虾夷马粪海胆不同肠道中菌群组成及其PCR-DGGE图谱分析

利用细菌16S rDNA PCR-DGGE指纹图谱技术,对虾夷马粪海胆不同肠道的微生物菌群组成进行分析,结果表明:海胆小肠与大肠样品分别得到14条与13条条带,其中,共有条带为10条,优势条带分别为7条与5条,特异性条带分别为4条与3条;经后续条带比较分析和DGGE图谱割胶测序后发现,小肠与大肠样品中微生物主要来源于外界海水环境,其菌群构成存在差异与虾夷马粪海胆消化巨藻存在不同有关。     

虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)体腔液的酚氧化酶活性分析

分别测定虾夷马粪海胆血浆和体腔细胞溶解上清液(CLS)中的酚氧化酶(PO)活性以及不同刺激物对其酚氧化酶原系统(proPO)的激活效果,并初步分析了患病虾夷马粪海胆体腔液中酚氧化酶活性的变化。结果显示：虾夷马粪海胆体腔液的PO主要分布于血浆中,且个体差异较大,血浆中PO活性为48.28±6.69 U,CLS中PO活性为2.24±1.81 U;proPO存在于体腔细胞中,含量较少,其被1 mg/mL Trypsin及100 mmol/L MgCl2激活后,PO活性分别提高2.24 U和7.86 U,LPS、SDS、CaCl2和甲醇等对酚氧化酶原无明显激活效果;虾夷马粪海胆感染细菌后体腔液的酚氧化酶活性为12.90±2.03 U,相较于健康海胆（30.63 ±2.21 U）显著降低（P＜0.05）,而在100 mmol/L MgCl2作用下酚氧化酶活性提高4.19±1.96 U,相较于健康海胆（2.76±1.15 U）明显升高（P＜0.05）。研究结果为虾夷马粪海胆及其他棘皮动物的免疫防御机制的深入研究提供了基础。     

虾夷马粪海胆反季节繁育技术的研究

对虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的反季节繁育技术以及繁育过程中亲胆的生殖调控、夏季高温对策等进行了研究.结果表明:当积温达到880℃·d时,亲胆性腺部分成熟;当积温达到1 950℃·d时,亲胆性腺成熟并可自然排放精、卵.利用反季节繁育技术可以使海胆繁殖期提早5个月,且受精卵孵化率≥98%,幼虫平均附着变态率为15.1%.对海水采用多次过滤加药物处理的新方法防除桡足类,效率可提高35%,采用海藻诱导法剥离稚胆,成活率可提高14%.     

虾夷马粪海胆筏式人工养殖研究

报道了由日本北海道引进的虾夷马粪海胆在大连海区进行筏式人工养殖的试验情况。结果表明：①采用扇贝笼、鲍鱼笼和塑料筐在大连近海水域进行筏式养殖效果良好,虾夷马粪海胆在该海区可正常生长、并达性成熟;②饵料以海带、裙带菜等为主,间或投喂马尾藻、石莼等;③海区水温在－１．０～２５．２℃范围内,该海胆均可正常生活;④在大连海区虾夷马粪海胆的生长速度比原分布区快一倍左右;⑤养殖１．５～２．０年壳径可达５．０ｃｍ以上并收获;⑥不同养殖器材的养殖密度和效果不同     

虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius TLR基因的全长cDNA序列SiTLR-1(GenBank:HQ259110),并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌Vibrio fortis、β-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明:SiTLR-1全长序列为3637 bp,形成16个α螺旋、33个β折叠;SiTLR-1蛋白有两个跨膜区段,在725⁷50位有跨膜区,发现1个信号肽(1750位有跨膜区,发现1个信号肽(1³2aa)、1个亮氨酸重复富集区(LRR);SiTLR-1在检测的各组织中均有表达,在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌(P<0.05);经V.fortis、β-D-葡聚糖刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达量显著上升,刺激后12 h达到最高值;经dsRNA刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达变化较小,仅在3 h时略有升高。研究表明,TLR基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答,克隆获得的SiTLR-1可特异性识别细菌和β-D-葡聚糖。     

虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增（ RACE）技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotus in-termedius TLR基因的全长cDNA序列SiTLR-1（GenBank： HQ259110）,并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌Vibrio fortis、β-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明： SiTLR-1全长序列为3637 bp,形成16个α螺旋、33个β折叠; SiTLR-1蛋白有两个跨膜区段,在725-750位有跨膜区,发现1个信号肽（1-32aa）、1个亮氨酸重复富集区（LRR）; SiTLR-1在检测的各组织中均有表达,在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌（ P〈0.05）;经V. fortis、β-D-葡聚糖刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达量显著上升,刺激后12 h达到最高值;经dsRNA刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达变化较小,仅在3 h 时略有升高。研究表明, TLR 基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答,克隆获得的SiTLR-1可特异性识别细菌和β-D-葡聚糖。     

虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法

强壮弧菌Vibrio fortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的一种致病菌。为建立强壮弧菌的PCR检测方法,根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物,筛选出特异性强的3对引物VF-6、VF-7及VF-8,分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增,结果显示,3对引物均对强壮弧菌扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带。以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4.1×104、4.1×103、4.1×102 cfu/mL;对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低DNA含量分别为1.4、0.14、0.014 pg/μL。试验结果表明:3对引物的特异性均较好,但灵敏度存在差异,其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳;使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测,健康海胆、养殖海水及投喂的海带均为阴性,而自然海域海水中带有一定量的强壮弧菌。     

虾夷马粪海胆CYP17基因的克隆及其表达差异

采用分子生物学方法成功克隆了虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius CYP17基因。该基因的cDNA全长为1 570 bp,其中开放阅读框1 482 bp,编码493个氨基酸;CYP17蛋白的相对分子质量约为55 540,等电点为8.068,信号肽断裂位点位于第18和第19个氨基酸残基之间;虾夷马粪海胆的CYP17氨基酸序列与紫球海胆S.purpuratus的同源性为97%,与光棘球海胆S.nudus的同源性为96%。用RT-PCR技术对CYP17基因在虾夷马粪海胆生殖腺不同发育时期的表达差异进行了分析。结果表明:在虾夷马粪海胆3个家系的雄性个体生殖腺中,CYP17基因在1-3家系的表达量最高,依次为10-3家系、6-2家系,而在雌性个体生殖腺中,CYP17基因在10-3家系的表达量最高,依次为1-3家系、6-2家系;在4-1家系海胆3个不同发育时期,CYP17基因在雄海胆性腺中的表达量随着日龄的增加而增加,而雌海胆性腺在发育第430天到第447天时表达量略有增加,发育到第512天时表达量明显增加。本研究表明,CYP17基因在海胆雌、雄个体生殖腺中转录水平上的表达差异明显,雄性的表达量明显高于雌性。     

虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法

强壮弧菌Vibrio fortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius的一种致病菌.为建立强壮弧菌的PCR检测方法,根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物,筛选出特异性强的3对引物VF-6、VF-7及VF-8,分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增,结果显示,3对引物均对强壮弧菌扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带.以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4.1×104、4.1×103、4.1 ×102cfu/mL;对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增,结果显示,3对引物VF-6、VF-7及VF-8可检测的最低DNA含量分别为1.4、0.14、0.014 pg/μL.试验结果表明:3对引物的特异性均较好,但灵敏度存在差异,其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳;使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测,健康海胆、养殖海水及投喂的海带均为阴性,而自然海域海水中带有一定量的强壮弧菌.     

虾夷马粪海胆CYP17基因的克隆及其表达差异

采用分子生物学方法成功克隆了虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius CYP17基因。该基因的cDNA全长为1 570 bp,其中开放阅读框1 482 bp,编码493个氨基酸;CYP17蛋白的相对分子质量约为55 540,等电点为8.068,信号肽断裂位点位于第18和第19个氨基酸残基之间;虾夷马粪海胆的CYP17氨基酸序列与紫球海胆S.purpuratus的同源性为97%,与光棘球海胆S.nudus的同源性为96%。用RT-PCR技术对CYP17基因在虾夷马粪海胆生殖腺不同发育时期的表达差异进行了分析。结果表明:在虾夷马粪海胆3个家系的雄性个体生殖腺中,CYP17基因在1-3家系的表达量最高,依次为10-3家系、6-2家系,而在雌性个体生殖腺中,CYP17基因在10-3家系的表达量最高,依次为1-3家系、6-2家系;在4-1家系海胆3个不同发育时期,CYP17基因在雄海胆性腺中的表达量随着日龄的增加而增加,而雌海胆性腺在发育第430天到第447天时表达量略有增加,发育到第512天时表达量明显增加。本研究表明,CYP17基因在海胆雌、雄个体生殖腺中转录水平上的表达差异明显,雄性的表达量明显高于雌性。     

不同蔬菜连作对土壤细菌DNA分子水平多态性影响的研究

 采用从土壤中直接提取微生物总DNA,并用细菌16S rDNA特异性引物进行PCR扩增、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、克隆和测序等一系列分子生物学手段,研究了不同蔬菜连作对土壤中细菌群落结构的影响。结果表明,采自同一地区的土壤样品,其DGGE图谱的相似性很高;同时蔬菜连作对土壤中细菌的群落组成产生影响,这种影响同蔬菜作物种类和连作年限有关。研究结果还表明,所取土样中的细菌大多数为Proteobacteria 类细菌,另外Acidobacteria、Sphingobacteria和Actinobacteria 类细菌只占少量比例。     

乳酸粪肠球菌的分离鉴定与系统进化分析

分离鉴定一株疑似乳酸粪肠球菌.通过对表型特性包括培养特性、形态学观察、生化试验等鉴定,同时结合16S rDNA系统进化分析;结果该株革兰氏阳性菌能在10℃和45℃生长.接触酶阴性,发酵葡萄糖产酸不产气,可生长于6.5%NaCl和pH9.6的环境等,16S rDNA系统进化分析与粪肠球菌有最高同源性.结论表明分离株为乳酸粪肠球菌.     

观音土曲乳酸菌的分离与分子鉴定

[目的]指导白酒生产,提高白酒质量。[方法]采用平板分离法从观音土曲中分离到7株乳酸菌（B1~B7）,测定其发酵产乳酸的量。选取乳酸产量最高的1株菌B7,提取其DNA并进行16S rDNA的PCR扩增、克隆、测序。从GenBank中选取与B7同源性最高的典型菌株,下载其16S rDNA序列,采用邻位相连法构建进化树。[结果]B1~B7的产乳酸量分别为：24.7、20.7、30.7、15.2、9.5、21.8、35.7mg/100m l;对B7的基因组DNA进行16S rDNA的PCR扩增,并对纯化后的扩增产物进行TA克隆,阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳后在3000和1 600 bp处出现电泳条带,说明B7的16S rDNA PCR扩增产物已克隆到测序载体上。同源性分析结果表明,B7为乳杆菌属的短乳杆菌。[结论]该研究从观音土曲中分离到1株高产乳酸菌——短乳杆菌。     

一株土壤中苯酚降解菌的分离、鉴定及降解特性研究

采用富集培养的方法,从焦化废水污染的土壤中分离得到1株能够高效降解苯酚的菌株,命名为HNGCXY.1。该菌株可以在以苯酚为惟一碳源和能源的无机培养基上生长,能够耐受最高浓度为1000 mg/L的苯酚。对该菌株的降解性能研究表明:该菌株具有较强的苯酚降解能力,在温度为28~32℃,pH值为6.5~7.5,摇床振荡速度大于160 r/min,苯酚浓度为600 mg/L的条件下,单位时间内对苯酚的降解能力最强。根据其生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析结果,将其初步鉴定为产碱杆菌(Alcaligenessp.)。     

应用PCR-DGGE指纹图谱技术分析盐水鸭贮藏过程中的细菌多样性

利用传统平板培养和变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱相结合的方法,对盐水鸭在4 ℃贮藏期间的细菌多样性进行了分析.传统培养方法结果显示:盐水鸭在贮藏期间细菌数量增加迅速.PCR-DGGE对盐水鸭及平板培养物中的细菌组成分析结果显示:腐生葡萄球菌(Staphylococci saprophyticus)、溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus)、魏斯氏菌(Weissella sp.)、中度嗜盐菌(Halomonas sp.)和盐单胞菌(Cobetia sp.)是盐水鸭的主要细菌,而腐生葡萄球菌、溶酪大球菌和魏斯氏菌是平板培养物中的主要细菌.     

番茄叶霉病拮抗链霉菌BPS2的筛选及鉴定

从江苏昆山、吉林图门等地采集的土壤样品中分离到1株对番茄叶霉病菌有强烈抑制作用的BPS2菌株。研究其拮抗性表明,对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及多种病原真菌均有强烈的抑制作用。根据形态特征、培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列等方面的多项分类研究,确定其属于链霉菌属,并被命名为Streptomyces tumenensis BPS2。该菌株在大多数培养基上生长良好,基内菌丝无横隔,不断裂,气生菌丝体形成孢子丝,孢子丝呈波曲或直形。     

一株产低温蛋白酶菌株的筛选鉴定及纯酶研究

从土壤中分离筛选获得一株产低温蛋白酶菌株,并对其进行了形态和生理生化鉴定,对部分长度的16S rDNA同源性作了分析,将其鉴定为Chryseobacterium sp.HL221.通过硫酸铵沉淀、G-75和DEAE Sepharose F.F.柱层析从发酵液分离纯化得到纯酶,测得分子量为35000 Da,等电点为4.9.酶促反应最适温度25℃,最适pH为7,酶活在低于25℃,pH7～10范围内稳定.     

乙酰甲胺磷降解菌株XP-3的分离鉴定及其生理特性研究

从长期受乙酰甲胺磷污染的老菜地土壤中,通过富集培养,分离筛选出 5株乙酰甲胺磷降解菌株.选取其中1株有较强降解能力的乙酰甲胺磷降解菌XP-3,提取该菌总DNA进行16S rDNA PCR扩增、测序.BLAST检索及序列分析表明,XP-3菌与金黄杆菌属的同源性为98%.并对其进行了形态和生理生化鉴定,将其鉴定为Chryseobacterium sp.XP-3.通过进一步研究XP-3菌菌株对乙酰甲胺磷的耐药能力及降解效能表明,该菌具有较强的耐药能力,可以在1 500 mg/L浓度下生长繁殖.能以乙酰甲胺磷作为唯一的碳源和氮源生长.接种该菌悬液1mL于500 mg/L、800 mg/L的乙酰甲胺磷无机盐液体培养基中,28℃、120 r/min振荡培养24 h,对乙酰甲胺磷降解率分别可达87.76%和87.16%.     

利用PCR-DGGE法分析暗纹东方鲀的弧菌菌落组成

采用16S rDNA特征序列PCR-DGGE法,分析了不同饵料饲养的暗纹东方的表皮、性腺和肠道中,以弧菌为主的细菌群落的组成。结果表明:(1)共鉴定出暗纹东方体内18种微生物,均归属于变形细菌的gamma亚群,其中13种为弧菌科细菌,3种为肠杆菌科细菌,2种为气单胞菌属细菌;(2)投喂鲜活鱼虾的与投喂人工配合饲料的暗纹东方肠道和性腺中的细菌组成是不同的,在性腺中分离到的所有12种细菌中,只有2种细菌是相同的,约占17%;在肠道中分离到的所有13种细菌中,有4种是相同的,约占31%。而在表皮上所分离到的11种细菌中,有7种细菌是相同的,约占64%;(3)DGGE特征条带V1、V13、V18、V14和V17所代表的细菌只在表皮组织被分离到,V6所代表的细菌仅出现在以鲜活鱼虾作为饵料的暗纹东方性腺中,V5所代表的细菌仅出现在以鲜活鱼虾作为饵料的暗纹东方肠道中;(4)DGGE特征条带V5、V8、V13、V18、V6、V14和V17所代表的细菌不能在TCBS培养基上培养,占18种被鉴定的细菌总数的39%。