相关的PDS基因,命名为NTPDS1（GenBank登记号：EU138883）。该基因长1719bp,具有一个1713bp的完整开放读码框（ORF）,编码570个氨基酸。序列分析表明,NTPDS1编码的氨基酸序列与其它植物的PDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,NTPDS1与喇叭水仙亲缘关系最近。利用半定量PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在中国水仙的花、叶片和根中均有表达,但以花器官中表达量最高;在花瓣和副冠中的表达量高于雄蕊和雌蕊。     

火鹤八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与其表达分析

旨在为火鹤叶色和花色呈色机理研究提供一定理论依据。以火鹤‘阿拉巴马’为材料,提取火鹤肉穗花序中的总RNA,采用RACE技术克隆得到了八氢番茄红素脱氢酶基因(Aa PDS),通过RT-PCR分析其表达变化。八氢番茄红素脱氢酶基因(Aa PDS)c DNA全长为2226 bp,其中开放阅读框(ORF)共1767个碱基,编码588个氨基酸。序列比对后发现火鹤Aa PDS序列与鹤望兰、水仙、烟草、葡萄、黑藻、向日葵等PDS氨基酸序列存在高度同源性,有74%~79%的一致性。系统进化分析表明火鹤Aa PDS与黑藻、水稻、水仙、鹤望兰等单子叶植物的PDS基因聚类在一起应用。RT-PCR分析表明,Aa PDS在肉穗花序中表达量最高,在佛焰苞中表达次之,在叶、茎、根表达量依次降低。以上结果可见,通过分子生物学进行系统分类与传统植物表观分类学结果一致。类胡萝素代谢途径中的PDS基因在火鹤花器官成色中起一定作用。     

棉花八氢番茄红素脱氢酶GhPDS1基因的克隆与表达谱分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)在胡萝卜素生理代谢和病毒诱导外源基因沉默中起着非常重要的作用.本研究通过同源克隆方法,分析已报道植物八氢番茄红素脱氢酶氨基酸保守区,设计筒并引物,扩增出编码棉花PDS基因cDNA中间片段.通过RACE技术成功地克隆了棉花PDS基因的全长cDNA,命名为GhPDS1(GenBank No.HQ...     

芝麻八氢番茄红素脱氢酶基因SiPDS的克隆与序列分析

来自芝麻的八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene,PDS)的分离鉴定尚未见报道。本研究根据已报道植物PDS基因的氨基酸保守区,设计简并引物,扩增出编码芝麻新蔡选抗PDS基因c DNA的中间片段。利用电子克隆技术,从芝麻EST数据库中比对得到一条高度同源的序列,并通过RT-PCR方法,从新蔡选抗成功克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因的c DNA,命名为Si PDS(Gen Bank登录号:KJ191121)。c DNA序列全长2 273 bp,开放阅读框长度为1 743 bp,编码580个氨基酸。根据克隆获得的全长c DNA序列设计引物,从新蔡选抗DNA中克隆获得Si PDS基因的全长DNA,长度为5 592 bp,转录区包括14个外显子和13个内含子。序列分析表明,Si PDS与其他植物的PDS蛋白序列高度相似;系统进化树分析表明,芝麻Si PDS与黄芩的亲缘关系最近。Si PDS基因可以用作植物病毒诱导的基因沉默载体的内源检测基因,在利用基因工程技术改良芝麻农艺性状方面具有较大的应用价值。     

芒果八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的克隆与表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)影响类胡萝卜素的合成,是合成途径中关键基因。为了研究芒果果实中PDS基因的功能,本试验采用RACE方法从‘贵妃’芒果果实中克隆得到了一个八氢番茄红素脱氢酶(PDS),该基因全长c DNA序列为1 820 bp,开放阅读框为1 650 bp,编码549个氨基酸,分子重量为61.34 kD,等电点为6.78。聚类分析发现芒果PDS蛋白与柚子、香瓜和番木瓜等植物的亲缘关系较近。其氨基酸组成主要是丙氨酸(ALa),白氨酸(Leu),缬氨酸(Val)等。利用定量PCR技术对不同品种中的PDS基因表达量分析,发现红色‘贵妃’品种表达量最高,而绿色‘桂七’品种表达量最低,对其蛋白的结构域、三级结构及互作蛋白进行了预测,发现其含有Phytoene-desat、PLNO2487 superfamily等结构域。利用STRING数据库对其互作蛋白进行分析发现其与PSY、ZDS、CRTISO等蛋白可能有相互作用。本研究为进一步研究芒果果实类胡萝卜素生物合成的分子调控机理提供理论依据。     

苹果MdPDS基因的克隆及表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是苹果类胡萝卜素生物合成途径的关键酶。本研究运用电子克隆与RACE技术克隆得到‘澳洲青苹’苹果Md PDS基因(Gen Bank登录号:KU508828),该c DNA序列全长2 005 bp,包含1 725个碱基(121~1 845 bp)的完整开放阅读框,编码575个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,Md PDS编码的氨基酸序列与其他植物的PDS蛋白具有很高的同源性;其同样含有一个二核苷酸结合域和一个类胡萝卜素结合域。系统进化树分析表明,Md PDS与杏、碧桃和草莓蛋白亲缘关系较近,聚为一类。实时荧光定量PCR结果表明,Md PDS在‘澳洲青苹’苹果不同组织均有表达,其在树皮、果皮及叶片中的表达要明显高于花中的表达。此外,Md PDS在着色期套袋果实果皮中的表达量随果色增加而上升,而在非套袋果皮中的表达则变化不明显。上述结果表明Md PDS在苹果果实色泽发育过程中起着重要作用,也为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

海南粗榧PDS基因克隆与茉莉酸甲酯诱导表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因是类胡萝卜素生物合成途径中关键基因,它参与叶绿体光保护、脱落酸合成等多种生物代谢,同时也是VIGS技术中常用的指示基因。本研究利用同源克隆技术克隆并分析了海南粗榧八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因,结果表明:海南粗榧PDS基因,c DNA全长1 758 bp,命名为Cm PDS(Gen Bank登录号:KX766035),其编码585个氨基酸的开放阅读框。预测该基因编码蛋白质分子量为64.99 k D,其等电位为7.11,是理化性质稳定的亲水蛋白。经过氨基酸序列比对,发现海南粗榧中的PDS和红掌、中国水仙的PDS同源性最高,为85%;与其他作物的PDS同源性也都在70%以上,并且包含一个明显的保守结构域。此外,通过施加茉莉酸甲酯来模拟逆境信号,发现Cm PDS基因表达量呈现了先快速下降,然后逐步恢复到正常表达水平的趋势。暗示茉莉酸信号启动的抗性机制会抑制植物的光保护机制。同时本研究也为利用VIGS技术鉴定和挖掘海南粗榧抗癌生物碱合成酶相关基因奠定基础。     

黄瓜ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

以西双版纳黄瓜为试材,从黄瓜果肉中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的cDNA序列,命名为CsZds。获得目的片段长度为1805bp,该序列具有完整的开放阅读框,位于31~1761bp,编码576个氨基酸。序列比对分析结果显示,该蛋白在氨基端变化十分明显,中部较为保守,存在一个特征序列。系统进化分析表明,推测的CsZDS蛋白与南瓜中ZDS蛋白同源性最高,达到91.84%。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,随着果实成熟期的延长,西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量呈明显上升的趋势,在转色期达到最大。在果实发育过程中,西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量高于普通黄瓜。     

金花茶CnLCYE基因cDNA克隆及表达载体构建

利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了一个番茄红素ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,LCYE)基因c DNA全长,命名为CnLCYE。碱基序列分析显示,CnLCYE基因全长2 149 bp,包含291 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、265 bp的3'UTR和1 593 bp编码530个氨基酸的开放阅读框。该基因编码的蛋白质含有2个跨膜结构域,一个NADB_Rossmann superfamily结构域以及番茄红素ε-环化酶结构域(PLN02697)。CnLCYE蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次为α-螺旋,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnLCYE与茄科、蔷薇科等植物LCYE蛋白同源性都在70%以上,与普洱茶(Camellia sinensis var.assamica)LCYE同源性最高。根据该CnLCYE全长序列设计带有KpnⅠ和Bam HⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用KpnⅠ和Bam HⅠ双酶切后与表达载体p CAMBIA1300连接,成功构建了CnLCYE基因的正义表达载体,为深入研究CnLCYE基因的功能及其对花色的调控作用提供了帮助。     

甜菜M14品系BvM14-Tpx基因克隆及原核表达体系下应答氧化胁迫功能的初步研究

为了研究甜菜M14品系BvM14-Tpx基因的抗氧化功能,本试验以带有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系M14品系为试验材料,利用RACE技术获得甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因(BvM14-Tpx) cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用Real-time PCR和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,在原核表达体系下进行BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫研究。生物信息学分析结果表明,BvM14-Tpx基因cDNA全长为1044 bp,包含最大的ORF为489 bp,编码162个氨基酸;含有过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)型的保守结构域;BvM14-Tpx蛋白与豌豆(Pisum sativum L.)和苜蓿(Medicago truncatula L.)中Tpx蛋白的亲缘性较高。组织特异性表达分析结果表明,BvM14-Tpx基因在甜菜M14品系各组织表达量从高到低的顺序是根、茎、叶、花。通过原核表达体系下BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫的研究,表明BvM14-Tpx基因能够提高大肠杆菌对于环境中氧化胁迫的适应能力,减轻H₂O₂对细菌生长的抑制。本研究对挖掘甜菜M14品系优质基因,提高甜菜对于非生物胁迫的抗性以及开展甜菜遗传改良工作具有重要意义。     

光裸星虫Sn-hsc70基因克隆及表达分析

旨在研究光裸星虫热休克蛋白70 (Hsc70)在卵子发生过程中发挥的作用,为深入认识光裸星虫卵母细胞发育的分子机制积累基础资料。以光裸星虫为材料,用RACE技术获得光裸星虫Sn-hsc70基因的cDNA全长。进行生物信息学分析得出,Sn-hsc70全长2508 bp,编码656个氨基酸;Sn-Hsc70蛋白为71.65 kDa亲水蛋白。同时还分析了该蛋白的保守序列、核定位序列、胞质定位序列、连续重复的四肽序列、三级结构、系统进化树及结构域。RT-PCR结果显示,Sn-hsc70在光裸星虫卵母细胞发育的各个时期的表达量差异显著(P < 0.05),整体呈单峰型;在体腔液发育时期(O1-O4),Sn-hsc70表达量迅速上升,尤其是卵黄旺盛合成期和成熟期(O3-O4)显著高表达;脱离体腔液后(O5-O6),Sn-hsc70表达量显著下调。研究结果表明Sn-hsc70可能在卵黄积累中发挥重要作用,与卵母细胞转录与蛋白质合成减弱等有关。     

小麦类受体蛋白激酶基因TaPK3A的克隆与抗纹枯病功能初步分析

小麦纹枯病已成为我国小麦生产的重要限制因素。研究小麦防御反应分子基础,发掘有效的抗病基因是小麦抗纹枯病育种突破的前提。本研究从抗纹枯病小麦品系CI12633中克隆出一个类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinase,RLK)基因TaPK3A,并对其表达特性及抗纹枯病功能进行了分析和验证。TaPK3A基因的开放阅读框长度为1983bp,编码660个氨基酸组成的类受体蛋白激酶。TaPK3A在抗纹枯病小麦品系CI12633中的表达受禾谷丝核菌的诱导而显著上调; TaPK3A在根、茎、叶、穗中都有表达,以叶中的表达量最高; TaPK3A的表达受植物激素水杨酸诱导最为显著。利用大麦条形花叶病毒(barley stripe mosaic virus, BSMV)诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术,降低抗纹枯病小麦CI12633中TaPK3A的转录水平,再接种禾谷丝核菌WK207进行纹枯病抗性鉴定。结果显示,与对照植株相比, TaPK3A转录量下降的CI12633植株对纹枯病的抗性显著降低,说明TaPK3A是小麦防御纹枯病反应所需的。     

滇水金凤黄烷酮3-羟化酶基因(IuF3H)的克隆及表达分析

为探究黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)基因对滇水金凤(Impatiens uliginosa)花色的调控机制。本研究以红色滇水金凤花器官为试验材料,通过RT-PCR及RACE技术分离克隆F3H基因,发现其c DNA序列全长1 104 bp,编码367 aa,故命名为Iu F3H;同时通过氨基酸比对发现其蛋白与其他植物F3H蛋白同源性较高,约为78.91%,说明F3H基因具有较高的保守性;通过进一步克隆其g DNA序列,发现其全长为1 221 bp,其中包含3个外显子和2个内含子。q RT-PCR结果显示,Iu F3H基因在4种不同花色滇水金凤及其不同发育阶段均有不同程度的表达,其中以深红色的始花期表达量最高,粉红色的盛花期表达量最低。本研究结果表明,Iu F3H基因参与了相关色素生物合成,同时可能在滇水金凤花色素合成中具有关键作用,本研究为探讨Iu F3H基因在4种不同颜色滇水金凤中的分子机制提供数据参考。     

甜菜M14品系BvM14-Dof3.4基因的克隆及响应盐胁迫表达分析

为进一步研究BvM14-Dof3.4基因响应盐胁迫的功能,以甜菜M14品系根为材料,通过PCR技术获得BvM14-Dof3.4基因cDNA全长序列并进行生物信息学以及盐胁迫应答分析。结果表明：该基因最大ORF为408 bp,编码135个氨基酸,蛋白分子量为12646.63 Da,理论等电点为4.68,为亲水性蛋白;BvM14-Dof3.4蛋白质二级结构和三级结构主要由延伸链和无规卷曲组成;BvM14-Dof3.4蛋白氨基酸序列与NCBI数据库中甜菜(Beta vulgaris)的氨基酸序列相似度为99.26%;系统进化分析表明BvM14-Dof3.4蛋白与菠菜(Spinacia oleracea)Dof3.4蛋白亲缘性较高。结合实验室前期盐胁迫下甜菜M14品系根的转录组数据分析,BvM14-Dof3.4基因参与甜菜M14品系应答盐胁迫过程,在200 mmol/L NaCl处理下上调2.05倍,在400 mmol/L NaCl处理下上调1.41倍。实验成功获得BvM14-Dof3.4基因cDNA全长,并确定该基因响应盐胁迫,该结果对挖掘甜菜M14品系优质基因和提高栽培甜菜抗逆性等方面具有重要意义,为后续进一步开展BvM14-Dof3.4基因响应盐胁迫功能研究提供参考。     

甘蔗脂氧合酶基因ScLOX1的克隆与表达分析

LOX属于脂氧合酶超家族(lipoxygenasesuperfamily),是脂肪氧化途径的重要因子,广泛参与植物生长发育的调节和对外界刺激的抵御。本研究基于甘蔗(Saccharumspp.)转录组数据库,通过RT-PCR技术,首次从新台糖22号(ROC22)蔗芽中克隆获得ScLOX1基因(GenBank登录号为MK106188)的cDNA全长序列。生物信息学分析显示,ScLOX1基因cDNA序列长度为2813 bp,开放读码框全长2664 bp,编码887个氨基酸,其编码蛋白的理论等电点为6.23,不稳定系数为39.77,亲水性平均值为?0.437,无信号肽和跨膜结构,但含有PLAT_LH2和Lipoxygenase活性位点,与高粱(Sorghum bicolor) LOX (XP_002466613.1)的氨基酸序列相似性高达95.96%。预测ScLOX1基因的编码蛋白为酸性稳定亲水性非分泌蛋白,属于type I类非传统9-LOX。qPT-PCR分析结果显示,ScLOX1基因在蔗芽组织中特异性表达。接种甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)后, ScLOX1基因的表达量在抗病品种崖城05-179中短暂上升,但在感病品种ROC22中显著下降。分别对瞬时表达ScLOX1基因的本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株叶片接种烟草茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium solani var. coeruleum)和青枯菌(Ralstonia solanacearum),表型观察、3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)染色和烟草免疫相关基因的表达情况分析显示,ScLOX1基因的过表达能够增强本氏烟对烟草茄病镰刀菌蓝色变种的防御,但对烟草青枯菌的作用与对照相比无明显差异。研究还发现,ScLOX1基因的表达受茉莉酸甲酯和水杨酸抑制下调,但受脱落酸、氯化钠和聚乙二醇诱导上调。以上结果为深入研究甘蔗ScLOX1基因的功能提供参考资料。     

四季桂香叶醇合成酶基因GES的克隆及表达模式分析

本研究拟通过四季桂GES基因的克隆及其表达模式的研究,为探讨和解析GES基因调控香叶醇合成的分子机制及分子育种提供科学数据。本研究以四季桂花瓣和叶为材料,采用RACE-PCR和RT-PCR技术克隆并分析香叶醇合成酶GES基因表达模式。试验结果表明,四季桂GES基因cDNA全长为1 863 bp,编码含有583个氨基酸的蛋白质,并含有典型的保守结构域或结合位点。GES基因在四季桂花朵和叶片中均表达,且在4月份与7月份具有较高的表达水平。在四季桂开花期间,GES主要在香眼期和盛开末期两个时期表达,随着时间的延长而逐渐降低。     

粉花石榴二氢黄酮醇还原酶基因cDNA片段的分离及鉴定

为了研究二氢黄酮醇还原酶（DFR）在石榴花色形成中的作用,根据GenBank中登录的相关物种DFR基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法,从‘重瓣粉花’石榴花瓣总RNA中扩增出cDNA片段。测序结果表明,该cDNA片段长446 bp,编码148个氨基酸,序列分析表明,该片段与蓝灰石竹、水蓼、苦荞麦、荞麦、甜樱桃、金荞麦、菠菜、马六甲葡萄、山葡萄、马蹄纹天竺葵、仙客来等物种的氨基酸同源性在78%~81%以上,存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序“TVNVQPVQRPVHDETSWSDLDFVWAT”,说明已成功克隆到‘重瓣粉花’石榴DFR基因的cDNA片段,在GenBank中登录号为JN381544。