大蒜谷胱甘肽硫转移酶基因AsGST的克隆及其对盐胁迫的响应

为了解大蒜GST基因及其编码的蛋白质的结构特征,分析GST基因在不同组织及盐胁迫条件下的表达特性,采用RT-PCR方法克隆得到大蒜苍山四六瓣GST基因,采用BLAST、DNAMAN、ProtParam、MEGA5、Swiss-Model等生物信息工具分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR方法,分析AsGST基因在大蒜根、鳞茎和叶片中的表达差异及其对盐胁迫的响应情况。结果表明,大蒜AsGST基因全长663 bp,编码220个氨基酸,推测蛋白质分子质量为25.58 kDa,理论等电点为6.55,属于tau类GST家族。植物GST的序列相似性较低,但在结构上相对保守。在蛋白的N端含有谷胱甘肽特异结合位点(G位点),C端含有可变性较大的疏水底物结合位点(H位点),在进化关系上AsGST与茄科作物较近。空间结构分析表明,大蒜GST的三级结构由3个β-折叠和11个α-螺旋构成。实时荧光定量PCR显示,苍山四六瓣中GST基因在根中的表达量最高,其次是叶,在鳞茎中的表达量较低,具有明显的组织特异性。盐胁迫处理4 h后,各组织内AsGST基因的表达量均升至最高,说明该基因可响应盐胁迫逆境信号。本研究结果为进一步研究大蒜GST基因的功能奠定了一定的理论基础。     

大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因As-1-SST的克隆与表达分析

植物果聚糖是一类重要的可溶性碳水化合物,其在植物中的积累可提高植物的抗逆性。为了解大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶的序列特征和功能,本研究采用TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)得到乐都紫皮大蒜As-1-SST基因全长序列,利用BLAST、DNAMAN、ProtParam、SWISS-MODEL、MEGA等生物信息工具分析其序列特征,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析As-1-SST基因在大蒜根、假茎、叶片和鳞芽中的表达差异及其对低温和干旱胁迫的响应情况。结果表明,大蒜As-1-SST基因全长1 872 bp, 编码623个氨基酸,推测蛋白质分子质量为69.76 kDa,理论等电点为5.19,为不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果显示,As-1-SST蛋白主要定位于液泡,该蛋白无信号肽,包含2个特异位点,属于糖苷水解酶32(GH32)家族。在进化关系上,大蒜As-1-SST与百合科的洋葱1-SST亲缘关系最为接近。qRT-PCR分析表明,As-1-SST基因在根中的表达量最高,其次是假茎,在鳞芽和叶片中表达水平较低,具有明显的组织特异性;不同组织As-1-SST对于低温及干旱胁迫的响应差异显著,低温胁迫显著诱导了根、假茎、叶片中As-1-SST的表达,而干旱胁迫只显著提高了鳞芽中As-1-SST的表达量,说明大蒜各组织As-1-SST对逆境信号的响应机制不同。本研究为进一步鉴定大蒜果聚糖合成酶基因的生物信息学功能和表达调控机制提供了一定的理论依据。     

红花S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达分析

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是植物代谢过程中的一个关键酶。为了探究SAMS在红花逆境胁迫方面的作用,本研究根据红花转录组数据从红花品种豫红花1号克隆得到1个SAMS的全长cDNA序列,命名为CtSAMS1,并对其进行生物信息学分析、组织表达特性分析及非生物胁迫和激素诱导表达分析。结果表明,红花CtSAMS1基因的开放阅读框(ORF)长1 173 bp,编码390个氨基酸,其蛋白分子质量为42.7 kDa,蛋白保守区预测表明CtSAMS1具有甲硫氨酸腺苷转移酶的保守结构域,属于S-腺苷甲硫氨酸合成酶家族。系统进化分析显示CtSAMS1与来自菊科的SAMS亲缘关系较近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明,CtSAMS1基因在花和茎中表达量最高,在其他组织部位中表达量极低;CtSAMS1基因表达量随着花瓣衰老程度的增加而升高。盐、干旱和低温胁迫均能够诱导CtSAMS1基因的表达,茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸能够诱导红花花瓣中CtSAMS1基因表达,赤霉素对CtSAMS1基因表达有一定的抑制作用。本研究为进一步研究CtSAMS1在红花中的抗逆机制,以及为培育红花抗逆新品种奠定了理论基础。     

白菜型油菜BrBBX家族的鉴定与BrBBX46和BrBBX53基因的胁迫响应分析

BBX是一类重要的锌指蛋白转录因子家族,包含1~2个高度保守位于蛋白质序列N端的BBX结构域,在调控植物的生长发育和响应环境胁迫中发挥着重要作用。利用生物信息学分析手段,在白菜型油菜中鉴定出59个BrBBX家族成员,对它们的染色体定位、基因结构、蛋白保守结构域,以及BrBBX46和BrBBX53基因的启动子进行了分析,并用qRT-PCR技术鉴定了BrBBX46和BrBBX53基因在模拟干旱和盐胁迫下的表达水平。结果显示,59个BrBBXs不均匀地分布于白菜型油菜基因组的10条染色体。通过对系统进化、基因结构、蛋白保守 结构域的分析,59个BrBBXs被分为5个亚族,每个亚族的基因结构、蛋白结构域和保守基序均相对保守,同一亚族的成员具有相似的基因结构和保守结构域。对启动子的分析结果显示,BrBBX46和BrBBX53基因的启动子中均含有大量的胁迫相关响应元件,尤其是干旱胁迫响应元件,二者均有14个;在40% PEG和120 mmol/L NaCl处理下,二者的表达水平均显著上升,说明BrBBX46和BrBBX53基因能够响应干旱和盐胁迫的诱导,可能在干旱和盐胁迫下发挥着重要功能。以上结果为进一步了解和利用BrBBX家族成员改良白菜型油菜耐旱耐盐新品种提供了良好的基因资源。     

芹菜水孔蛋白基因AgPIP2;1的克隆及其对非生物胁迫的响应

为了研究芹菜质膜内在蛋白基因的序列特征及其在非生物胁迫条件下的表达特性,探讨其抗逆功能,以芹菜品种六合黄心芹为试验材料,通过RT-PCR技术克隆AgPIP2;1基因,通过生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列特征,并采用荧光定量PCR技术检测其在不同组织的表达及其对非生物胁迫的响应。结果表明,AgPIP2;1基因含有1个861 bp的开放阅读框,编码286个氨基酸,其编码的蛋白属于PIP2类蛋白。氨基酸序列分析显示,AgPIP2;1含有高度保守的NPA基序以及高等植物PIP蛋白的保守序列,与其他物种PIP2类蛋白具有较高的同源性,与胡萝卜DcPIP2;1的氨基酸序列同源性达到97.90%。在亲缘关系上与大豆GmPIP2;1、胡萝卜DcPIP2;1和绿豆VrPIP2;1较为接近。实时荧光定量PCR技术分析表明,AgPIP2;1基因在芹菜根、叶柄和叶片中均有表达,其中在叶片中的表达量最高,在根中的表达量最低,呈现比较明显的组织特异性。此外,AgPIP2;1基因受到高温、低温、干旱和盐等非生物胁迫的诱导,说明该基因可能参与芹菜抵御非生物胁迫的过程。本研究为进一步了解AgPIP2;1基因的功能及其在非生物胁迫中的作用奠定了基础。     

生长素内流载体基因CkLAX3参与柠条锦鸡儿干旱胁迫响应的分析

植物干旱胁迫进程往往伴随着生长抑制类激素如脱落酸、乙烯的参与,而近年研究表明,生长素也可以响应干旱胁迫。本研究通过染色体步移、生信分析和亚细胞定位等方法,对CkLAX3基因在干旱响应中的作用进行了分析鉴定。研究经PCR扩增获得一个全长为1 398 bp的柠条生长素内流载体基因CkLAX3。生信分析发现,该序列编码465个氨基酸,分子量为52.47 kDa,其编码的蛋白为稳定的疏水性蛋白,二级结构主要由α螺旋组成,具有10重跨膜结构。亚细胞定位结果表明CkLAX3定位于细胞质膜。进化树分析结果表明,CkLAX3与红三叶、鹰嘴豆等植物LAX3基因亲缘关系较近。联合染色体步移和高效热不对称交错PCR (HiTail-PCR)方法克隆得到CkLAX3基因的未知启动子区序列总计1 352 bp。对启动子序列上的顺式作用元件进行分析发现,CkLAX3基因启动子区存在大量干旱响应元件、光响应元件、激素响应元件等。进一步对干旱处理的柠条锦鸡儿进行定量分析发现,CkLAX3的表达量受干旱胁迫诱导,推测该基因在干旱胁迫下发挥重要作用。本研究为进一步探索生长素在调节干旱胁迫应答过程中的作用机制提供了基础。     

几种芸薹属作物APX家族基因的鉴定与序列分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是植物体叶绿体清除H₂O₂的关键酶。为了探究芸薹属作物中APX家族基因的序列特点和表达模式,本研究利用生物信息学方法,从大白菜、甘蓝和欧洲油菜中分别鉴定出10、9和22条APX 家族基因,对这41个成员序列特点、染色体分布、CDS保守域、蛋白保守结构域、蛋白三级结构和系统进化关系等进行预测分析,并通过基因表达数据库分析这些基因在高温、干旱和生物胁迫等逆境条件下的表达模式。结果表明,APX在进化树上可分为8个亚族,分散在不同的染色体上;这些APX基因拥有相对稳定的CDS保守结构域、蛋白保守结构域和三级结构,都具有过氧化物酶功能域,在peroxidase功能域的后端均含有一个螺旋结构状的保守域Motif6。APX基因的Ka/Ks值均小于1,表明APX家族基因整体上正在经历纯化选择。大部分APX1和APX2基因在受到高温胁迫时表达上调,其中BrAPX2a在大白菜的胚和胚乳中强烈响应高温胁迫,但在大白菜其他部位表达微弱,存在一定的表达组织特异性。APX3、APX4等基因对干旱和高温胁迫响应不明显;甘蓝3个APX1基因在白粉虱为害胁迫时表达上调。本研究结果为芸薹属作物APX家族成员的克隆、表达与功能研究提供了一定参考。     

小麦乙烯转录因子TaERF2响应湿害胁迫的表达分析

乙烯响应因子在植物非生物胁迫应答中起重要作用。为了解TaERF2在小麦湿害胁迫下作用的分子机理,本研究对TaERF2基因及其编码蛋白序列特征进行分析,并检测TaERF2在不同耐湿品种中的表达特征及原核表达。结果表明,TaERF2基因含有2个外显子和1个内含子,编码355个氨基酸序列,具有典型的AP2/ERF保守结构域和YRG、RAYD基序。AP2/ERF家族转录因子进化和同源比对分析表明,TaERF2属于AP2/ERF家族B2组,与拟南芥AtRAP2.12、AtHRE1和水稻OsSNORKEL1、OsSNORKEL2有较高的同源性,且启动子区域含有缺氧厌氧顺式元件,推测TaERF2可能为湿害胁迫响应基因。湿害胁迫后,TaERF2在小麦根系中特异表达,在耐湿小麦品种宁麦9号根系中的表达显著上调,2~4 h表达量达到最高,然后显著降低,而在不耐湿小麦品种郑麦1354根系中的表达无显著上调。原核表达结果显示,TaERF2可以快速响应ZPTG刺激诱导,与上述宁麦9号根系中的表达模式相似,表明TaERF2在小麦耐湿中具有重要调节作用。本研究为解析小麦耐湿分子调控机制提供了理论参考。     

海蓬子中高亲和钾离子转运体SbHKT1基因的克隆、表达及生物信息学分析

本研究利用RACE技术从真盐生植物海蓬子中获得了高亲和钾离子转运体SbHKT1基因1647bp完整的ORF框。序列分析结果表明,该基因编码548个氨基酸,分子量为62.10kD,理论等电点为9.33;氨基酸序列中第1个～第35个属信号肽序列,第197个～第537个属离子转运体（TrkH）家族特征序列;该基因编码的蛋白具有10个跨膜结构,N端跨膜区及中部膜上呈现明显的疏水性,C端及中部多个跨膜区呈现强疏水性,符合载体类运输蛋白的特点,因此推测SbHKT1蛋白为跨膜运输蛋白。Blast分析显示该蛋白与碱蓬SsHKT1氨基酸同源性高达77%,与冰叶日中花、赤桉和小麦HKT类蛋白的同源性分别为63%、52%和46%。SbHkt1基因表达存在组织特异性：正常生长条件在根、茎中表达较低,在叶片中几乎看不到表达;在高盐低钾的环境下,各组织表达明显升高,高盐低钾胁迫处理8h,其根部表达处于高峰期;经100μmol/L脱落酸处理4h,根部表达达到最高;干旱胁迫（20%PEG6000）处理2h,根部表达量明显上升。由此推断,该基因参与了植物在高盐低钾、渗透、干旱等非生物胁迫下的生理调控。由于目前已克隆的HKT类蛋白基因多来自非盐生植物,对盐生植物内源HKT基因的研究相对较少,因此,海蓬子内源HKT1基因的全长的获得有助于我们进一步研究该基因在高盐钾饥饿环境下运输钾离子,调节植物体内Na＋/K＋平衡的功能,对于揭示真盐生植物的耐盐机制,将其运用于非盐生植物,培育新的耐盐品种具有一定的意义。     

杜梨精氨酸脱羧酶基因PbADC的克隆与表达分析

精氨酸脱羧酶(ADC)是植物多胺生物合成途径中的关键酶。为探索ADC基因在杜梨中的序列特征及其对非生物胁迫的应答特性,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从杜梨中克隆PbADC基因,利用生物信息学软件进行序列分析,并通过荧光定量PCR技术检测其在不同组织中的表达水平和对多种非生物胁迫的响应。结果表明,PbADC基因的开放阅读框全长2 190 bp,编码730个氨基酸,预测PbADC蛋白含有66个磷酸化位点。结构域分析显示,PbADC含有保守的2-磷酸吡哆醛结合位点、磷酸吡哆醛(PLP)磷酸基结合位点和底物识别信号序列,是Ⅲ型磷酸吡哆醛依赖性精氨酸脱羧酶家族成员。在亲缘关系上与苹果MdADC、甜樱桃PaADC和桃PpADC较为接近。荧光定量PCR检测结果表明,PbADC在叶片中的表达量高于根和茎部组织,且该基因的转录水平受低温、脱水、盐和过氧化氢等非生物胁迫调控。本研究结果为进一步探讨PbADC基因的抗逆功能提供了理论依据。     

谷子CIPK基因(Seita.5G145900)对非生物逆境的响应

在谷子基因组中鉴定出一个CIPK(Seita.5G145900,命名为SiCIPK19)基因。为揭示SiCIPK19对逆境胁迫的响应,对其基因结构、蛋白特征、功能、进化等性状进行了系统的分析和预测,并用实时定量PCR(RT-qPCR)检测了其在谷子苗期不同逆境及关键生育期干旱胁迫下的表达。结果表明,SiCIPK19基因位于谷子5号染色体,基因组序列长1 353 bp,编码450个氨基酸,基因无可变剪切,且不含内含子。功能域分析和多序列比对发现,SiCIPK19蛋白具有非常保守的序列结构,与其他植物CIPK蛋白也非常相似。RT-qPCR分析表明,SiCIPK19基因被聚乙二醇6000(PEG 6000)、ABA、高盐和低温胁迫强烈诱导。此外,SiCIPK19基因在谷子拔节期、抽穗期和灌浆期干旱条件下参与了对干旱胁迫的响应,推测该基因参与谷子对非生物逆境的应答,尤其在抽穗期和灌浆期干旱胁迫应答中发挥重要作用。本研究结果为进一步分析CIPK基因逆境应答机制,以及利用基因工程方法改善谷子抗逆性和提高产量提供了理论支持。     

亚洲棉NCED3基因克隆及其抗旱功能分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是脱落酸(ABA)合成过程中的关键限速酶,被证实广泛参与植物的生长发育进程及对非生物胁迫的应答。为了挖掘、鉴定棉花抗旱相关的NCEDs基因,本研究克隆了亚洲棉(Gossypium arboreum)GaNCED3基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了干旱胁迫下该基因的表达特性;并遗传转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),研究了该基因在干旱应答中的功能。结果显示,GaNCED3基因开放阅读框(ORF)全长为1 794 bp,其编码的蛋白质包含597个氨基酸。该基因在干旱胁迫处理后上调表达,在处理3 h的根中表达量最高,是对照的27.6倍。在萌发期进行甘露醇模拟的干旱处理,超表达GaNCED3的转基因拟南芥种子萌发率和绿苗率均高于野生型。在幼苗期进行自然干旱处理后,转基因拟南芥植株叶片丙二醛含量显著低于对照(P<0.05),游离脯氨酸积累量显著高于对照(P<0.05)。本研究初步证明了外源超表达GaNCED3基因使植株抗旱能力增强,为进一步研究GaNCED3干旱应答的分子机制提供了理论依据,为抗旱育种提供了候选基因资源。     

蓖麻WOX转录因子家族成员的全基因组分析及逆境胁迫响应

WOX是植物中特有的一类转录因子,参与植物发育和应激反应。为探究蓖麻基因组WOX转录因子信息,本研究通过生物信息学方法鉴定出11个蓖麻WOX转录因子家族成员,并对其系统发育、基因结构、保守基序及理化性质等基本信息进行鉴定与分析。结果显示,11个WOX成员被分为三个进化支,在古代进化支、中间进化支和现在进化支分别有2、2和7个成员,同一进化支成员的外显子、基因结构具有相似性,但理化性质差异较大。利用RT-qPCR检测根、茎、叶不同组织中5个蓖麻RcWOXs基因在干旱与盐胁迫下表达情况,结果表明,RcWOXs在不同组织中的表达具有特异性;除RcWOX10受干旱胁迫抑制外,RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8和RcWOX9在干旱和盐胁迫下均被诱导表达,表明RcWOX转录因子在蓖麻逆境胁迫中起调控作用。本研究结果为进一步探究蓖麻WOX转录因子家族在逆境胁迫中的功能提供了一定的理论参考。     

小麦胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D的耐盐性分析

胁迫相关蛋白（SAPs）是一类具有A20/AN1锌指结构域的蛋白,在植物中主要参与逆境胁迫响应。为探究小麦胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D在耐盐胁迫中的功能,本研究以小麦品种旱选10号为试材,克隆得到TaSAP12-D基因,利用农杆菌瞬时注射烟草叶片进行亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行不同组织和盐胁迫条件下的表达模式分析,利用蘸花法将TaSAP12-D转化到拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）中并进行耐盐性分析。结果表明,TaSAP12-D基因全长519 bp,编码172个氨基酸,预测蛋白分子量为18.41 kDa,等电点为9.21。亚细胞定位显示,TaSAP12-D在烟草细胞核和细胞质中均有表达。qRT-PCR结果显示,TaSAP12-D在小麦萌发期和幼苗期的胚芽、根和叶中均有表达,其中在幼苗期的叶中表达量最高。在盐胁迫条件下,TaSAP12-D的表达量显著上调。在150 mmol·L-1NaCl处理条件下,过表达TaSAP12-D拟南芥的存活率显著提高,表明TaSAP12-D可以增强转基因拟南芥的耐盐性。另外,在转基因拟南芥中盐胁迫相关...     

玉米生长素响应因子基因家族全基因组鉴定及表达分析

生长素响应因子(ARF)在植物中可以特异性结合在应答基因的启动子区域,调控植物的生长发育。为了进一步了解玉米ARF基因家族的数量、基本特征、进化关系及响应非生物胁迫和激素的表达模式,本研究在全基因组水平,通过生物信息学方法鉴定玉米ARF基因家族,分析了蛋白理化性质及系统发育,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了4个ZmARFs基因的时空表达模式及高温、干旱、盐和脱落酸(ABA)处理下的表达情况。结果表明,玉米36个ARFs基因随机非均匀分布在9条染色体上,编码氨基酸长度、分子量、等电点及二级结构存在很大的差异。高粱、水稻、拟南芥和玉米的蛋白复合进化树显示共分为Ⅰ~Ⅳ四大类,玉米与高粱ARF蛋白亲缘关系最近,而与拟南芥ARF蛋白亲缘关系最远,且玉米中发生基因内和基因间复制现象。启动子顺式作用元件主要是干旱、低温、氧化和激素类响应元件。RT-qPCR结果显示,ZmARF1、ZmARF6、ZmARF13和ZmARF22基因均在雄穗分支和胚中表达量较高,在花粉中表达量较低;4个基因(除ZmARF22)在高温、干旱、盐和ABA诱导时均显著上调表达。亚细胞定位表明上述4个基因编码的蛋白质均定位于细胞核。本研究结果为揭示玉米ARF蛋白功能和挖掘玉米的抗逆基因提供了理论基础,为抗逆育种提供了分子资源。