珍稀植物海南粗榧培育技术

海南粗榧为中国二级濒危物种,被认为是最具潜力的天然抗癌药用植物。为促进海南粗榧的研究和发展,简要介绍海南粗榧,结合其资源分布生境特点,总结和分析海南粗榧苗木繁殖与栽培技术。     

海南粗榧扦插繁殖技术

海南粗榧（C．mannii或Cephalotaxus hainanensis Li）是粗榧属（即三尖杉属）植物中分布最南的一个种，为常绿乔木。其根、茎、叶和果实都含有生物碱，尤以主干树皮部位含量最高，主要成分为三尖杉碱、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱和脱氧三尖杉酯碱。这些成分具有较强的抗癌功效，其中三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱己在临床广泛应用，因此，海南粗榧被称为“抗癌奇木”。此外，海南粗榧的木材材质均匀、纹理细密。目前海南粗榧已经列入中国植物红皮书中，被确立为国家二类保护植物。     

海南粗榧内生真菌BWL6007的鉴定及抗菌活性研究

应用传统真菌形态学鉴定方法,对海南粗榧内生真菌BWL6007 进行鉴定。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、香蕉枯萎病菌、镰刀菌、罗非鱼源无乳链球菌为测试菌种,对海南粗榧内生真菌BWL6007 在不同生长周期15 d内的发酵液抗菌活性进行测定。然后,依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷和正丁醇对发酵液进行分部提取,再测定各部粗提物的抗菌活性。结果表明,海南粗榧内生真菌BWL6007 属于生赤壳属（Bionectria）,是首次从海南粗榧中分离获得的生赤壳属内生真菌;其最佳发酵时间为11 d;发酵液乙酸乙酯部提取物的抗菌效果最佳,活性成分主要以中极性的物质为主。     

海南粗榧内生真菌BWL6007的鉴定及抗菌活性研究

应用传统真菌形态学鉴定方法,对海南粗榧内生真菌BWL6007进行鉴定.以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、香蕉枯萎病菌、镰刀菌、罗非鱼源无乳链球菌为测试菌种,对海南粗榧内生真菌BWL6007在不同生长周期15d内的发酵液抗菌活性进行测定.然后,依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷和正丁醇对发酵液进行分部提取,再测定各部粗提物的抗菌活性.结果表明,海南粗榧内生真菌BWL6007属于生赤壳属(Bionectria),是首次从海南粗榧中分离获得的生赤壳属内生真菌;其最佳发酵时间为11 d;发酵液乙酸乙酯部提取物的抗菌效果最佳,活性成分主要以中极性的物质为主.     

海南粗榧细胞悬浮培养体系的建立

以海南粗榧愈伤组织进行悬浮培养,考察了培养基、维生素、蔗糖浓度、pH值、接种量对海南粗榧细胞悬浮培养体系建立的影响,并利用HPLC技术检测海南粗榧悬浮细胞和培养基中生物碱的含量.结果表明:海南粗榧悬浮细胞系培养的最适条件:MS为基本液体培养基、添加蔗糖35 g/L+VB1 10 mg/L、接种量6％、初始pH值5.5～7.0;发酵过程中每5d调节pH值至6.0,有利于细胞的生长和产物的合成;细胞的生长呈“S”型曲线,细胞生长周期为30 d,产物含量在培养25 d时达到最大;细胞活力呈先急剧上升后缓慢下降的趋势.     

中国粗榧育苗技术

通过对中国粗榧生物学特性和育苗试验研究,总结了中国粗榧育苗培育技术,对林业生产和园林绿化工作者具有一定的参考价值。     

粗榧种子油脂抗氧化性及其脂肪酸组成分析

以粗榧种子为试材,分析不同浓度的粗榧种子油脂提取物对常用食用油(核桃油、大豆油和花生油)过氧化值的影响,并与维生素E抗氧化性进行比较,探究粗榧种子油脂的抗氧化性,并通过气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)分别测定粗榧种子油脂的脂肪酸组成与脂溶性维生素质量分数。结果表明:粗榧种子出油率达31.45%,高于大豆等油料作物;3种食用植物油在16d内的抗氧化效果均随粗榧种子油脂提取物添加量的增加而增强,而粗榧种子油的过氧化值几乎没有变化;在核桃油中进行粗榧种子油脂和维生素E抗氧化性比较发现,粗榧种子油抗氧化性明显高于维生素E。此外,GC分析结果表明,粗榧种子油的脂肪酸组成以棕榈酸质量分数最高,达24.31%,其次是质量分数不等的硬脂酸(12.74%)、珠光脂酸(8.18%)、十五烷酸(7.69%)等脂肪酸;HPLC检测结果表明:粗榧种子油脂中维生素E质量分数为9.73mg/kg,维生素A质量分数为0.63mg/kg。可见,粗榧是一种天然抗氧化物质的良好来源,值得进一步开发和利用。     

改进的变色酸分光光度法测海南粗榧生物碱总碱含量

以传统测定海南粗榧生物碱的方法为对照,参照改良的测甲醛含量的方法对其进行优化,以建立安全、快捷、准确测定海南粗榧生物碱总碱含量的新方法。结果表明,新方法兼备以上2种方法的优点,同时又避免了其缺点,具体表现为(1)用磷酸、过氧化氢取代98%浓硫酸,更安全;(2)用微波加热取代水浴加热,更快捷;(3)增加了挥发干甲醇溶剂的试验步骤,排除了甲醇溶剂的干扰,更准确;(4)试验进一步明确了最佳加热时间为35 s,最佳检测波长为558 nm。结果还表明,新方法在0~20μg/mL范围内,三尖杉碱标准曲线回归方程为y=0.018 4x,线性相关系数r=0.999 5;重复性检测样品的RSD=0.59%;标样回收率98.85%~106.86%,且24 h内显色稳定,测定结果与传统方法无显著差异。综上,新方法安全、快捷、可靠,可作为测定海南粗榧生物碱总碱含量的新方法。     

中国三尖杉属植物资源研究

三尖杉属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）隶属于三尖杉科（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ）。该科仅１属９种，中国产７种３变种，１引种栽培变种。分布于亚洲东部至南亚次大陆。供药用的有三尖杉（ＣｆｏｒｔｕｎｅｉＨｏｏｋｆ）、粗榧［Ｃｓｉｎｅｎｓｉｓ（ＲｅｌｄｅｔＷｉｌｓ）Ｌｉ］、海南粗榧（ＣｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓＬｉ）和篦子三尖杉（ＣｏｌｉｖｅｒｉＭａｓｔ）。细胞组织培养技术是开辟该属资源的重要途径，对合理开发利用这一资源具有重要意义。     

中国粗榧生物碱可溶性液剂的研制及其杀虫活性

【目的】研制0.75%中国粗榧生物碱可溶性液剂,并评价其田间杀虫效果,为其进一步开发和应用奠定基础。【方法】采用国标方法对中国粗榧生物碱可溶性液剂进行研制并评价其质量;采用室内生物活性测定和田间试验方法评价该制剂对小菜蛾(Plutella xylostella)的室内毒力及田间防效。【结果】研制的0.75%中国粗榧生物碱可溶性液剂配方为:20%中国粗榧丙酮提取物+52%无水乙醇+13%醇类溶剂A+15%吐温-80(制剂中含0.75%的中国粗榧生物碱);室内生物活性测定结果表明,0.75%中国粗榧生物碱可溶性液剂对小菜蛾3龄幼虫24和48h的LC50分别为55.91和30.12mg/L;田间试验结果表明,0.75%中国粗榧生物碱可溶性液剂200倍稀释液(有效成分含量为40mg/L)对白菜上的小菜蛾具有较好防治效果,施药后3和7d的防治效果分别为73.82%和62.71%。【结论】0.75%中国粗榧生物碱可溶性液剂对小菜蛾有较好的室内生物活性和田间防效。     

基于高通量测序分析海南粗榧树皮和叶片中微生物多样性

为了探究粗榧树皮和叶片中内生菌的群落组成与结构,本研究采用高通量测序方法对粗榧树皮和叶片中内生菌的群落结构与多样性进行分析。结果表明,粗榧树皮中细菌的ACE指数、Chao1指数和Shannon指数分别为169、170、3.58,均低于叶片,而真菌的ACE指数、Chao1指数和Shannon指数分别为281、283、4.19,均高于叶片,说明粗榧树皮的内生细菌群落丰富度及多样性比叶片低,内生真菌群落丰富度及多样性高于叶片。粗榧树皮和叶片中内生细菌在门水平上主要为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes),其中变形菌门(Proteobacteria)为树皮和叶片中优势菌门;真菌门水平上主要为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota),子囊菌门(Ascomycota)为树皮和叶片中优势菌门。在属水平上,内生细菌主要为假单胞菌属(Pseudomonas)、乳球菌属(Lactococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)等,假单胞菌属(Pseudomonas)均为树皮和叶片中的优势菌属;内生真菌主要有杯梗孢属(Cyphellophora)、帚枝霉属(Sarocladium)、德福里斯孢属(Devriesia)、Musicillium、Chaetothyriales_unclassified、Mycosphaerellaceae_unclassified、Sordariomycetes_unclassified、赤霉菌属(Gibberella)、Incertae_sedis_unclassified、链格孢属(Alternaria)、毛孢子菌属(Trichosporon)、Hannaella等,其中杯梗孢属(Cyphellophora)为粗榧树皮中的优势菌属,Mycosphaerellaceae_unclassified为粗榧叶片中的优势菌属。本研究结果可为进一步对海南粗榧内生菌的开发与利用提供理论依据。     

中国粗榧生物碱的除草活性

【目的】明确中国粗榧(Cephalotaxus sinensis)的除草活性成分,为进一步深入研究中国粗榧的除草作用打下基础。【方法】采用种子萌发法评价中国粗榧乙醇提取物、中国粗榧总生物碱及从中分离得到的8种生物碱(桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、贡山三尖杉碱A、异三尖杉碱、cephalotaxineβ-N-oxide、4-羟基三尖杉碱、台湾三尖杉碱和三尖杉碱)对红三叶(Trifolium pratense)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)、黑麦草(Lolium perenne)及高丹草(Sorghum sudanense)4种杂草种子幼根和幼芽的生长抑制作用;采用盆栽法测定中国粗榧乙醇提取物、中国粗榧总生物碱及各生物碱的鲜重抑制率。【结果】种子萌发试验表明,中国粗榧提取物、中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、三尖杉碱和cephalotaxineβ-N-oxide对红三叶种子具有较强的抑制作用,对幼根的有效中浓度(EC_(50))分别为634.35、690.47、69.47、71.21、174.11和243.12 mg·L~(-1),对幼芽的EC_(50)分别为411.79、413.11、68.52、139.25、237.72和413.62 mg·L~(-1);中国粗榧提取物、中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、三尖杉碱和cephalotaxineβ-N-oxide对反枝苋种子具有较强的抑制作用,对幼根的EC_(50)分别为176.32、29.69、21.01、48.08、199.57和90.74 mg·L~(-1),对幼芽的EC_(50)分别为257.69、46.20、25.51、47.85、65.08和66.34 mg·L~(-1);仅中国粗榧提取物、中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱对高丹草种子具有抑制作用,对幼根的EC_(50)分别为349.54、254.27和84.71 mg·L~(-1),对幼芽的EC_(50)分别为556.50、168.66和154.34 mg·L~(-1);仅中国粗榧提取物、cephalotaxineβ-N-oxide及桥氧三尖杉碱对黑麦草种子具有抑制作用,对幼根的EC_(50)分别为214.40、187.89和26.52 mg·L~(-1),对幼芽的EC_(50)分别为695.58、290.15和122.26 mg·L~(-1);盆栽试验表明,中国粗榧提取物、总生物碱及3种生物碱(桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、三尖杉碱)对双子叶杂草红三叶和反枝苋表现出了一定的苗前除草作用,其中桥氧三尖杉碱的活性最高,以1 000 mg·L~(-1)浓度进行土壤处理后,14 d的鲜重抑制率分别为78.89%和81.11%,但对禾本科的高丹草和黑麦草的鲜重抑制率较低,均在25%以下;茎叶喷雾处理显示,5种药剂对双子叶杂草红三叶和反枝苋的生长表现出一定的抑制作用,但抑制率均在30%以下,而对2种单子叶杂草基本无效果。【结论】中国粗榧生物碱对双子叶杂草具有较好的除草活性,其主要活性成分为桥氧三尖杉碱,且主要作用方式为抑制幼芽(根)的生长,具有进一步研究及开发潜力。     

海南粗榧内生真菌多样性分析

以海南五指山自然保护区海南粗榧为研究对象,从423个表面消毒的组织块中,分离获得416个内生真菌菌株。通过形态学观察和ITS-rDNA 序列分析对分离得到的真菌进行鉴定,分别归入12个属,10属为半知菌,2属为子囊菌。结果表明,在海南粗榧不同组织中,刺盘孢属（Colletotrichum）、拟茎点霉（Phomopsis）均为优势类群,其中,刺盘孢属在叶中最多,拟茎点霉属在树干皮、根皮中最多。此外,镰孢霉属（Fusarium）为树干皮的优势类群,球二孢属（Lasiodiplodia）为根皮的优势类群,双胞束梗霉属（Didymostilbe）为叶的优势类群;Shannon-Wiener多样性指数（H忆）为0.97~1.83,不同组织之间的相似性系数（CS）为0.63~1.00曰分离得到的菌株中,WZS7165、WZS7240及WZS7277与已报道基因序列的相似性分别只有97%、92豫、88豫,具有进一步研究的价值,以确定其是否为微生物新种资源。     

中国粗榧杀虫活性初步研究

【目的】明确中国粗榧的杀虫活性并初步探索其活性成分分离条件,为进一步深入研究中国粗榧的杀虫作用奠定基础。【方法】采用室内生物活性测定方法,评价中国粗榧丙酮提取物对小菜蛾、粘虫、玉米象、淡色库蚊、家蝇、烟蚜和酢浆草茹叶螨等7种重要害虫的杀虫活性;并以粘虫3龄幼虫为试虫,采用活性追踪初步探索中国粗榧中杀虫活性成分的分离条件。【结果】中国粗榧丙酮提取物对供试的7种重要害虫均具有一定的生物活性,其中对小菜蛾和粘虫幼虫的杀虫活性较好,处理48h后,其对小菜蛾3龄幼虫的胃毒致死中浓度(LC50)为74.94mg/mL,拒食中浓度(AFC50)为45.39mg/mL,对粘虫3龄幼虫的胃毒LC50为562.28mg/mL,AFC50为71.96mg/mL;处理24h后,对粘虫3龄幼虫的触杀致死中量(LD50)为0.22mg/头;初步分离结果表明,中国粗榧杀虫活性成分主要集中在石油醚萃取物中的Y5和Y6组分中,点滴量为0.05μg/头时,其触杀死亡率均为100%。【结论】中国粗榧丙酮提取物具有较好的杀虫活性,其作用方式表现为拒食、胃毒及触杀,活性成分主要是非极性亲脂物质。     

粗榧育苗技术

通过采种在林区苗圃地育苗,总结出粗榧种子采种时期和育苗培育技术,为粗榧在周边地区引种栽培提供参考。     

中国粗榧内生真菌多样性研究

中国粗榧(Cephalotaxus sinensis)属三尖杉科植物,为我国特有树种,因含有具抗癌活性的“三尖杉酯类生物碱”而备受人们关注。但粗榧生长缓慢,资源有限,且生物碱在天然植物中含量甚微,远不能满足人们需要,加之近年来人们对植物原料需求的增多,已使这类植物资源遭到严重破坏。虽然化学合成及植物组培取得了不同程度的进展,但仍无法实现对其大规模工业化生产。故希望从粗榧中分离出能产“三尖杉酯类生物碱”的菌株,为抗癌药物生产开辟新途径。因此,作者对产于宁陕秦岭山中的中国粗榧的内生真菌,从菌株的分离、分类鉴定、种群分布到活性物质的…     

粗榧苗木繁殖及园林绿化

<正>粗榧为常绿灌木,树高2~5m,间或长成15m的小乔木,在甘肃省小陇山林区有天然分布。树皮灰色或灰褐色,裂成薄片脱落。阴性树种,较喜温暖,较耐寒,喜温凉、湿润气候,在黄壤、黄棕壤、棕色森林土富含有机质的土壤中生长良好,抗虫害能力很强。粗榧生长缓慢,有较强的萌芽力,一般每个生长期萌发3~4个枝条,耐修剪,不耐移植,有较强的耐寒力,为著名观赏树种,属国家珍贵树种。粗榧种子可榨油。粗榧种子油可用于外科治疗疮     

粗榧种子饼粕中植酸的提取工艺优化研究

为了提高粗榧种子油脂提取后饼粕的利用率,研究粗榧饼粕中植酸的最优提取方法。试验对酸洗p H、碱洗p H、酸洗时间和EDTA浓度进行单因素和正交试验,以确定最优提取条件。结果表明:当酸洗p H4.0、酸洗时间3.0 h、碱洗p H 11.5、EDTA的浓度为0.08 mol·L-1时,所得植酸含量最高,为5.21 mg·m L-1;且对植酸提取影响力大小分别为:酸洗p H碱洗p HEDTA浓度酸洗时间。粗榧种子中植酸含量较高,可用做植酸提取的材料。     

粗榧种子休眠原因及其解除方法研究

通过测定种子活力、种皮透水性、不同部位浸提液的生物活性,研究了粗榧种子休眠原因,并采用低温层积打破休眠。结果表明:粗榧种子生活力为90%,具备较大的发芽潜力;粗榧种皮及胚乳(含胚)中均含有萌发抑制物质,且胚乳(含胚)抑制强度大于种皮;机械束缚和萌发抑制物的存在是造成种子休眠的原因,采用低温层积处理可以打破种子休眠。     

香榧花粉直感现象研究

为寻找湖北省香榧生产中适合的花粉,开展香榧花粉直感现象研究,探讨湖北榧树花粉的利用价值。试验以香榧结果母树为母本(A),选用浙江嵊州木榧(B)和湖北通山榧树(C)作为父本进行人工授粉,检测比较2种父本来源组合的果实形态指标、经济指标和养分含量。结果表明,嵊州花粉和通山花粉对榧籽大小和榧核形状表现出花粉直感现象;对榧籽单籽重、单核重和出仁率等经济指标,对榧籽含油量、蛋白质、维生素E和脂肪酸等主要营养成分没有明显的花粉直感现象。说明通山花粉可以在香榧生产中应用,通山榧树雄株资源有开发利用价值。