水牛水通道蛋白9基因克隆及其表达分析

本研究旨在对水牛水通道蛋白9 (aquaporins 9,AQP9) 基因进行克隆,并对其在水牛不同组织中的表达规律及其在水牛卵巢和睾丸组织中的表达差异进行探索。根据GenBank上黄牛AQP9基因序列(登录号:NM_001205833.1)设计特异性引物,以水牛睾丸组织cDNA为模板,应用RT-PCR方法扩增AQP9基因编码区片段;运用生物信息学方法分析其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质;应用实时荧光定量PCR技术分析AQP9基因在水牛组织中的表达情况;免疫组织化学方法分析AQP9蛋白在不同发育阶段水牛卵泡及睾丸组织中的表达差异。结果表明,克隆获得了888 bp的水牛AQP9基因编码区序列,其编码295个氨基酸。多重序列比较显示,水牛AQP9核苷酸序列与牛、猪、绵羊和人相应序列相似性分别为99%、90%、97%、88%;氨基酸序列的同源性分别为99%、86%、97%、83%,系统进化树分析结果推测,AQP9基因在物种进化过程中具有高度保守性。实时荧光定量PCR结果显示,AQP9基因在水牛肝脏、肺脏、大脑、皮肤、睾丸和卵巢组织中有不同程度的表达,在肝脏组织中表达最高,皮肤和睾丸次之,肺脏和卵巢表达较低。免疫组化结果显示,在卵巢组织中,AQP9蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,并随着卵泡发育其表达逐渐增强;在睾丸组织中,AQP9蛋白在各级精母细胞和间质细胞中均有表达。结果提示,成功克隆得到水牛AQP9基因序列;AQP9在水牛卵巢和睾丸中的表达及其功能可能与水牛卵泡发育和精子发生有重要的关联。     

水牛转录抑制因子CTCF基因克隆分析及不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛转录抑制因子CTCF基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还对CTCF基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长2239bp水牛CTCF基因序列,其中编码区全长2184bp,编码727个氨基酸,理论蛋白质分子质量82.7ku,等电点为6.57。多重序列比较分析显示,水牛CTCF核苷酸序列与牛、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、96%、96%、94%和92%,结合系统进化树分析结果推测,CTCF基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛CTCF蛋白的二级和三级结构分析结果发现,其存在连续11个锌指C2H2结构,预测其为重要的DNA结合蛋白。定量表达分析结果显示,CTCF在水牛肝脏组织中相对表达量最高,大脑、肌肉和肾脏次之,卵巢和皮肤表达量较低。     

水牛骨形态发生蛋白1基因的克隆及其在不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛骨形态发生蛋白1(bone morphogenetic protein-1,BMP1)基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还运用实时荧光定量PCR技术对BMP1基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆得到水牛BMP1基因的cDNA序列长度为3 195 bp,其中包含完整的2 967 bp的开放读码框(ORF),编码988个氨基酸。经序列相似性分析显示,水牛BMP1基因与牛、猪、马、人和小鼠相应氨基酸序列相似性分别为99%、96%、96%、96%和95%,具有很强的保守性。结合系统进化树分析结果推测,BMP1基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛BMP1蛋白的结构域预测结果发现,其存在1个信号肽区、1个前肽区、1个金属蛋白酶区、5个CUB区和2个EGF-like功能区。定量表达分析结果显示,BMP1基因在水牛心脏组织中相对表达量最高,睾丸、卵巢和生殖嵴等性腺器官表达量次之,骨头等其他组织表达量较低,肝脏表达量最低。     

水牛Smad4基因的克隆及其真核表达载体的构建

为了阐明Smad4基因在水牛卵巢颗粒细胞增殖及胚胎发育中的分子机制,试验采用RT-PCR扩增并克隆水牛Smad4基因,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,构建Smad4基因的真核表达载体,通过脂质体转染法转染体外培养的牛卵巢颗粒细胞。结果表明,试验克隆得到水牛Smad4基因编码序列,编码区全长为1 662 bp,编码553个氨基酸。通过BLAST对水牛Smad4基因的核苷酸序列进行同源性比对,结果显示,水牛Smad4基因与牛的同源性为99%,与绵羊、猪、马、人的同源性分别为98%、96%、96%和95%。系统进化树分析表明,Smad4基因在不同物种的进化过程中具有高度的保守性。试验成功构建了水牛Smad4基因的真核表达载体pEGFP-N1-Smad4,并在水牛卵巢颗粒细胞中表达出较强的绿色荧光蛋白Smad4-EGFP融合蛋白。本研究成功克隆了水牛Smad4基因,并成功构建了Smad4基因的真核表达载体,为进一步研究Smad4基因在水牛胚胎发育过程中的分子机制奠定基础。     

水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。     

水牛ALK5基因克隆分析与组织表达模式研究

为了阐明水牛ALK5基因在水牛卵泡发生过程中的作用,了解其在水牛不同组织中的表达模式,试验采用了RT-PCR及QRT-PCR方法对ALK5基因进行了研究,参考已公布的Gen Bank中牛ALK5基因序列,设计特异性引物应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析和预测了水牛ALK5基因的遗传进化、蛋白质的理化性质、二级和三级结构,并应用QRT-PCR技术对ALK5基因在水牛组织的表达进行了差异分析。结果表明:水牛ALK5基因的编码区全长为1 512 bp,共编码503个氨基酸;水牛ALK5核苷酸序列与牛、绵羊、猪、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、97%、95%、93%和90%,结合系统进化树分析结果推测ALK5基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性;该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在low complexity和GS结构,呈典型跨膜蛋白结构;水牛ALK5基因在肺脏、垂体、下丘脑组织中不表达,在水牛大脑、肝脏、骨骼、卵巢、肌肉和心脏等12个组织细胞中具有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,心脏和肾脏次之,肌肉表达量最低。说明试验成功地克隆了沼泽型水牛ALK5基因,其具备典型的TGF-β受体家族结构,表达具有一定的组织特异性。     

猪JHDM2A基因的克隆及表达分析

试验旨在克隆猪JHDM2A基因,并研究其在猪卵巢组织中的表达情况。首先克隆猪JHDM2A基因,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体,同时对JHDM2A基因在猪卵泡发育过程中的表达情况进行分析。结果显示,克隆得到的猪JHDM2A基因编码区长度为3 945 bp,编码1 315个氨基酸。通过多重氨基酸序列比对发现,猪JHDM2A基因与黄牛、水牛、绵羊和人相应氨基酸序列的同源性分别为93.5%、94.7%、94.7%和93.8%。蛋白质分子系统进化树分析结果表明,JHDM2A基因在物种进化过程中高度保守。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体导入HEK293T细胞,可观察到清晰的绿色荧光蛋白表达。免疫组化结果显示,JHDM2A蛋白在不同发育阶段猪卵泡中均有表达。本试验通过克隆获得猪JHDM2A基因序列,JHDM2A蛋白在猪卵巢中高度表达,表明其功能可能与猪卵泡发育密切相关。     

水牛MYF5基因克隆分析及真核表达载体构建

本研究旨在对广西沼泽型水牛MYF5基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体。应用RT-PCR方法从水牛肌肉组织中扩增MYF5基因,测序鉴定后对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,并在细胞水平验证所构建载体的正确性。结果表明:水牛MYF5基因编码区序列长度为768 bp,编码255个氨基酸,其核苷酸序列与牛、山羊、猪、人、猩猩和狼相应序列的相似性分别为99%、98%、94%、91%、90%和89%;水牛MYF5基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;MYF5蛋白为膜外蛋白,具有MYOD家族标志性MYOD结构域;构建水牛MYF5基因真核表达载体pMXs-MYF5,转染HEK293T、水牛颗粒细胞后产生绿色荧光信号,表明细胞表达MYF5基因。     

水牛FGF10基因的克隆分析及其在不同组织中表达情况的研究

本实验旨在对水牛成纤维细胞生长因子10(FGF10)基因进行克隆、生物信息学分析,同时探讨其在不同组织中的表达模式。以水牛卵巢的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆得到FGF10基因CDS区全长642 bp,编码213个氨基酸。多重序列分析显示,水牛FGF10基因核苷酸序列与黄牛、羊、猪、人、小鼠同源性分别达到了99%、99%、93%、91%和89%。系统进化树分析表明,水牛和黄牛亲缘性最近,并且在不同物种进化过程中具有高度保守性。QRT-PCR结果表明,FGF10在睾丸中的表达量最高,卵巢和脾脏次之,肝脏和心脏中最低。本研究成功克隆水牛FGF10基因,并检测其在水牛不同组织中的差异表达,为研究FGF10基因在水牛卵泡发育过程中的作用奠定基础。     

水牛脑源性神经营养因子基因克隆、序列分析及其在不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因序列,并运用生物信息学方法对序列的同源性、生物进化树、蛋白的理化性质及二、三级结构等进行了分析预测,同时利用QRT-PCR方法研究了BDNF mRNA在胎儿水牛及成年水牛不同组织中的表达情况。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长800bp水牛BDNF基因序列,其中编码区全长753bp,编码250个氨基酸。多重序列比对分析显示,水牛BDNF核苷酸序列与黄牛、野猪、犬、人、马、小鼠同源性分别为99%、94%、93%、90%、90%和89%;生物进化树分析显示,BDNF基因在不同物种进化过程中具有较高的保守性;BDNF蛋白理论分子质量28 173.36u,等电点9.12;蛋白二级结构由多个α-螺旋、β-折叠、T-转角及无规则卷曲组成,三级结构由多个α-螺旋、3对反向平行的β-折叠结构等构成活性中心(即NGF功能结构域)。QRT-PCR结果显示,BDNF mRNA在胎儿水牛及成年水牛的心脏、肺脏、肾脏、大脑、肌肉、卵巢、睾丸组织中都有表达,且成年水牛的表达量高于胎儿水牛。     

Cloning of Buffalo BMP1 Gene and its Expression Pattern Investigation in Different Tissues

Buffalo BMP1 gene was cloned in the present study, the BMP1 sequence was systemically analysed by bioinformatics techniques, and the expression level of BMP1 gene in different tissues were also assayed with Real-time fluorescence quantitative PCR (QRT-PCR).The results showed that with RT-PCR a 3 195 bp buffalo BMP1 gene was cloned and sequenced, including the whole ORF of 2 967 bp (coding 988 amino acid).The sequence multialigned results showed that buffalo BMP1 gene shared 99%, 96%, 96%, 96% and 95% of similar amino acid sequence with Bos taurus, Sus scrofa, Equus, Homa sapiens and Mus musclus, respectively.It was predicted that buffalo BMP1 protein contained a signal peptide domain, a preregion, a metalloproteinases domain, five complement-Uegf-BMP-1 domain (CUB domain) and two epitheloid growth factor-like domain (EGF-like domain).In addition, we also analyzed the expression level in different tissues through QRT-PCR, the results showed that BMP1 gene mRNA existed in all nine tissues with the most abundant expression in heart, followed by testis, ovary, genital ridge, while with lower amount of bone and other tissues, the minimal expression in liver was observed.     

水牛Keap1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究克隆了水牛Keap1基因的全长编码区,并对其序列进行了生物信息学分析,同时探索了其在水牛各组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Keap1基因的序列信息,设计特异性引物并扩增出水牛Keap1的目的片段,利用生物信息学分析方法,对测序所得水牛Keap1基因序列、预测蛋白质序列进行了分析,并采用实时荧光定量PCR技术对Keap1基因mRNA在水牛各组织中的表达进行了研究。结果表明,水牛Keap1基因编码区全长1 875 bp,预测编码624个氨基酸;多重分析结果显示,水牛与牛、绵羊、野猪和人Keap1基因的同源性分别为99%、96%、92%和90%;进化树分析表明Keap1在物种间具有较高保守性,不同物种间Keap1序列的差异符合物种间的进化性。对Keap1蛋白质二级结构预测发现,其包含24个α-螺旋、40个β-螺旋、38个T转角和27个无规则卷曲。实时荧光定量PCR结果显示,Keap1基因在水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉组织中均有表达,但心脏中表达量最高,肝脏、脾脏中表达量较低。本研究成功克隆了水牛Keap1基因,并进行了相关生物信息学分析及其mRNA在水牛各组织的表达情况研究,为阐明Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高水牛胚胎体外培养的抗氧化能力奠定基础。     

Cloning and Sequence Analysis of Buffalo Keap1 Gene and Investigation of Its Expression Pattern in Different Tissues

In this study,the CDS sequence of buffalo Keap1 gene was cloned and analyzed,then its expression pattern in different tissues was also investigated.A pair of primers of buffalo Keap1 gene was designed based on the nucleotide sequence of Bos taurus Keap1 gene from GenBank,and then the buffalo Keap1 gene was amplified.Using the bioinformation techniques,the gene sequence and the protein structure were analyzed.The expression level of Keap1 gene in different tissues were detected with Real-time quantitative PCR.The results showed that the length of buffalo Keap1 gene coding sequence was 1 875 bp and encoded 624 amino acids.The multiple sequence alignment results showed that buffalo Keap1 gene shared 99%,96%,92% and 90% of similar nucleotide sequence with that of Bos taurus,Ovis aries,Sus scrofa and Homo sapiens,respectively.And the phyogenetic tree also showed the conservatism between several different species.The second structure of buffalo Keap1 protein was predicted as 24 alpha regions,40 beta regions,38 turn regions and 27 coil regions.In addition,the results of Real-time quantitative PCR showed that Keap1 mRNA exists in all seven tissues,but the most abundant expression was in heart and the minimal expression was in liver and spleen.The results provided an foundation for further study of Keap1-Nrf2-ARE signal pathway,for enhancing the ability of antioxidant of buffalo embryo in vitro culture.     

Cloning of Buffalo AQP9 Gene and Analysing its Expression in the Buffalo Tissues

Cloning buffalo AQP9 gene and analyzing its expression in buffalo tissues.A pair of primers was designed according to the released bovine AQP9 sequences in GenBank,which was used to clone buffalo AQP9 gene.The AQP9 gene was amplified by RT-PCR,whose nucleotide sequence and protein structure were analyzed by bioinformatics methods.The expression of AQP9 in buffalo tissues was assayed by Real-time quantitative PCR.The expression of AQP9 gene in buffalo ovary and testis tissue was detected by immunohistochemical staining method.The results showed that the cloned ORF length of buffalo AQP9 gene was 888 bp,which coded 295 amino acids.The results of multiple sequence comparison showed that the nucleotide sequence of buffalo AQP9 shared 99%,90%,97% and 88% homologeous compared with that of Bos taurus,Sus scrofa,Ovis ariessis and Homo sapiens,respectively,while shared 99%,86%,97%,83% homologeous for amino acids,respectively.Phylogenetic tree analysis indicated that AQP9 gene was highly conservative in the evolutionary process.Real-time quantitative PCR results showed that AQP9 gene expressed in buffalo liver,lung,brain,skin,testis and ovary tissues with different levels,had the most abundant expression in liver,followed by in skin and testis,less observed in lung and ovary.The results of immunohistochemical staining showed that the expression of AQP9 protein varied with the development of buffalo ovarian tissue,and gradually enhanced with follicle development.In testicular tissue,AQP9 protein expressed in spermatocyte and leydig cells of developmental stage testis.These results indicated that we had successfully cloned buffalo AQP9 gene sequences.The expression and its function of AQP9 in buffalo ovaries and testes might play an important role in follicle development and spermatogenesis.     

水牛体外培养早期胚胎中致密化相关基因mRNA的表达分析

为了研究致密化相关基因在水牛体外培养早期胚胎中的mRNA表达情况,采用Taqman探针法和SYBR GreenⅠ染料法分别分析了缝隙连结蛋白43和31(Cx43、Cx31)、上皮钙调素蛋白(E-cad)3个基因在水牛体外成熟卵母细胞及培养的早期胚胎中的mRNA表达。结果发现,Cx43基因在水牛成熟卵母细胞中表达量最高,显著高于后3个发育阶段(P0.05);Cx31基因mRNA表达趋势与Cx43相反,成熟卵母细胞中表达量最低,囊胚期最高,随体外胚胎发育Cx31mRNA表达量逐渐增高;E-cad基因在体外培养的各阶段胚胎中mRNA表达无显著差异(P0.05)。以上结果表明,3个致密化相关基因在水牛体外培养早期胚胎中均有表达,但是具有明显不同的mRNA表达方式。     

水牛水通道蛋白8基因克隆及表达分析

In this study, buffalo AQP8 gene was cloned and its eukaryotic expression vector was constructed, the expression pattern of AQP8 gene in buffalo ovary tissue was also assayed. The results showed that the CDS length of cloned buffalo AQP8 gene was 732 bp, and it shared 100% homology of amino acid sequence with cattle and mouse. AQP8 protein was detected in different developmental stages of buffalo follicles, it had significantly higher expression in the secondary follicles than that of in the primordial and the primary follicles (P＜0.05), and it mainly expressed in the granulosa cells of the secondary follicles. Clear EGFP green fluorescent was observed in transfected cell groups with transfection of the pEGFP-N1-AQP8 eukaryotic expression plasmid into HEK293T cells by Lipofectamine^R LTX and PLUS^TM reagent. The above results lay foundation to further investigate the function of AQP8 gene in the buffalo follicle development and granulosa cell apopotosis.