CAC3基因转运肽序列和accD基因融合植物表达载体的构建

采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出Accase羧基转移酶β-CT亚基编码基因accD,Accase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列.分析结果与NCBI公布的氨基酸同源性分别为100%,99%.将CAC3基因转运肽序列与accD基因进行体外重组,构建了融合植物表达载体pBI-CAC3tp-accD,为下一步作物的遗传转化打下了基础.     

转异质型ACCase复合基因对油菜含油量的影响

乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是脂肪酸生物合成的限速酶,在油料作物脂肪酸代谢和调控基因工程中具有重要的应用价值。本研究利用同尾酶反复酶切的方法,构建了拟南芥Rubisco SSU小亚基转运肽与大肠杆菌异质型ACCase各亚基基因的融合串联种子特异表达载体,在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的下胚轴转化甘蓝型油菜高油品种CY2,研究异质型ACCase转入油菜对含油量的影响。经过抗生素筛选获得11株转化再生植株,PCR、Southern分子检测证明四个目的基因已整合到T0代再生植株油菜基因组中。RT-PCR检测其中4株,说明在转基因株系中目标基因在籽粒中特异表达。对T2代转基因油菜含油量进行测定,研究表明转基因株系的含油量比对照提高了约5.7%。     

棉花αccD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

转基因烟草植株.T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录.     

盐角草甜菜碱合成相关基因的共表达提高转基因烟草的耐盐性

植物在逆境下能合成甜菜碱,其中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（PEAMT）和胆碱单加氧酶（CMO）是甜菜碱合成过程中的关键酶。本文将盐角草SePEAMT基因、SeCMO基因以及烟草的核基质结合区序列（Mar）利用Cre/loxP重组系统构建到同一表达载体上,得到植物表达载体pYLTAC747N-Mar-SePEAMT-SeCMO-Mar。该载体用电击转化法转入农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR检测确定转基因植株。在含250mM NaCl的MS培养基上35d后,转基因植株生根而野生型植株不能生根;转基因烟草植株甜菜碱积累量显著高于野生型植株,约是野生型植株的5.6~7.7倍;转基因植株与野生型相比,相对电导率显著降低,叶绿素含量明显升高。以上结果表明共表达SePEAMT 和SeCMO能有效提高烟草甜菜碱表达量从而提高烟草的耐盐性。     

phaG和phaC基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。羟酰-CoA-ACP-转移酶和II型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的两个关键酶。将编码羟酰-CoA-ACP-转移酶的基因phaG与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子连接构建表达盒RpsbA-pro-phaG-RpsbA-ter,将II型PHA合酶的基因phaC与水稻叶绿体16S rRNA基因的强启动子Prrn及rbcL基因的终止子连接构建表达盒prrn-phaC-RrbcL-ter,连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD之间,得到烟草叶绿体表达载体pTGC。用包裹有质粒pTGC的金粉子弹轰击烟草无菌苗叶片,经壮观霉素筛选后获得6株叶绿体型转基因植株。对T₀代和T₁代转基因植株进行PCR检测和Southern blot分析表明,外源基因已整合进烟草叶绿体基因组中,且T₁代转基因植株已同质化。RT-PCR分析结果证实外源基因已在转录水平上表达。转基因植株的自交及正反交结果表明,外源基因在转基因后代中能够稳定遗传,遗传方式遵循母性遗传规律,不存在转基因的花粉漂移现象。     

过量表达棉花GhACO2基因增强拟南芥抗逆性研究

乙烯在植物生长发育过程中起到非常重要的作用,ACO基因对于细胞内乙烯的合成起到关键的作用,然而乙烯在植物响应非生物胁迫方面的功能有很大的未知性。研究通过PCR方法从棉花基因组中克隆获得GhACO2基因,构建了植物过量表达载体p35S::GhACO2,通过花序侵染法转化拟南芥,用卡那霉素对转化植株进行初步筛选,进一步对阳性植株进行PCR和GUS组织化学分析检测,结果表明,在转基因拟南芥叶片中有很强的GUS活性,茎和根有微量表达;GhACO2基因已经整合到拟南芥基因组中,成功获得转基因拟南芥。经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株,利用NaCl和PEG6000对T2代植株进行盐胁迫和干旱胁迫处理,结果显示,与野生型拟南芥相比,转GhACO2基因拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性显著性的增强。研究结果为进一步探讨GhACO2的生物学功能和利用基因工程技术进行转基因育种质奠定了基础。     

抗草甘膦基因表达载体的构建及对玉米的遗传转化

以pCambia3301载体为基础,以玉米Ubiquitin(Ubi)启动子、拟南芥叶绿素转运肽(Chloroplast transit peptide,Ctp)基因、抗草甘膦Epsps基因为元件,构建了玉米高效双元表达载体,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导法转化玉米幼胚,获得了抗草甘膦无抗生素标记的转基因玉米植株.经田间初步检测转化玉米植株具有一定的草甘膦抗性.     

大豆二酰甘油酰基转移酶基因GmDGAT1A启动子的克隆与功能分析

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是催化三酰甘油生物合成的关键酶,在三酰甘油的合成和积累过程中具有重要调控作用。为了研究大豆DGAT基因表达调控的分子机制,以大豆品种科丰1号为材料,通过PCR方法对GmDGAT1A的启动子(promoter-GmDGAT1A,pGmDGATIA)进行克隆,并通过转化拟南芥和GUS组织定位研究其功能。结果表明:以大豆叶片DNA为模板,成功克隆到GmDGAT1A基因ATG上游2 192 bp启动子序列。序列分析表明,pGmDGAT1A除具有启动子所必需的TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、赤霉素和脱落酸等顺式作用元件。以GUS为报告基因,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A,并转化野生型拟南芥获得转基因植株。对转基因拟南芥植株进行PCR检测,能扩增到2 192 bp目标条带,表明已获得含有pGmDGAT1A的转基因拟南芥阳性植株。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和根染色较深,但是主根和侧根的根尖部分未染色;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉以及角果内的隔膜和珠柄染色较深,茎和发育的种子未染色,表明pGmDGAT1A驱动的GUS主要在转基因拟南芥的根、叶脉以及角果内的隔膜和珠柄中表达。综上,克隆的大豆GmDGAT1A启动子具有活性,能够驱动下游目标基因的表达,有望应用于转基因育种。     

丙肝病毒融合抗原基因导入烟草叶绿体及转化株同质化的研究

植物生物反应器的研究已成为当前基因工程领域的一个新生长点。 本实验用PCR方法, 从丙型肝炎病毒cDNA文库中克隆了非结构NS3区基因片段及核心抗原C区基因片段, 并在两段基因间加入连接肽SPGS的密码子序列, 构建成融合抗原基因NS3-C。 将该融合基因转入烟草叶绿体转化及表达载体中, 通过基因枪转化法得到转基因植株。 对N     

甘蓝型油菜iMyAP9、iMyAP12基因过表达载体的构建及转化拟南芥

诱导型黑芥子酶协助蛋白(iMyAP)往往与黑芥子酶和黑芥子酶结合蛋白一起以复合体的形式存在,对植物的防御系统有着重要的作用。为了研究黑芥子酶协助蛋白在植物响应非生物胁迫方面的功能,通过以pBI121为载体,分别构建了CaMV35S::iMyAP9和CaMV35S::iMyAP12,浸花法转化拟南芥,用卡那霉素对转化植株进行筛选,并对抗性苗进行PCR检测,初步得到67株转基因植株;提取转基因拟南芥中RNA进行RT-PCR表达分析,结果表明,iMyAP9基因和iMyAP12基因在随机挑选的转基因拟南芥中获得了有效的表达。拟南芥转基因植株的获得为进一步探讨iMyAP9基因、iMyAP12基因的生物学功能奠定了基础。     

转梭梭HaPrxQ基因拟南芥植株的获得与检测

HaPrxQ是参与活性氧清除的重要基因。根据已发表的过氧还蛋白基因序列,设计特异引物,扩增到完整的HaPrxQ基因;构建植物表达载体pCAMBIA2300-HaPrxQ,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥并获得了9份转HaPrxQ基因苗。     

利用酵母单杂交筛选拟南芥AtSTK基因表达调控蛋白的研究

拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。为进一步研究AtSTK基因表达的调控机制,以拟南芥基因组DNA为模板设计引物,扩增获得AtSTK基因的启动子序列,并构建到报告载体pAbAi,将重组报告载体质粒pAbAi-HYT利用BstbⅠ进行单酶切线性化,转化酵母菌株Y1H Gold,线性化的pAbAi-HYT整合到基因组中。然后,将纯化的拟南芥双链cDNA、pGADT7-Rec载体共转化含有报告载体pAbAi-HYT的酵母菌,将菌液涂布到含有100 ng/m L Ab A的SD/-Leu培养基上进行阳性克隆的酵母单杂交筛选。通过回复鉴定、序列测定,最终筛选获得了可能参与AtSTK基因表达调控的4个拟南芥基因。测序结果表明,酵母单杂交筛选获得的拟南芥基因AT3G32090含有WRKY转录因子保守结构域,为WRKY类转录因子的一员。因此,AtSTK基因的表达很可能接受MAPK信号传导途径中AT3G32090基因编码的WRKY类转录因子的调控,从而影响拟南芥植株的耐盐性。     

根癌农杆菌介导ACO基因对亚洲百合的转化

以亚洲百合‘普利安娜’的鳞块为基因转化的受体材料,利用根癌农杆菌介导法将ACO基因导入百合,研究了影响其转化的因素。结果表明,以鳞块为受体材料,外植体预培养0天的污染率最低,有利于农杆菌的侵染;菌液浓度OD600=0.8左右时侵染30 min效果较好;重悬后菌液活化1~2 h有利于抗性芽的分化;MS重悬液和共培养基中均添加20 mg/L乙酰丁香酮（AS）可提高抗性芽分化率;去除大量元素中的NH4NO3可提高转化率;抗性植株经PCR检测部分呈现阳性,初步证明外源基因已整合到百合基因组中。     

拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建

BRs(Brassinosteroids)是植物体内一种重要的类固醇激素,具有十分重要的生理功能。DWF 4是BRs生物合成的关键限速酶,显著影响BRs在植物体中的含量。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542 bp的特异性条带,测序结果表明该条带为AtDWF4基因;生物学信息分析显示该基因可编码513个氨基酸(amino acid,aa),Proscale在线预测该蛋白为亲水性蛋白,且SOPM分析表明DWF 4蛋白含有α-螺旋(alpha-helix)、β-折叠(beta-fold)、β-转角(beta-angle)等多个二级结构。同时,研究还构建了含AtDWF4基因的超量表达载体pRI 201-RdDwf 4,并遗传转化烟草K 326,已获得抗性愈伤组织及抗性芽。本研究为进一步探究过表达AtDWF4基因对烟草形态及抗逆胁迫能力的影响提供理想的实验材料。     

Tryptophan synthesis block-associated sugar response, a physiological marker for rapid selection of Arabidopsis thaliana transformants, marked with feedback-inhibition-insensitive anthranilate synthase gene

The feedback-insensitive anthranilate synthase (AS) gene was used as a selection marker for transformants of Arabidopsis thaliana . The mutant gene ( mAS1-2 ) was constructed by substituting nucleotide at the effector-binding site of the intrinsic AS gene via PCR-mediated site-directed mutagenesis and flanked with the myrosinase promoter pyk10 to drive its expression during initial root elongation. This inducible gene cassette was first introduced into Agrobacterium tumefaciens and then delivered into A. thaliana by floral-dip inoculation. 5-methyltryptophan (5-MT) inhibited AS and suppressed seedling growth of wild type plants as a result of tryptophan starvation. With the addition of sucrose (10 mg/ml), 5-MT inhibited cotyledon opening and caused anthocyanin to accumulate in juvenile seedlings. The present mutant reversed the tryptophan starvation caused by 5-MT and blocked subsequent sugar responses. The sugar responses were detected in non-transformed plants grown on a selection medium containing 10 mg/ml of sucrose and 10 μg/ml of 5-MT after 3 days of incubation. Thus, true transformants could be selected after a short incubation, compared to the conventional kanamycin-selection method that did not eliminate all non-transformed plants.     

GbTCP10基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

TCP转录因子广泛参与植物细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP10基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP10基因pGEM-T Easy-GbTCP10质粒为模板进行PCR扩增,连接至植物表达载体pCAMBIA3301中,再利用冻融法和热激法转到农杆菌GV3101菌株中,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得海岛棉GbTCP10基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP10前体的植物表达载体amiRTCP10-pCAMBIA3301,本试验结果有助于进一步研究海岛棉GbTCP10基因的生物学功能和棉花纤维发育机制。     

异源表达细菌二氢喋呤合成酶基因提高拟南芥叶酸含量的研究

植物是人体叶酸的重要来源,人体缺乏叶酸会导致贫血、新生儿神经系统疾病,还与心血管病及某些癌症的发病有关,因此提高食用作物中叶酸的含量是代谢工程的研究目标之一。本研究将从细菌中分离到的编码二氢喋呤合成酶（DHPS）基因FolP,由35S启动子驱动在拟南芥线粒体中过量表达,获得了转基因植株,转基因植株叶酸总含量比野生型对照提高了48%,表明DHPS酶对植物叶酸的合成起着调控作用。     

南方根结线虫食道腺表达基因7E12影响植物的初步研究

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)是一种重要的植物寄生线虫,它的食道腺产生的分泌蛋白是对寄主造成危害的致病因子。鉴定这些编译分泌蛋白的基因的特性,是认知南方根结线虫对植物致病性或寄生性机理的关键所在。本研究通过使用烟草根部特异表达基因TobRB7的△0.3缺失的启动子,替换植物过表达载体pBI-121的 CMV(烟草花叶病毒) 35S 启动子,构建了南方根结线虫食道腺细胞表达的基因7E12的植物表达载体pBI-Trp-7E12和pBI-Trp。pBI-Trp在本研究中作为空白对照使用。利用农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染花粉管通道法把这两个载体转化了模式植物拟南芥。通过利用卡那霉素抗性培养基对已转化的拟南芥进行筛选,获得了T1代转基因植株。这为研究鉴定该基因的特性奠定了基础,以利于进一步研究南方根结线虫对植物的致病性机理。     

phaC1、phaC2基因双价植物表达载体的构建及其转基因烟草的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)技术，从类产碱假单胞菌YSl(Pseudomonas psuedoalcaligenese YSl)染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因：phaCl、phaC2基因。同时利用套叠PCR技术对phaCl基因进行了改造，经过基因拼接构建了植物表达载体pC3C1(嵌合phaCl)、pC3C2(嵌合phaC2)和pC3C1C2(嵌合phaCl和phaC2双基因)。将构建好的嵌合phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体pC3C1C2，用冻融法转入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens EHAl05)并且通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum Honghuadajinyuan)。2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株，抗性植株大田生长表型正常，生长速度相对缓慢。抗性植株经过PCR、PCR-Southern、Southern检测初步确定有32％烟草稳定整合了phaCl和phaC2。用氯仿一次氯酸钠直接从部分Southern检测阳性转化植株中抽提纯化得到PHA，在产物合成水平确证有25．6％的转基因植株。