小金海棠高效脱毒检测体系的探讨

 以小金海棠组培苗为试材，对其进行苹果潜隐病毒接种、脱毒及检测方法的研究，探讨了一种针对小金海棠的快速高效的脱毒检测体系。结果表明，恒温38℃处理20 d或变温38／22℃处理30 d并结合茎尖培养，对脱除小金海棠苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的效果较好。离体条件下，指示植物‘苏俄苹果’和‘弗琴尼苹果’不适合检测该两种病毒，而用PAS—ELISA法检测结果较灵敏。     

苹果组培苗脱毒试验

热处理是苹果获得无病毒原种材料的有效途径之一。我们研究了不同品种苹果组培苗热处理对褪绿叶斑病毒、茎沟病毒的脱毒率和影响组培苗脱毒的因素 ,现报道如下。(1)材料和方法　分别从经指示植物和血清酶联免疫检测带有褪绿叶斑病毒、茎沟病毒的国光、金晕、秋富 1号、优良短枝、北斗苹果树正在生长的新梢上取茎尖 ,用 70 %酒精处理 4 0秒 ,再用 0 .1%升汞处理 8分钟 ,用无菌蒸馏水冲洗 3～ 4次 ,接种到外植体培养基MS+6 - BA1.5 mg/ L上 ,茎尖正常分化后 ,移入 MS+6 - BA1.2 mg/ L +IAA0 .3mg/ L +蔗糖 30 g/ L+琼脂 7g/ L的分化培…     

山东省苹果无病毒苗木引种繁育程序及其管理意见

长期以来,我国由于对苹果病毒,特别是对潜隐病毒研究较少,在育苗时不自觉地从带毒树上采取接穗,致使病毒不断扩散蔓延。据调查鉴定,我国目前的苹果主栽品种普通带有病毒,主要有显性的苹果锈果病毒、花叶病毒、绿皱果病毒;潜隐性的有苹果褪绿叶斑病毒、茎痘病毒、茎沟槽病毒共六种。带毒树与无病毒树一般生长量减少16～36%,产量降低16.9～40%,氮肥需用量增加 30～40%,且果实品质下降。为尽快发展苹果无毒化栽培,保证向社会提供更多的优质纯正无病毒苹果苗木,1991年农业部与山东省联合建立苹果无病毒苗木繁育基地,从脱毒检测、组培以及大田育…     

A蛋白酶联法检测苹果褪绿叶斑病毒和茎沟病毒的研究

<正> 苹果褪绿叶斑病毒(CLSV)和茎沟病毒(SGV)是苹果的两种主要潜隐病毒,严重影响苹果的产量和质量。检测苹果潜隐病毒的传统方法是木本指示植物二重芽接鉴定法,但这种方法耗工费时。由于两种病毒不稳定和在苹果树中含量低,用经典的血清学方法不能直接检测苹果植株粗汁液中的病毒。近几年国外采用酶联免疫吸附法(EL     

微茎尖培养脱除樱桃2种病毒试验

樱桃树受到病毒侵害,造成树势衰弱,果实畸形,观赏和经济价值大大降低,其中危害严重的病毒有苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和李属坏死环斑病毒(PNRSV)2种.本文采用微茎尖组织培养法脱除苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒,并用RT-PCR技术检测脱毒效果.     

山定子组培脱毒技术

山定子（Malus baccata Borkh），又名山荆子，蔷薇科、苹果属，它是一种落叶乔木，具有很好的观赏效果，春天白花满树，秋季红果累累，且经久不凋，甚为美观，在园林上可用做庭园观赏树，丛植、独植或与其他树种林植效果都比较好。常见的繁殖方法是播种繁殖，但在其生长的过程中易感染苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎痘病毒和苹果茎沟等病毒，影响其观赏效果，甚至可导致全株死亡。此外一些潜隐性病毒侵染植株后，症状不明显，不易被发现，尤其危险，而受病毒侵染的植株全身终生带毒，目前尚无药物可以治愈。随着组培技术的发展，其快速繁殖、脱毒性能好等特性使人们开始尝试采用组培方法来生产山定子无病毒苗。现详细地介绍山定子组培脱毒的方法，希望给大家在山定子的组培生产方面提供一些参考。     

苹果病毒的研究现状

苹果病毒病在世界各地分布广泛,目前已报道的苹果病毒有39种,中国已鉴定明确的苹果病毒有17种。根据病毒危害特点,通常把苹果病毒分为潜隐性病毒和非潜隐性病毒,其中潜隐性病毒主要有苹果褪绿叶斑病毒(A C LSV)、苹果茎痘病毒(A SPV)、苹果茎沟病毒(A SG V),非潜隐性病毒主要有苹果锈果病毒(A SSV)、苹果花叶病毒(A PM V)。苹果病毒侵染果树,主要表现为叶片失绿、畸形、生长量减少、产量下降、品质变劣等现象,严重时树体死亡。1苹果主要病毒的特性1.1苹果褪绿叶斑病毒(A pple chlorotic leaf spotTrichovirus)曾被归为长线形病毒…     

苹果褪绿叶斑病毒的分离提纯和酶联免疫吸附法检测

<正> 苹果褪绿叶斑病毒CLSV是影响苹果生产的主要潜隐病毒之一。目前在培育繁殖苹果无病毒苗木的工作中,普遍采用木本指示植物二重芽接法检测病毒,但这种方法费工费时。因此,我们从1987年开始进行病毒的分离提纯和抗血清制备工作,旨在为苹果潜隐病毒的大规模检测,建立简便、快速、灵敏的血清学方法。     

我国北方梨产区主栽品种病毒种类的鉴定研究

１９８８－１９９３年对梨树的病毒鉴定表明，我国北方梨产区１５个主栽品种的带病毒株率为８６．３％，其中梨环纹花叶病毒４４．３％、梨脉黄病毒６１．８％、　　矮化病毒１１．５％、苹果茎沟病毒３２．８％；国家梨种质资源圃（辽宁兴城）５个梨系统２３个主要品种的带病毒株率为６０．９％，其中梨环纹花叶病毒４１．３％、梨脉黄病毒５４．４％、矮化病毒２７．２％、苹果茎沟病毒３８．０％。研究显示，上述４种病毒与指示植物的最佳组合为杂种／梨脉黄病毒、Ａ２０／梨环纹花叶病毒、　　Ｃ７／１／矮化病毒、弗吉尼亚小苹果／苹果茎沟病毒。经鉴定证明，梨环纹花叶病毒与苹果褪绿叶斑病毒、梨脉黄病毒与苹果茎痘病毒分别为同一种病毒。     

3种苹果潜隐病毒多重RT-PCR检测体系的建立

 研究建立了能同时检测苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV) 、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) 和苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 的多重RT-PCR方法。以复合感染3种病毒的苹果‘望山红’组培苗为试材, 对影响多重PCR的反应条件进行了一系列的调整和优化。多重RT-PCR体系灵敏性测验显示, 最低能从RNA总量187.5 ng的样品中检测3种病毒的存在。多重RT-PCR产物的序列与报道的病毒序列有较高的同源性, 12个田间苹果样品的多重RT-PCR检测结果与单一PCR的结果一致, 初步证明了多重RT-PCR检测的准确性。     

Pome fruit viruses at the Canadian Clonal Genebank and molecular characterization of Apple chlorotic leaf spot virus isolates

A survey for apple and pear viruses was carried out at the Canadian Clonal Genebank (CCG), Harrow, Ontario, Canada, during the fall/winter of 2007 and spring of 2008. Leaves and/or dormant cuttings were randomly collected from 438 to 122 accessions of apple and pear, respectively. Samples were tested by Double Antibody Sandwich-Enzyme Linked Immunosorbent Assay (DAS-ELISA) for the presence of Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), Apple stem pitting virus (ASPV), Apple stem grooving virus (ASGV) and Apple mosaic virus (ApMV). Infection rates for apples were ACLSV (48.1%), ASGV (10%), ASPV (6.6%) and ApMV (7.1%), and for pears ACLSV (42.6%). ACLSV was detected and characterization by multiplex RT-PCR with primers targeting a fragment of 677 bp corresponding to the partial coat protein (CP), movement protein (MP) and untranslated (3′UTR) region in 22 accessions of apple and pear. Multiplex RT-PCR showed a higher sensitivity over the ELISA test. The nucleotide and amino acid deduced partial CP identities ranged from 82.6–100% to 91–100%, respectively, while partial MP identities was 62.5–100% at aa level based on the amplified fragment appropriate for partial MP using a frame shift, among 22 ACLSV isolates. Phylogenetic analyses based on the partial CP region clustered CCG ACLSV isolates in two different groups, while those based on the partial MP region embraced CCG ACLSV isolates in two sub-clusters within the same group. This is the first report on the detection of ACLSV, ASPV, ASGV and ApMV at CCG, and the molecular characterization of ACLSV isolates in apple and pear plants from worldwide countries to deduce possible heterogeneity and evolution.     

两步多重RT-PCR快速检测苹果潜隐性病毒

【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法,【方法】以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的成龄苹果树韧皮部为试材,根据基因库中苹果茎痘病毒(Apple stempitting virus,ASPV)的外壳蛋白基因序列,设计合成了2对特异性引物,分别与合成的苹果茎沟病毒(ASGV)引物和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的引物组合配伍,筛选出最佳的引物对组合。对cDNA的合成所用引物和总RNA模板进行遴选和量化,对PCR过程中cDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。【结果】结果表明,反转录引物为Oligo(dT)18、总RNA 0.1～3.0μL时,可以得到较好的cDNA;ASPV-FR与ASGV-Pch、ACLSV-Pch引物组合优于ASPV-Pch,并且筛选出4组最佳的终浓度处理组合;cDNA用量为2.0~4.0μL、退火温度为50.0~52.9℃、循环数为35时,扩增效果较好。采用优化的多重RT-PCR体系对采自陕西和山东两省的样品进行检测,并用3种病毒的单重RT-PCR体系进行验证。【结论】结果呈现高度一致性,充分印证了该多重RT-PCR体系的准确性,适用于大量样品的快速检测。     

云南苹果产区苹果茎沟病毒(ASGV)的发现及其分子变异

【目的】为了查明云南省苹果产区的苹果茎沟病毒病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的侵染情况和不同来源分离物间的分子变异情况,【方法】以云南昭通、丽江、昆明、曲靖等地采集的325份苹果病毒样品为试材,采用RT-PCR技术对其是否携带ASGV进行检测,运用DNAMAN6.0、MEGA5.0对实验获得的6个分离物和GenBank上已登录的34个分离物进行序列比对分析。【结果】ASGV在云南各大苹果产区的发病率高达48%。序列比对结果显示,这些分离物的核苷酸序列相似性为87.3%～93.8%,氨基酸序列相似性为90.7%～98.7%。系统发育树显示,云南的6个分离物聚为一簇,而陕西省苹果分离物YL06与云南省分离物ZT1、TJX1亲缘关系比较近,聚为一支;ASGV苹果分离物要明显区别于ASGV梨分离物和CTLV柑橘分离物。【结论】云南省苹果产区苹果树的ASGV带毒率高达48%,推测可能是一种发生率比较普遍的病毒病,这是云南省发现的首次报道。系统发育树显示:本研究获得的6个苹果分离物明显区别于其他寄主分离物,并且与其他地区的分离物具有一定差异,推测在我国,ASGV的分子变异与寄主/地域来源存在着一定的相关性。     

Analysis of virus structure variants in before- and after-thermotherapy-treated apple plants

Pre-thermotherapy apple plants and their homologous regenerated virus-infected apple plants were used to analyze the effect of high temperature on the structure of plant virus variants. The target bands of apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), apple stem grooving virus (ASGV), and apple mosaic virus (ApMV) in the plants of the two populations were purified and cloned, and 16 positive clones of each sample were randomly selected for single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. The results showed that a predominant haplotype could be found in the two populations. The main variant was the same both in the regenerated and homologous treated plants, but the percentages in regenerated plants could be lower than, the same as, or higher than that in pre-thermotherapy plants. Two types could be divided depending on the percentage of the predominant haplotype in the treated plants, diversity (less 70%) and simple (more 80%), respectively. The clones of different haplotype in each isolates were sent to sequence, and the alignment results in accordance with that of the SSCP analysis. All the results indicated that thermotherapy could not affect the predominant variants of virus in treated plants, just change its percentage.     

苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ASPV外壳蛋白基因（coat protein,cp）保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品构建标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线决定系数达0.996,扩增效率为99%;该方法特异性好,与苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）均无交叉反应;其最低检测限为1.31 × 102 copies ? μL-1,灵敏度比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,适用于田间样品中ASPV的快速定量检测。     

苹果茎痘病毒RT-PCR检测及分子变异分析

利用RT-PCR技术对采自6个苹果品种和7个梨品种的33个样本中的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 进行了检测, ASPV感染率为63% ( 19 /33) 。对6个ASPV中国分离物外壳蛋白(Coat protein, CP) 基因进行了扩增、克隆和测序, 测序结果显示CP基因全长为1 191 nt, 编码397个氨基酸。中国分离物与GenBank中其他分离物核苷酸序列同源性为70.2% ～91.7%。系统进化分析显示不同ASPV分离物分为3个大的类群, 呈现一定的寄主相关性, 并未呈现明显的地理相关性。第一和第三大类群的寄主皆为苹果, 第二大类群包含6个梨分离物和2个苹果分离物。不同ASPV分离物的抗原指数差异较大, 推断可能由于序列变异引起抗原表位变异, 从而引起血清型差异。     

检测砂梨潜隐病毒的IC-RT-PCR和TC-RT-PCR的研究

以砂梨为试材,在生物学和血清学检测的基础上,采用免疫捕作RT-PCR穴IC-RT-PCR雪和试管捕作RT-PCR穴TC-RT-PCR雪技术,对苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)进行了检测分析。结果表明,TC/IC-RT-PCR均能有效检测梨粗提液中的ACLSV和ASGV,分别获得了大小约358bp和499bp的目标扩增片段;但IC-RT-PCR检测ACLSV的效果受到病毒分离株间血清学关系影响。与传统的RT-PCR相比,IC/TC-RT-PCR不仅灵敏度更高,而且不需提取总RNA,可以简化操作程序和减少苯酚、氯仿类有机试剂对人体的伤害和对环境的污染,适合于大量梨样品的病毒快速灵敏检测。     

西安市樱桃病毒病调查及检测研究

对樱桃病毒病的发生情况进行了田间调查,运用鉴别寄主反应型、病原传播特性、负染法电镜观察、琼脂双扩散法测定血清学反应等方法进行检测,查明多数为李属坏死环斑病毒单独感染,其余为李属坏死环斑病毒和苹果退绿叶斑病毒或苹果茎沟病毒混合感染,总感染率为93.94%,并对其感染的症状进行描述。