茶树CsDREB-A2转录因子基因的克隆与非生物胁迫响应分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)类转录因子在植物逆境信号转导途径中具有重要的调控作用。为了解AP2/ERF转录因子在茶树逆境胁迫的分子调控机理,本研究从茶树龙井43叶片的cDNA中克隆得到一个编码CsDREB-A2转录因子的基因;对CsDREB-A2基因及其编码蛋白序列特征进行分析,并利用实时荧光定量PCR法检测该基因在茶树不同非生物胁迫处理下的表达水平。结果表明,CsDREB-A2基因开放阅读框为1 056 bp,编码351个氨基酸,其编码氨基酸序列具有AP2保守结构域,包含典型的YRG元件和WLG基序。AP2结构域第14、第19位氨基酸分别为缬氨酸和谷氨酸。拟南芥AP2/ERF家族转录因子的进化分析表明,该转录因子属于DREB亚族的A2组。CsDREB-A2相对分子质量为39 080 Da,理论等电点为5.32,属于亲水性蛋白,主要由α-螺旋和随机卷曲组成,无序化特征明显且存在一个LM无序区域;可能定位于细胞核,不存在信号肽和跨膜结构,属于非分泌蛋白。CsDREB-A2基因在高温(38℃)和干旱(200 g·L^-1 PEG)胁迫下均能快速诱导表达,并显著高于对照,分别在处理4、2 h达到最大值,为对照的20.70和42.90倍,植物在渗透胁迫下,可能通过ABA信号途径调节该基因对干旱的耐受性。高盐(200 mmol·L^-1 NaCl)胁迫下CsDREB-A2基因的表达受抑制,推测其可能存在负调控结构域降低该基因在盐胁迫下的表达量。本试验结果为研究DREB类转录因子在茶树抗逆胁迫的分子调控机制提供了一定的理论参考。     

巴哈雀稗PnDREB2基因克隆及时序表达图谱构建

脱水反应元件结合蛋白(DREBs)在植物非生物逆境胁迫中可调节下游一系列抗逆基因的表达。为探究巴哈雀稗DREB2基因在逆境胁迫下的功能,本研究采用RNA-Seq结合RT-PCR技术从巴哈雀稗中获得一个DREB2基因CDS区全序列,命名为PnDREB2(GenBank登录号:MH150946)。核苷酸序列分析表明,该基因开放阅读框全长774 bp,编码257个氨基酸,相对分子质量为28.09 kD,理论等电点为5.25;该植物蛋白中具有DREB类基因家族典型的保守域AP2结构域,属于DREB2类转录因子A类中A2亚类的亚型1。进化和聚类分析结果表明,巴哈雀稗PnDREB2基因与高粱、割手密、玉米、谷子及牛鞭草亲缘关系较近,氨基酸序列同源性分别为91.10%、89.50%、88.20%、87.60%和87.60%。RT-qPCR和生物信息学分析表明,PnDREB2基因在茎中表达量最高,幼穗次之,叶最低;表达产物定位于细胞质中,具有26个磷酸化位点,并具有结构和功能的特异性。PnDREB2表达量受干旱(PEG-6000,20%)和高温(40℃)的强烈诱导,同时也受到高盐(NaCl,300 mmol·L^-1)、低温(4℃)、脱落酸(ABA,100 μmol·L^-1)和赤霉素(GA,100 μmol·L^-1)等非生物胁迫和激素的不同程度诱导,随着处理时间的延长,整体上均呈先增加后降低的趋势。本试验为巴哈雀稗抗逆分子机理研究与抗性增强的转基因材料培育奠定了理论基础。     

基于转录组金银花AP2基因家族的生物信息学及表达分析

为研究金银花AP2转录因子参与低温的应答机制,本研究基于低温下金银花转录组测序数据,利用在线生物信息学工具对金银花AP2转录因子的理化性质、亚细胞定位、磷酸化位点、蛋白基序以及进化分析进行鉴定和分析;利用实时荧光定量PCR检测3个DREB基因和1个RAV基因在低温胁迫下的表达情况。结果表明,在金银花中共筛选了34个AP2转录因子,不同转录因子之间的理化性质存在差异,表明其在不同的微环境中发挥不同的功能;亚细胞定位结果显示,仅有2个AP2定位于叶绿体,其余均定位于细胞核,符合其作为转录因子调控下游基因的表达特性;所有AP2的磷酸化位点均依次表现为丝氨酸>苏氨酸>酪氨酸;根据AP2中所含有的AP2数量以及序列同源性,可将34个AP2分为四个大类,20个AP2属于ERF亚家族,3个属于DREB亚家族,RAV亚家族仅有1个,其余10个属于AP2亚家族。实时荧光定量PCR检测结果表明,DREB和RAV基因均能响应低温胁迫,且不同低温处理时间的不同组织的表达量存在差异。本研究为阐明金银花AP2转录因子响应低温胁迫的机制奠定了一定的理论基础。     

小麦盐胁迫响应相关ERF基因的分离和初步验证

隶属于AP2/ERF超家族的乙烯响应因子(ERF)是植物抵御盐胁迫过程中的一类重要基因,为了减轻盐渍土地对小麦产量的负面影响,本研究从小麦全基因组中分离了AP2/ERF超家族,根据聚类结果和结构特征从中鉴定出96个ERF家族成员,在A、B、D基因组中共有229个拷贝序列;通过聚类分析和转录组数据分析筛选出13个与已克隆耐盐ERF基因相似性高或受NaCl诱导的TaERF成员,随后利用小麦抗感材料验证13个TaERF成员在受250 mmol·L^-1 NaCl处理后的表达水平变化情况,结果显示,TaERF27、TaERF35、TaERF55和TaERF64在耐盐材料CH7034中受NaCl胁迫后显著上调,而在盐敏感品种SY95-71中无明显变化,推测其可能为盐胁迫响应基因;组织特异表达和启动子调控元件分析结果显示这4个基因在CH7034苗期根和叶中均具有较高的表达水平,并且每个基因起始密码子前 2 000 bp区域内包含脱落酸、水杨酸和茉莉酸等多种植物激素响应元件,推测它们可能参与植物多种非生物胁迫信号转导通路。本研究结果有助于理解植株应对非生物胁迫的分子机制,并为小麦品种耐盐性改良提供了参考基因。     

高粱转录因子SbWRKY71基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究通过基因克隆的方法,从高粱BTx623中克隆得到一个WRKY转录因子基因(SbWRKY71),该转录因子基因全长1 335 bp(phytozome登录号:Sb04g005520),编码364个氨基酸,分子量为38.95 kDa;预测该转录因子定位于细胞核,具有WRKY转录因子典型的保守结构域,且该蛋白属于WRKY蛋白家族的第Ⅱ组成员。系统进化树分析表明,高粱SbWRKY71氨基酸序列与禾本科作物玉米ZmWRKY71的亲缘关系最近,为75%;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测表明,SbWRKY71基因表达具有组织特异性,在叶中表达丰度最高,茎中最低。经激素水杨酸(SA,1 mmol·L^-1)、吲哚-3-乙酸(IAA,10 μmol·L^-1)和脱落酸(ABA,200 μmol·L^-1)处理后,SbWRKY71的表达量呈现先下降后升高再下降的趋势;在γ-氨基丁酸(GABA)和甘露醇(D-Mannitol,300 mmol·L^-1)模拟干旱胁迫以及氯化钠(NaCl,250 mmol·L^-1)盐胁迫处理下,SbWRKY71的表达量均先升后降,分别在3、6和9 h达到最大值;高粱经病原相关分子模式(PAMPs)flg22(100 nmol·L^-1)、翻译延长因子(elf18,100 nmol·L^-1)处理后,SbWRKY71表达均受到抑制,但在几丁质(Chitin,8 nmol·L^-1)处理下,SbWRKY71受到诱导表达。本研究为进一步探索SbWRKY71基因在调节高粱抗性、响应激素以及逆境胁迫应答等过程中的作用机制提供了基础。     

花生脂磷酸磷酸酶基因家族的克隆与表达分析

为探究脂磷酸磷酸酶(LPP)基因家族在花生中的功能,本研究从花生中克隆得到8个LPP基因,分别命名为AhLPP1、AhLPP2、AhLPP4、AhLPPβ1、AhLPPβ2、AhLPPγ、AhLPPδ、AhLPPε,分别编码335、322、284、228、198、227、403和293个氨基酸,均属于LPPs蛋白质家族。随后对克隆的基因进行序列相似性比对和系统发育分析;同时通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测AhLPP基因在花生不同组织、不同发育时期、5种激素和4类非生物逆境胁迫下的表达情况。结果显示,这些基因与其他植物的LPPs蛋白有较高的相似性,可能参与花生种子油脂的合成。在5种激素与4类非生物胁迫处理下AhLPP2、AhLPPγ、AhLPPε基因均显著诱导表达,其余LPP基因在部分处理下显著诱导表达。本研究为阐明LPP类基因在花生油脂合成和逆境胁迫抗性的功能奠定了理论基础,丰富了花生品种改良的基因资源。     

辣椒BES1基因家族鉴定及表达分析

BES1基因是油菜素内酯信号途径中的关键转录因子。为了解辣椒中BES1基因家族功能,以已测序辣椒CM334为试验材料,根据已公布辣椒基因组数据,本研究利用生物信息学方法对辣椒BES1基因家族进行鉴定,并对基因结构、结构域、系统进化关系、基因表达模式和生物非生物胁迫表达情况进行分析。结果表明,辣椒中有9个候选BES1基因,根据BES1基因结构可将其分为ClassⅠ和ClassⅡ 2大类,Class Ⅰ 和 Class Ⅱ 在结构上差异较大。辣椒BES1编码蛋白介于181~713个氨基酸范围内,分子量为20.22~78.23 kDa,等电点介于5.48~9.23。转录组数据分析发现,辣椒BES1基因在辣椒中表达具有差异性。在脱落酸、低温、高温、茉莉酸甲酯和疫病胁迫下CA04g20150和CA12g17430均被诱导上调,表明其在生物和非生物胁迫中发挥作用。本研究结果为进一步探究BES1基因家族调控植物抗逆的分子机制奠定了基础。     

芹菜水孔蛋白基因AgPIP2;1的克隆及其对非生物胁迫的响应

为了研究芹菜质膜内在蛋白基因的序列特征及其在非生物胁迫条件下的表达特性,探讨其抗逆功能,以芹菜品种六合黄心芹为试验材料,通过RT-PCR技术克隆AgPIP2;1基因,通过生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列特征,并采用荧光定量PCR技术检测其在不同组织的表达及其对非生物胁迫的响应。结果表明,AgPIP2;1基因含有1个861 bp的开放阅读框,编码286个氨基酸,其编码的蛋白属于PIP2类蛋白。氨基酸序列分析显示,AgPIP2;1含有高度保守的NPA基序以及高等植物PIP蛋白的保守序列,与其他物种PIP2类蛋白具有较高的同源性,与胡萝卜DcPIP2;1的氨基酸序列同源性达到97.90%。在亲缘关系上与大豆GmPIP2;1、胡萝卜DcPIP2;1和绿豆VrPIP2;1较为接近。实时荧光定量PCR技术分析表明,AgPIP2;1基因在芹菜根、叶柄和叶片中均有表达,其中在叶片中的表达量最高,在根中的表达量最低,呈现比较明显的组织特异性。此外,AgPIP2;1基因受到高温、低温、干旱和盐等非生物胁迫的诱导,说明该基因可能参与芹菜抵御非生物胁迫的过程。本研究为进一步了解AgPIP2;1基因的功能及其在非生物胁迫中的作用奠定了基础。     

花椰菜AP2/ERF转录因子家族成员BobERF17响应逆境胁迫的表达及功能研究

AP2/ERF为植物特有的一类转录因子超家族,其中ERF家族成员被证实在植物逆境胁迫响应中发挥重要作用。为研究花椰菜中不同ERF转录因子的功能,本研究对花椰菜ERF家族中的一个成员BobERF17进行了克隆、表达及功能探究。序列分析显示,BobERF17编码区全长576 bp,编码一个由191个氨基酸组成的蛋白。聚类分析表明,BobERF17与双子叶植物,特别是芸薹属植物中的ERF17序列具有较高相似性,但与单子叶植物中该转录因子序列差异很大。不同逆境胁迫处理条件下的表达谱分析证实,BobERF17在干旱及高温胁迫条件下均呈现显著上调表达,但对盐及低温胁迫响应不敏感。将构建的BobERF17过表达载体转化入拟南芥,获得过表达BobERF17拟南芥纯合株系。功能分析显示,在拟南芥中过表达BobERF17对转化株的生长发育无明显影响,但可以显著提高转化株对干旱及高温胁迫的耐受。本研究结果证实,BobERF17在花椰菜干旱及高温胁迫中可能发挥重要的正向调控作用,为进一步探究BobERF17的功能及调控机制奠定了基础。     

杜梨精氨酸脱羧酶基因PbADC的克隆与表达分析

精氨酸脱羧酶(ADC)是植物多胺生物合成途径中的关键酶。为探索ADC基因在杜梨中的序列特征及其对非生物胁迫的应答特性,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从杜梨中克隆PbADC基因,利用生物信息学软件进行序列分析,并通过荧光定量PCR技术检测其在不同组织中的表达水平和对多种非生物胁迫的响应。结果表明,PbADC基因的开放阅读框全长2 190 bp,编码730个氨基酸,预测PbADC蛋白含有66个磷酸化位点。结构域分析显示,PbADC含有保守的2-磷酸吡哆醛结合位点、磷酸吡哆醛(PLP)磷酸基结合位点和底物识别信号序列,是Ⅲ型磷酸吡哆醛依赖性精氨酸脱羧酶家族成员。在亲缘关系上与苹果MdADC、甜樱桃PaADC和桃PpADC较为接近。荧光定量PCR检测结果表明,PbADC在叶片中的表达量高于根和茎部组织,且该基因的转录水平受低温、脱水、盐和过氧化氢等非生物胁迫调控。本研究结果为进一步探讨PbADC基因的抗逆功能提供了理论依据。     

14个苹果AP2/ERF转录因子基因的克隆与表达分析

为探究AP2/ERF转录因子在苹果(Malus pumila Mill.)生长发育以及生物或非生物胁迫应答下的功能,本研究利用同源比对和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,克隆苹果MdAP2/ERF全长cDNA序列并进行生物信息学分析。采用Array技术检测MdAP2/ERF在苹果16种不同组织中的表达情况,RNA-seq技术检测MdAP2/ERF在苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype, AAAP)侵染下的表达特性,RT-qPCR技术检测MdAP2/ERF在NaCl和甘露醇胁迫下的表达模式。结果表明,共获得了MdERF9-10、MdERF12-15、MdERF20-21、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69共计14个MdAP2/ERF基因,其GenBank登录号依次为MG099818-19、MG099821-24、MG099829-30、MG099839、MG099846和MG099855-58,开放阅读框(ORF)分别为966、540、1 260、843、1 056、1 011、1 347、1 047、669、615、1 956、1 455、1 365和1 101 bp。进化分析表明,MdERF12、MdERF37、MdERF20分别属于DREB亚家族A-2、A-4和A-6组;MdERF30、MdERF15、MdERF14/MdERF21和MdERF9/MdERF10/MdERF13分别属于ERF亚家族B-1、B-3、B-5和B-6组;MdAP2D66-69属于AP2亚家族。亚细胞定位预测结果显示,MdERF9-10、MdERF12-15、MdERF20、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69可能位于细胞核;MdERF21可能位于线粒体。Array分析结果显示,14个MdAP2/ERF在16个检测组织中均有不同的相对表达水平。RNA-seq结果显示,MdERF12、MdERF14、MdERF15、MdERF20和MdAP2D66/67/69响应斑点落叶病菌侵染;在150 mmol·L^-1 NaCl处理下,MdERF10、MdERF12、MdERF13、MdERF15、MdERF20、MdERF30和MdERF37转录水平上调,而MdERF14和MdAP2D68转录水平下调;在300 mmol·L^-1甘露醇处理下,MdERF10、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69转录水平上调,MdERF14转录水平下调。综上表明,MdAP2/ERF基因呈组成型表达,并受斑点落叶病菌、NaCl或甘露醇胁迫诱导或下调,可能参与调控苹果生物胁迫和非生物胁迫应答的过程。该研究结果为进一步揭示AP2/ERF转录因子调控苹果生长发育及逆境胁迫的机理奠定了理论基础。     

蓖麻延伸因子基因的克隆与表达分析

为探讨蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)作为参考基因进行相关研究的可行性,以蓖麻雌性花为试验材料,扩增RcEF-1α(GenBank登录号: XM_002518027.3)的编码序列(CDS),并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)构建成重组载体pET32a(+)-RcEF-1α;将pET32a(+)-RcEF-1α转化至大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blot验证。结果表明,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导一个分子量约66 kD的特异蛋白;采用纯化的表达蛋白免疫新西兰白兔制备抗RcEF-1α的多克隆抗血清,用多克隆抗血清进行Western blot验证,发现多克隆抗血清具有针对RcEF-1α的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶51 200;以抗血清为一抗,通过Western blot分析RcEF-1α在时空条件一致且正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达量,结果显示,蓖麻各组织中RcEF-1α蛋白质的含量存在显著差异,其中雌花和雄花中的含量显著高于其他组织。RT-qPCR分析结果表明,蓖麻各组织中RcEF-1α mRNA差异不显著。本研究结果为蓖麻功能基因表达分析参考基因的筛选提供了一定的理论依据。     

冬瓜实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价

为筛选适合冬瓜稳定表达的内参基因,以黑皮冬瓜低温、高温、干旱胁迫处理不同时间的叶片和正常处理不同组织为试验材料,利用RT-qPCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价7个候选内参基因(28SrRNA、UBQ、RP Ⅱ、GAPDH、EF-1α、UBC21和TUA)稳定性。结果表明,7个候选内参基因在不同组织和不同胁迫处理下表达丰度及稳定性存在差异; EF-1α在低温胁迫处理下表达稳定性最好;UBQ和TUA在高温和干旱胁迫处理下表达稳定性最好; EF-1α 在不同组织中表达稳定性最好。本研究结果为冬瓜内参基因的选择提供了一定的理论参考。     

高粱SbJAZ1基因克隆与表达分析

JAZ1基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为克隆高粱SbJAZ1基因及研究其响应胁迫表达特性,本试验以高粱品种BTx623为研究材料,提取其总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板扩增SbJAZ1基因,并对其进行生物信息学、基因表达和原核表达分析。结果显示,SbJAZ1基因全长606 bp,编码201个氨基酸,蛋白质等电点为7.70,分子量大小为21.15 kDa;SbJAZ1与玉米相应同源基因亲缘关系最近,为亲水性蛋白;二级结构中α螺旋占25.37%、延伸链占9.95%、β转角占4.98%,无规则卷曲占59.70%。qRT-PCR分析表明,SbJAZ1在高粱根、茎、芽和叶组织中均有表达,且具有组织表达特异性,在茎中表达量最高;茉莉酸(JA)处理1 h后,SbJAZ1在高粱茎中表达量最高;吲哚乙酸(IAA)和PEG-6000可诱导SbJAZ1的表达。原核表达结果显示,SbJAZ1在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株诱导表达的最佳条件为:温度30℃,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol·L^-1。本研究结果为SbJAZ1基因的生物学功能研究提供了基础。     

大肠杆菌对藏羊子宫内膜上皮细胞相关炎性因子表达的影响

为了探究大肠杆菌(Escherichia coli)对藏羊子宫内膜上皮细胞(EECs)相关炎性因子表达的影响,本研究采用组织块贴壁法和酶消化法培养藏羊EECs;用不同感染复数(MOI)进行E. coli感染试验,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及酶联免疫(ELISA)技术,分析白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎性因子的RNA和蛋白表达水平。结果表明,培养液中加入50 ng·mL^-1表皮生长因子(EGF)能成功培养出藏羊EECs,纯度达到98%以上;E. coli感染试验中,当MOI为1:1时,IL-1β、IL-6和IL-8基因和蛋白的表达量与对照组相比差异不显著,而TNF-α表达量显著升高(P<0.05);当MOI为20:1时,IL-8基因和蛋白的表达量显著升高(P<0.05);当MOI为50:1时,IL-1β、IL-6基因和蛋白的表达量显著升高(P<0.05),而TNF-α表达量与对照组差异不显著(P>0.05)。结果表明,酶消化法可成功培养藏羊EECs;不同MOI E.coli感染后,藏羊EECs中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子的表达量较对照组均显著升高(P<0.05),它们可作为识别子宫内膜炎病理变化程度的指标。本研究结果为预防子宫内膜炎、提高藏羊的生产性能以及生态养殖提供了理论依据。