二倍体野生棉与四倍体栽培棉基于GISH的遗传关系分析（英文）

【目的】研究二倍体野生棉与四倍体栽培棉间的遗传亲缘关系,进一步探索各棉种间的起源与进化。【方法】以5个二倍体基因组的代表种B1(异常棉)、C1(斯特提棉)、E2(索马里棉)、F1(长萼棉)以及G1(比克氏棉)的基因组DNA(gDNA)为探针,以2个四倍体栽培种(陆地棉中棉所16、海岛棉新海7号)有丝分裂中期染色体为靶DNA,进行了基因组原位杂交(Genomic in situ hybridization,GISH)分析。【结果】以B1、E2和F1gDNA为探针时,杂交信号主要分布在2个栽培种较长的13对A亚组染色体上;各产生3对较强的GISH-NOR信号,其中1对分布在较长的A亚组上,2对分布在较短的D亚组上,其GISH-NOR信号强度与分布情况与以D基因组棉种为探针时相似。说明二倍体B、E、F基因组与四倍体棉A亚基因组具有较高的同源性,亲缘关系更近。这一点与它们的地理分布情况相符;而它们基因组中的45S rDNA重复序列与二倍体D基因组的45S rDNA重复序列同源性较高。C1和G1中以gDNA为探针时,杂交信号分布在2个栽培种全部26对染色体上,无法区分开A或D亚组染色体,都有3对较强的GISH-NOR信号。这一现象与D基因组拟似棉(D6)gDNA为探针的GISH相似,表明二倍体C和G基因组与四倍体棉的A和D亚基因组均具有较高的同源性,或者C和G基因组同时含有A基因组(或其他非洲棉基因组)和D基因组成分,进一步证实了其基因组成分的杂合性;而它们基因组中的45S rDNA重复序列同属D基因组类型。【结论】这些发现可为棉花杂交育种和棉属起源与演化研究提供有用信息。     

基于45S rDNA和雷蒙德氏棉gDNA为探针的草棉FISH核型研究

 草棉基于荧光原位杂交（FISH）的核型公式为2n = 2x = 26 = 16m + 10sm (6 sat),短臂和长臂的相对长度分别为1.43～4.14和3.34～5.18,染色体长度比(最长与最短染色体的比值)是1.63。染色体组有6个随体,都定位在最后3条染色体的短臂上,其中位于第12和第13号染色体的随体在DAPI和罗丹明镜像中明显可见,但位于第11号染色体的随体在DAPI镜像中观察不到。检测到6个(3对)NOR信号,与随体同位,1对位于染色体端粒,2对紧接着丝粒。雷蒙德氏棉基因组DNA（gDNA）作探针时,在体细胞染色体上检测到GISH-NOR,其数量、位置和大小与45S探针的NOR相同,说明FISH核型比以前常规核型（非FISH核型）更精确。结合本试验室其它FISH资料,推断A基因组棉种在作为供体形成异源四倍体棉种以来,一些串连重复序列如rDNA可能发生了很大变化,包括扩增、易位或缺失等。对于D基因组特有的GISH-NOR的一个可能解释,就是D基因组棉种的rDNA拷贝数远远多于A基因组棉种。NOR或者GISH-NOR位点等方面的进一步研究,有助于探讨rDNA基因进化和功能,并作为一种标记应用于棉属构建染色体序号定位的物理图谱。     

利用RAPD检测棉属种间亲缘关系的研究

利用RAPD分子标记技术对棉属24个种进行了种质资源遗传多样性研究,并用棉属近缘植物杨叶肖槿为参考对照,旨在从DNA分子水平上进行亲缘关系鉴定和系统分类。在40个RAPD引物中筛选出多态性高的引物26条,多态性条带比率为2l.0%。使用NTSYS-pc（Version 2.00）软件,及Jaccard’s相似系数UPGMA法进行聚类,表明材料之间存在较大的遗传多样性,对20个二倍体棉种进行遗传相似系数比较,说明旱地棉和绿顶棉、澳洲棉之间的亲缘关系最远;对异源四倍体棉种与A和D染色体组棉种的遗传相似系数比较结果表明,异源四倍体棉种与A染色体组中的草棉和亚洲棉,相似系数都较高,说明在四倍体棉种演化过程中草棉和亚洲棉起的作用是等比例的;异源四倍体棉种与雷蒙地氏棉的遗传相似系数显著高于与其他参试的D染色体组棉种,证明异源四倍体棉种的D染色体组供体种为雷蒙地氏棉,并支持异源四倍体棉种单系统发育起源学说,A染色体亚组的草棉或亚洲棉与D染色体亚组的雷蒙地氏棉两者杂交和染色体加倍后形成原始的异源四倍体棉种,并随着地理和遗传的趋异而分化形成不同的四倍体棉种;RAPD分子标记聚类结果与传统的分类结果基本相符,说明RAPD分子标记资料可用于棉属植物的分类和系统发育研究。     

四倍体栽培棉与二倍体野生棉杂种PMC-FISH研究

 首次将PMC-FISH（花粉母细胞荧光原位杂交）技术应用于四倍体栽培棉与二倍体野生棉杂交所形成的三倍体杂种棉F₁中,成功的鉴定了目标染色体中的单价体、双价体、多价体,还发现在非目标染色体上有星状和片段状的杂交信号。在以A组棉基因组DNA作为探针的PMC-FISH中,分别对三倍体杂种棉F₁及其母本四倍体栽培棉的减数分裂中期I的染色体构型进行了鉴定。结果显示,四个三倍体杂种棉F₁的减数分裂时期染色体的构型分别是：陆地棉(AD)₁×雷蒙德氏棉（D₅）为1IIIaad + 1IIaa + 4IIad + 7IIdd + 5Ⅰa + 7Ⅰd;海岛棉(AD)₂×旱地棉（D₄）为1Ⅴaaaad +1IIIadd + 2IIad + 8IIdd + 6Ⅰa + 5Ⅰd;陆地棉(AD)₁×澳洲棉（C₃）为2IIIadd (adc or acc) + 1IIaa + 9Ⅰa + 4IIcc (dc or dd) + 14Ⅰd (c);陆地棉(AD)₁×南岱华棉（C_1-n）为：1IIaa + 1IIad (ac)+ 10Ⅰa + 6IIcc (dc or dd) + 13Ⅰd (c)。然而,两个四倍体棉染色体的构型都是13IIaa + 13IIdd。上述结果还显示, AD×D的两个杂种组合中,二价体多,单价体少,AD×C的两个杂种组合中,二价体少,单价体多;并且AD×D型杂种中A亚组染色体单体的数目比其在AD×C型杂种中的更少。这说明,与C染色体组相比较,D染色体组与四倍体棉种的亲缘关系更近。同时,我们的结果也证明PMC-FISH技术在分析三倍体杂种棉F1的亲缘关系中起着不可取代的作用。     

海岛棉A亚组和草棉及阿非利加棉单染色体鉴定

 以1套13个陆地棉A亚组染色体特异的BAC克隆为探针, 与海岛棉Pima90-53、红星草棉和阿非利加棉染色体进行荧光原位杂交。这些探针均在染色体上产生了特异信号,从而鉴别了这3个棉种基因组的单染色体。因此,这套BAC克隆也可以作为这3个基因组染色体的细胞遗传学标记。在此基础上,对3个棉种的A（亚）组染色体物理序号进行了命名。根据这些分子标记和连锁群的关系,染色体物理序号和遗传连锁图谱间可实现相互转化。这将有助于研究棉属不同棉种间的起源演化关系,以及新的遗传标记的染色体物理定位和构建染色体物理图谱等。     

二倍体栽培棉种草棉和亚洲棉的核型比较研究

以二倍体栽培棉种草棉(Gossypium herbaceumL.)3个品种和亚洲棉(G.arboreum L.)6个品种,以及1个亚洲棉与草棉种间杂种 F_1为材料,进行核型分析。结果表明,草棉和亚洲棉在核型上基本相似,其主要差异是草棉具有2对 st 染色体,而亚洲棉中没有;虽然2个棉种的核型类别都属于2A 型,但草棉的核型比亚洲棉更对称,属于较原始的类型。来     

亚洲棉、比克氏棉和陆地棉异源四倍体的合成

为了将野生比克氏棉的种子无腺体,而植株上有腺体的珍贵特性转育到栽培棉种上,先用二倍体亚洲棉(A_2A_2)与比克氏棉(G_1G_1)杂交成异源二倍体A_2G_1,将杂种染色体加倍,合成异源四倍体 A_2A_2G_1G_1,再与栽培四倍体陆地棉杂交,组成三交种合成异源四倍体。并对三种杂种的性状遗传学及细胞学进行了分析研究。为培育棉、油、蛋白质三位一体的抗虫新棉种提供了种质。     

亚洲棉、雷蒙德棉和陆地棉NRAMP基因家族的鉴定和进化分析

自然抗性相关巨噬细胞蛋白(NRAMP)家族是跨膜转运蛋白家族,参与多种金属离子的转运过程。为了更好了解棉花NRAMP基因的成员和特征,二倍体和四倍体棉花之间的进化关系,本研究利用二倍体亚洲棉、雷蒙德棉和陆地棉基因组的氨基酸序列对三个棉种中的NRAMP家族成员进行鉴定,分析了NRAMP家族的种类、理化性质、进化关系、基因结构、蛋白基序、染色体定位、共线性关系和选择压力。结果显示,在二倍体亚洲棉基因组(A)中确定12个成员,在二倍体雷蒙德棉基因组(D)中确定15个成员,在四倍体陆地棉基因组(At, Dt)中确定23个成员。按照进化关系的远近将这50个成员分为3个亚类,进化关系较近的成员之间具有更为相似的理化性质、基因结构和蛋白质基序;通过和其他植物的进化关系分析发现,NRAMP基因在单子叶和双子叶植物分离前已经产生;染色体定位发现NRAMP在染色体上的分布并不规律;共线性分析和选择压力分析表明,片段复制在棉花NRAMP基因的遗传进化过程中发挥主导作用,同源基因对在进化过程中处于纯化选择。     

雷蒙德氏棉一段单拷贝序列的FISH分析

雷蒙德氏棉基因组草图的完成为棉花的基础研究奠定基础,然而该基因组草图仍需要后续的补充和完善。利用雷蒙德氏棉基因组草图信息,分别在6条较长染色体的端部选取了4 kb的序列。通过生物信息学分析这些序列在基因组中的拷贝情况,发现2号染色体一端的序列Chr2D属于单拷贝序列,且其内部没有重复序列。随后以该段序列为探针,对雷蒙德氏棉有丝分裂中期染色体进行荧光原位杂交,结果显示在1号染色体和4号染色体的一端有明显的杂交信号,信号大小远远大于4 kb序列所能产生信号的大小,而信号的强度则比正常的杂交信号暗弱。试验结果说明该4 kb序列Chr2D可能在1号染色体和4号染色体的1个端部有较高的拷贝数,而信号强度的暗弱则说明该序列在染色体上的分布方式可能为散漫分布。杂交信号在1号染色体和4号染色体上的相似性说明,这2对染色体可能有一定的亲缘关系。该结果将对雷蒙德氏棉基因组草图的补充完善有帮助。     

二倍体棉种组织培养研究进展

二倍体棉种为四倍体栽培种提供了亲本(祖先)种,是棉花遗传改良的重要种质资源,是构建棉属突变体库、研究棉花功能基因组的优良材料。其中A、B、E、F组棉种起源于亚非大陆,D组起源于美洲大陆,C、G、K组起源于澳洲等地,具有丰富的遗传多样性,其组织培养研究主要涉及植株器官与细胞培养的再生途径、原生质体培养和体细胞培养与融合等,目前已获得了克劳茨基棉(Gossypium klotzschianum)、野生拟似棉(G. gossypioides)、亚洲棉(G. arboreum)、戴维逊氏棉(G. davidsonii)、雷蒙德氏棉(G. raimondii)、司笃克氏棉(G. stocksii)、奈尔逊氏棉(G. nelsonii)、比克氏棉(G. bickii)等二倍体棉种的再生植株,其中茎尖培养仅获得了亚洲棉、比克氏棉再生植株;原生质体培养获得了克劳茨基棉、戴维逊氏棉的再生小植株;此外,获得了陆地棉和二倍体棉种克劳茨基棉、比克棉、司笃克氏棉的种间杂种。二倍体棉种存在着较大的种间差异,组织培养体系可以借鉴木本植物组织培养相关方法。本文综述了相关研究进展,讨论了后续研究方向。     

陆地棉Pht1家族成员的全基因组鉴定及表达分析

【目的】磷是植物三大必需矿质元素之一,对植物的生长发育至关重要。Pht1家族的磷酸盐转运蛋白在植物磷吸收和转运方面具有重要作用,然而关于该基因的系统研究工作尚很少开展。本研究旨在进行Pht1家族成员全基因组鉴定和表达模式分析。【方法】通过生物信息学的方法对陆地棉Pht1家族成员的基因结构、编码蛋白质的结构、染色体定位、基因复制和表达情况等进行全面分析。【结果】(1)在陆地棉的基因组中共鉴定到17个磷酸盐转运蛋白基因(GhPT),其中A亚组包含8个GhPT,D亚组包含9个GhPT;(2)棉花GhPT蛋白之间序列相似性很高,并均具有12个疏水的跨膜区域;(3)进化分析表明这些GhPT蛋白主要聚为2大组(GroupⅠ和GroupⅡ),位于同一组的GhPT的编码基因大部分具有相似的内含子/外显子分布模式;(4)17个GhPT基因不均匀分布在A亚组和D亚组中的5条染色体上,串联复制和片段复制可能导致GhPT基因在陆地棉中的扩增;(5)表达模式分析表明,GhPT6和GhPT14在根中表达量最高,且同时响应低磷和低钾胁迫诱导并上调表达。【结论】这些结果将有助于深入了解Pht1家族基因的功能及离子信号途径相互作用的分子机制。     

采用基于高分辨率熔解曲线技术的SNP标记定位徐州142无絮的短绒控制基因

【目的】定位徐州142无絮(XZ142w)突变体的短绒控制基因n2。【方法】以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)徐州142(XZ142)×XZ142w的F2群体为研究对象,利用108个简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记对n2进行初步定位,再根据2个亲本材料中有单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphic,SNP)的差异基因设计50对SNP引物,用高分辨率熔解曲线(High resolution melting,HRM)技术从中筛选在亲本间有多态性的SNP引物,并用于后代的基因分型。【结果】利用108个SSR标记将n2初步定位在26号染色体的20.2c M的遗传区间内;用HRM技术筛选到9对亲本间有多态性的SNP引物,成功实现基因分型;并结合以SSR构建的连锁图谱,将n2的遗传区间缩小为19.5 c M,n2与最近的SNP标记Cricaas20158遗传距离为5.5 c M,且遗传图谱上的标记与四倍体陆地棉测序物理图谱基本一致。【结论】HRM技术可用于棉花中的SNP检测和n2基因的定位。     

毛棉苗期抗旱性状的QTL定位

【目的】通过分析毛棉苗期抗旱相关性状的数量性状位点(Quantitative trait locus,QTL),以期检测稳定的主效QTL,促进栽培品种抗旱性状遗传改良及提高抗旱育种效率。【方法】以四倍体野生种毛棉(Gossypium tomentosum)和陆地棉品种中棉所12(CCRI 12)的种间杂种F2及其F2:3家系为研究材料,用于基因型分型的F2有188个系,用于表型分型的F2:3家系有149个株系。分别在干旱胁迫和正常灌水2个环境下调查表型数据。采用复合区间作图法对F2:3家系苗期相关性状抗旱系数进行QTL定位。【结果】对苗期相关性状抗旱系数的QTL定位分析,共得到16个QTL,其中与株高、叶片数、叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量抗旱系数相关的QTL分别有5个、1个、3个、3个、4个,分布在13条染色体上。来自毛棉的5个加性QTL分别为qSHDC-19-1、qSHDC-19-2、qSLNDC-5-1、qMDADC-24-1、qMDADC-24-2,其加性效应值为0.10~0.22,解释变异9.4%~25.8%。【结论】这些与抗旱相关的QTL有助于棉花抗旱分子标记辅助选择。     

陆地棉光敏雄性不育基因ys-1的遗传分析与初步定位

【目的】精细定位和克隆陆地棉光敏雄性不育基因。【方法】从陆地棉中040029的航天诱变后代中选育出新型光敏雄性不育系中9106,以中9106与11个陆地棉材料配制杂交组合,初步分析了中9106的杂种优势。以中9106为母本与陆地棉乐土603构建遗传分离群体F1、F2,分析不育性状的遗传特征。利用集团分离分析法筛选简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR),并在包含186个单株的中9106×乐土603 F2群体中用上述SSR初步定位不育基因。【结果】中9106为母本×陆地棉乐土603的F1单株育性均表现正常,而F2群体中的可育单株数∶不育单株数符合3∶1的分离比,推测中9106的不育性状受1对隐性核基因控制。利用集团分离分析法从16 544对SSR中筛选到18对与该不育基因连锁的标记。利用中9106×乐土603的F2群体和18对SSR标记,将不育基因定位于D12染色体,位于标记NAU3442与CGR6339之间,遗传距离均为0.2c M,将该不育基因命名为ys-1。【结论】本研究有助于ys-1的精细定位及其克隆。     

陆地棉抗坏血酸过氧化物酶基因家族全基因组生物信息学分析

【目的】抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)是过氧化物酶家族中的1类成员,可以清除活性氧。APX家族的生物信息学分析有助于更好地了解该家族基因。【方法】利用生物信息学方法,从中国农业科学院棉花研究所提供的陆地棉序列中鉴定出14条APX基因家族序列,并对这14个成员的染色体定位、亚细胞定位、进化关系、理化性质、信号肽、保守基序以及其编码蛋白的结构特征进行了预测分析,并初步分析了部分基因的表达。【结果】APX基因分布广泛,分散在不同的染色体上;且大部分APX蛋白定位在细胞质,是亲水性脂溶蛋白;有3个保守基序,保守性较强;基因起源和进化比较复杂;二级结构的主要元件为α-螺旋和无规则卷曲。根据表达分析推测,第1亚组和第2亚组的基因在棉纤维发育的不同时期起作用。【结论】这些结果有望为APX家族成员的结构与功能挖掘提供参考。     

应用病毒诱导基因沉默技术研究棉花GhAKT1和GhKT2基因的功能

【目的】本研究旨在揭示棉花钾离子(K~+)吸收机制。【方法】以国欣棉3号和中棉所41为材料,应用病毒诱导基因沉默技术研究棉花K~+通道基因GhAKT1和K~+转运体基因GhKT2的功能。【结果】在低水平供K~+(0.1 mmol·L~(-1))和充分供K~+(2.5 mmol·L~(-1))条件下,沉默GhAKT1和GhKT2基因使棉花幼苗的K~+积累量分别降低15%左右和25%以上。此外,沉默GhAKT1和GhKT2基因导致棉花幼苗对K~+的最大吸收速率和亲和能力出现不同程度的下降。药理学试验结果表明,在外界K~+浓度低于250μmol·L~(-1)的条件下,高亲和系统对棉花K~+吸收的贡献大于K~+通道;而且GhAKT1蛋白可能是1个对NH4+比较敏感的组分。【结论】棉花K~+通道蛋白GhAKT1和K~+转运体蛋白GhKT2具有吸收K~+的功能,而且表现出双亲和吸收K~+的特性,可作为改善棉花钾营养的候选基因。     

棉花主茎叶与根系硝酸还原酶活性分布对播期和密度的响应

【目的】本研究旨在探讨大田轻简化栽培条件下棉花氮代谢随播期和密度的变化规律。【方法】选用华棉3109(G.hirsutum L.)于2014年在华中农业大学试验农场,采用裂区设计:播期为主区(S1,5月30日;S2,6月14日),密度为副区(D1,7.5株·m-2;D2,9.0株·m-2;D3,10.5株·m-2),研究了硝酸还原酶(Nitrate reductase,NR)活性在主茎叶位和根系的分布特点。【结果】1)不同播期和密度对叶片和根系NR活性平均值有显著影响。推迟播期对现蕾期棉花叶片与根系平均NR活性无显著影响,增加密度可降低叶片平均NR活性,但对根系平均NR活性无显著影响;推迟播期,显著降低初花期和盛花期棉花叶片NR活性平均值,但晚播对根系NR活性平均值的影响由侧根NR决定,增加密度,叶片和根系平均NR活性呈先升高后降低变化趋势,表明见花施肥后,晚播抑制了棉花地上部叶片氮代谢强度,而增强了地下部根系氮代谢强度;适度增加密度可显著增强棉花地上部叶片和地下部根系氮代谢强度。2)现蕾期叶片NR活性平均值初花期盛花期,根系NR活性平均值大体呈先升高后降低变化趋势。3)主茎叶位NR活性在3个时期均由上而下显著降低,以第1叶至第3叶波动较大,第4叶以下叶片间无显著差异,表明叶片NR活性与叶龄有关,幼叶氮代谢强度高于成熟叶片,成熟叶片之间氮代谢强度保持相对稳定。【结论】长江流域棉区(主要指湖北植棉区)棉花播种不应晚于6月14日,种植密度以9.0株·m-2最佳。     

棉花gDNA体细胞染色体FISH技术

介绍了棉花基因组ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｅＤＮＡ,简为ｇＤＮＡ）体细胞染色体荧光原位杂交〔ＦＩＳＨ〕的技术流程,并着重分析和讨论了影响试验结果的关键因素,包括染色体和探针的变性条件、染色体的蛋白酶Ｋ处理技巧等。试验中作为靶ＤＮＡ的体细胞染色体采用棉属异源四倍体种海岛棉;探针和封阻均采用ｇＤＮＡ,材料是棉属二倍体种Ａ染色体组（Ａｇｅｎｏｍｅ）的棉种（亚洲棉和草棉）和Ｄ染色体组（Ｄｇｅｎｏｍｅ）的棉种（瑟伯氏棉、雷蒙德氏棉、戴维逊氏棉等）,分别交互使用。试验结果比较理想,获得良好的ＦＩＳＨ片子,而且重复性好。     

根钻和图像法测定棉麦套种及单种作物根长密度的精确性研究

【目的】研究田间根钻取样结合计算机图像软件分析方法测定棉麦套种及单种作物根长密度的精确性。【方法】结合田间根钻取样,分别用图像法(DT-SCAN图像软件分析法)和直尺法(常规人工直尺测量法)测量根长密度,通过2002―2013年试验获得的3423对根长密度数据分析图像法的精确性,使用根均方差描述图像法测定值(模拟值)与直尺法测定值(观测值)之间的一致性。【结果】2种方法测定根长密度的相关性较好,图像法的精确性较高。对可能影响图像法精确性的因素分析表明:(1)在不同种植模式下图像法的精确性表现为小麦单种模式棉花单种模式麦棉套种模式;(2)随着土壤深度增加,图像法的精确性增加;(3)在麦棉套种模式下图像法的精确性从麦幅到棉幅逐渐提高,在小麦单种模式下行上大于行间,在棉花单种模式下行上小于行间;(4)在棉花开花前图像法的精确性表现为棉花单种模式大于麦棉套种模式,在棉花开花后表现为棉花单种模式小于麦棉套种模式。【结论】田间根钻取样结合计算机图像软件分析方法测定棉麦套(单)种作物根长密度的精确性较高,该方法成本低、测定速度快,能更好地扫描并分析计算棉花的细小侧根,具有较强的先进性和较高的可靠性。