陆地棉法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

棉酚是棉花重要的次生代谢产物之一,具有抗虫及抗病害的作用。法尼基焦磷酸合酶是杜松烯合酶的上游酶,催化合成法尼基焦磷酸,该物质是棉酚等次生代谢物生物合成的前体。本文依据亚洲棉法尼基焦磷酸合酶基因序列,采用同源RT-PCR技术,克隆了陆地棉法尼基焦磷酸合酶基因,对其序列和编码产物结构进行了分析。荧光定量PCR分析表明,该基因在棉花植株叶片表达量最高,根部最低,在花、铃、蕾、茎中的表达水平接近。以上工作为棉花异戊二烯基途径的分析及相关次生代谢的途径工程研究奠定了一定的理论基础。     

转青蒿反义鲨烯合酶基因对烟草鲨烯合酶基因表达的影响

利用反义技术，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导，将青蒿（Artemisia annua）的反义鲨烯合酶基因导入烟草（Nicotiana tabacum）株系W38中，存转基因烟草中，鲨烯合酶的表达成功地得到抑制，其mRNA的水平降低。对鲨烯合酶的下游产物之一胆同醇的检测显示，转基因烟草的胆固醇含量低于对照，同时以法呢基焦磷酸为前体的二萜支路产物之一的GA，含量得到提高。实验结果表明，反义抑制烟草鲨烯合酶可以降低植物甾醇的生物合成，并促进类异戊二烯途径中以法呢基焦磷酸为前体的其它代谢支路的生物合成。     

甘蔗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)转化拟南芥及转基因植株的生理特性分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)是植物糖代谢的主要参与酶之一,在植物的生长发育过程中起着重要作用。本研究将甘蔗(Saccharum officinarum)UGPase基因cDNA片段连接至载体pBI121,通过BamHⅠ和SacⅠ酶切鉴定及测序验证,结果表明,植物表达载体成功构建;通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,采用浸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。结合卡那霉素抗性筛选和PCR检测,获得了5株T0代转基因植株。对T1代转基因植株进行PCR及Southern blot分析,结果表明,目的基因已成功转入拟南芥中,并且不同的转化植株含有目的基因的拷贝数不同。对T2代转基因植株进行PCR和RT-PCR检测,结果表明,目的基因不仅能在自交系后代中稳定遗传,而且在RNA水平也有表达。同时,对T2代转基因植株的可溶性总糖、蔗糖及淀粉含量进行测定,结果表明,与野生型相比,转基因植株中可溶性总糖含量没有明显的变化,但蔗糖含量有所提高,并且差异明显,比野生型植株提高了50.85%~96.99%,而淀粉含量都较野生型植株的低,降低了9.69%~36.76%。说明UGPase在蔗糖与淀粉的转换过程中起着较为重要的作用,其催化的反应方向影响着组织中这两种产物(蔗糖和淀粉)的分配。     

金龙胆草查尔酮合酶基因(CHS)的克隆及其在花期不同组织的表达量分析

查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是植物类黄酮化合物合成的第一关键酶。为了获得金龙胆草(Conyza blinii Lévl.)CHS基因,本研究采用快速扩增cDNA末端(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆得到了金龙胆草CHS基因的DNA和cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,通过RTPCR检测该基因在花期不同组织部位中的表达情况并检测对应部位的相对花青素含量。结果表明,获得的CHS基因DNA全长2 098 bp,包括2个内含子;cDNA全长为1 692 bp,含有完整开放阅读框(1 197 bp),编码399个氨基酸,包含查尔酮合酶的标志性序列,命名为CbCHS(GenBank登录号:KJ155749)。序列比对结果显示,金龙胆草CbCHS基因与已报道的其它植物的CHS氨基酸序列具有很高相似性(最高为95%)。半定量RT-PCR结果显示,在叶和茎的表达量最高,相对表达量分别达到87.03%和98.33%,表达量之间没有显著差异(P0.05);在根中CbCHS基因表达量最少,相对表达量仅为9.43%,表达量与其余部位具有显著差异(P0.05)。花青素含量也以茎和叶中最高,根中微量,表明CbCHS基因与花青素的蓄积有一定相关性。本研究首次克隆了金龙胆草CbCHS基因的全长DNA及cDNA序列,研究了其在花期不同组织器官中的表达量差异及与花青素的含量关系,为进一步研究CbCHS基因对金龙胆草黄酮含量的影响及其调控机制提供了基础资料。     

缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因(ω3FAD)在酿酒酵母中的低温诱导表达

ω3 脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase, FAD)能使藻类细胞产生一系列具有高附加值的ω3 脂肪酸。在已克隆到缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)的ω3FAD 基因基础上,为进一步了解其功能,本研究首先利用反转录 PCR(RT-PCR)技术,克隆其开放阅读框(open reading frame, ORF)片段,然后亚克隆到穿梭表达载体 pYES2 中,以构建重组酵母表达载体 pY-ω3FAD;通过电穿孔法将该重组载体转入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSc1 菌株中,经筛选与序列验证得到含有 pY-ω3FAD 重组质粒的酵母转化株。在 5℃,添加底物亚麻酸及半乳糖诱导表达,连续培养 72 h,经脂肪酸甲酯的气相色谱分析及气相色谱 - 质谱联用证明,转目的基因的酵母能将外源添加的亚油酸在 15 位脱氢生成α- 亚麻酸,表明ω3FAD具有Δ15 脂肪酸去饱和作用的功能。在不同温度条件下诱导培养时,气相色谱结果显示,在 30℃培养的转基因酵母中没有检测到α- 亚麻酸;但在不高于 25℃培养的转基因酵母中,发现ω3FAD 能将外源添加的底物去饱和为α- 亚麻酸,且随着温度的降低,其去饱和能力增强,5℃时的底物转化效率达到29.73%。将转目的基因酵母在 5℃温度下诱导培养不同时间,结果显示,随着培养时间的增加,LA(linoleic acid,亚油酸)转化为α- 亚麻酸的效率也提高,培养 4 d 时其转化效率达到 38.86%。该研究结果提示,缺刻缘绿藻ω3FAD 基因编码的酶蛋白为一个低温诱导酶。缺刻缘绿藻ω3FAD 基因之所以能在酵母细胞中被低温诱导表达,可能因为后者存在一个低温诱导的脂肪酸去饱和系统。     

朗德鹅3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMGCS1)cDNA克隆及其mRNA在填饲鹅肝组织中表达的研究

本实验旨在获得鹅(Anser anser)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMGCS1)的cDNA序列,观察该基因的表达与填饲鹅肝脏生成胆固醇的相关性。选用填饲28 d朗德鹅作为实验材料,运用RACE方法扩增目的基因的cDNA序列,利用荧光定量PCR技术检测并分析HMGCS1基因在各组织中mRNA的表达,比较填饲28 d后各组织HMGCS1基因表达的变化,同时选用胆固醇试剂盒测定鹅肝中胆固醇的含量。结果显示,HMGCS1基因的cDNA全长为2 947 bp,开放阅读框编码522个氨基酸(GenBank登录号:KF425515)。荧光定量PCR结果显示,该基因在肝脏中表达显著高于其他组织(P0.05)。填饲28 d后,填饲组肝脏胆固醇含量低于对照组(P0.05),该基因在肝脏中的表达显著降低(P0.05)。氨基酸序列分析表明,HMGCS1基因高度保守,与鸭(Anas platyrhynchos)、鸡(Gallus gallus)、鸽子(Columba livia)等家禽同源性较高。该基因特异性地在肝组织中表达,且该基因的表达与肝脏中胆固醇合成呈正相关。本实验结果为进一步研究HMGCS1基因的功能提供了参考资料。     

鲨烯环氧酶基因(SQEs)的克隆及其在温度胁迫下与枇杷悬浮培养细胞中熊果酸(UA)含量的相关性

熊果酸(ursolic acid,UA)是枇杷(Eriobotrya japonica L.)中重要的生物活性成份,鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQE)是UA等五环三帖生物合成途径中的限速酶之一。为了克隆SQEs基因,寻找枇杷细胞悬浮培养获取UA合适的胁迫温度,建立此胁迫温度下SQEs的差异表达及其与UA含量的联系,本研究以枇杷悬浮培养细胞为材料,在对数生长期中后期设置低温15℃和高温35℃处理,研究收获时(12 d)细胞生长与目标产物UA的相互关系。同时,采用同源克隆方法分离SQEs,研究15℃处理中,两个枇杷鲨烯环氧酶基因(ej SQE1和ej SQE2)的差异性表达。结果表明,ej SQE1(Gen Bank登录号:JQ294053.2)与ej SQE2(Gen Bank登录号:JQ294054.2)氨基酸序列的相似度为69.89%,序列的两末端差异最大;15℃下,距离收获48 h的处理中UA总含量最高;ej SQE1和ej SQE2的表达量均出现峰值。ej SQE1和ej SQE2的表达量均出现峰值。15℃下,距离收获24 h的处理,两者表达量显著下降(P<0.05);距离收获长于24 h的处理,枇杷悬浮细胞中ej SQE1和ej SQE2两个基因的表达量之和以及ej SQE2基因与UA的含量呈现出显著正相关(P<0.05)。本研究获得了SQEs基因序列及胁迫温度下的表达特征,为枇杷细胞悬浮培养UA调控机制的研究提供基因源及参考资料。     

甘蔗抗坏血酸过氧化物酶基因(ScAPX)的克隆及表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要酶类.本研究对针刺接种黑粉菌(Sporisorium scitamineum)后的抗、感基因型甘蔗(Saccharum officinarum)进行APX活性测定.结果表明,甘蔗接种黑穗病菌48h内,抗病品种(崖城05-179) APX活性显著高于感病品种(柳城03-182) (P＜0.05).借助电子克隆技术,结合RT-PCR方法,从甘蔗中分离到一个APX基因,并命名为ScAPX(GenBank登录号:KJ7565501).生物信息学分析显示,ScAPX基因全长l 171bp,包含一个1 038 bp的完整开放阅读框,编码345个氨基酸.ScAPX编码的蛋白不含信号肽,推测其为非分泌蛋白,定位于线粒体基质和叶绿体基质中的概率分别为91.1％和88.7％.实时荧光定量PCR检测结果显示,ScAPX在甘蔗根、芽、叶、蔗皮和蔗髓中均有表达,为组成型表达基因,表达量在蔗皮中最高,叶中最低,前者是后者的19.7倍;在外源因子处理后0～48 h,ScAPX基因的表达受水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、氯化钠(sodium chloride,NaCl)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)诱导,SA、MeJA和H2O2处理后的ScAPX 转录本积累量峰值较外源激素(ABA)和环境(NaCl和PEG)胁迫早.前者的ScAPX转录本变化呈现出胁迫初期积累量增加,达到峰值后又逐步下降的特点;在同样的测试时间(处理后24 h)内,ABA、NaCl和PEG处理后ScAPX转录本在达到峰值后未见下降.虽然在外源胁迫下,ScAPX表达量变化存在明显差异,但其表达均表现出正响应上述外源因子对甘蔗的胁迫.本研究为后续深入鉴定该基因的功能与进一步应用提供基础资料.     

绿色杜氏藻DvGGPS生物信息学及转录差异研究

香叶酰香叶酰焦磷酸合成酶(GGPS)能够催化焦磷酸异戊烯酯(IPP)与二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)反应形成二萜化合物通用前体香叶酰基香叶酰焦磷酸(GGPP)。为深入了解GGPS蛋白在类胡萝卜素合成途径中的作用,通过Illumina Hi Seq TM 2000高通量测序获得Dv GGPS基因c DNA全长序列,对GGPS基因序列进行生物信息学分析,并研究花生四烯酸(AA)、乙酰水杨酸(ASA)和硫酸铈铵(ACS)对Dv GGPS基因转录水平的影响及绿色杜氏藻类胡萝卜素含量变化。生物信息学分析结果表明,Dv GGPS基因c DNA全长2 229 bp,含1 041 bp开放阅读框,编码346个氨基酸。GGPS蛋白质序列理论等电点(p I)为5.82,相对分子质量为37.66 k Da,该蛋白为疏水性蛋白,无信号肽和跨膜区域。二级结构预测显示该蛋白分子中α-螺旋结构最多,占57.23%。同源比对结果表明,绿色杜氏藻GGPS蛋白与雨生红球藻亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,62.5 mg·L~(-1)AA、50 mg·L~(-1)ASA和0.8 mg·L~(-1)ACS处理的Dv GGPS基因转录水平达到最高,此时类胡萝卜素含量也均有提高,说明绿色杜氏藻类胡萝卜素的生物学合成可能是通过诱导Dv GGPS基因表达实现的,Dv GGPS基因在类胡萝卜素生物合成中起关键作用。Dv GGPS基因的克隆及表达调控研究为今后探明类胡萝卜素积累的分子机理提供了重要参考,也为进一步通过代谢工程手段提高绿色杜氏藻类胡萝卜素含量奠定了理论基础。     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT—PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶（FLS）基因,在GenBank登录（GenBank accession No．EF205150）,其序列全长1317bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3]端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37．5kD,理论等电点为5．80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a（＋）中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。     

基因芯片技术在植物基因克隆中的应用研究进展

基因芯片是以预先设计的方式将大量的生物讯息密码（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA等）固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术本质是生物信号的平行分析,它利用核酸分子杂交原理,通过荧光标记技术检测杂交亲和与否,再经过计算机分析处理可迅速获得所需信息。由于其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点,已引起国际国内广泛的关注和重视,在许多领域得到了广泛的应用。本文简述了基因芯片的概念,技术特点及主要分类,着重对其在基因表达水平检测,基因突变和多态性的分析,基因组DNA分析,后基因组学研究以及转基因农作物检测等方面进行阐述,并说明其存在的问题及展望。     

苹果丙二烯氧化物合酶MdAOS的克隆和表达分析

丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase,AOS）是茉莉酸合成途径中第一个特异性的酶。本研究从＂嘎啦＂苹果中克隆了一个AOS的基因序列,将其命名为MdAOS,并对其进行了结构和表达分析。MdAOS基因编码区共有1 605 bp碱基,编码531个氨基酸,等电点为4.92,分子量为134.9 kD。MdAOS属于细胞色素P450基因家族的CYP74A亚类,并具有典型的P450成员特征,其编码的蛋白包含4个保守区域,分别为：Heme-Binding结构域、Ⅰ-Helix区、ETLR基序和PEEF基序。MdAOS蛋白的N末端有典型叶绿体信号肽。同源性分析表明MdAOS与碧桃（Amygdalus persica var.persica f.duplex.）AOS基因的同源性很高,且聚类结果也与双子叶植物聚为一类。实时荧光定量PCR分析结果显示,MdAOS在苹果各组织中均有表达且在茎中表达量最高。MdAOS能响应茉莉酸、水杨酸、脱落酸和乙烯的诱导,并在机械伤处理时表达上调。     

酿酒葡萄分支酸合成酶基因（VvCS）的克隆与表达分析

本研究以酿酒葡萄（Vitis vinifera）品种赤霞珠（Cabernet Sauvignon）及霞多丽（Chardonnay）为试材,采用in silico克隆和分子克隆相结合的策略,从果实中克隆到分支酸合成酶基因,命名为VvCS。该基因的cDNA编码区全长1312bp,编码436个氨基酸残基,预测其编码蛋白质分子量为46.9kD,等电点为7.8;生物信息学分析显示VvCS的DNA全长7117bp,包含13个外显子和12个内含子,定位于葡萄的第13号染色体上。VvCS编码的蛋白与其它植物来源的分支酸合成酶在氨基酸水平上的同源性为75%左右;实时荧光定量PCR分析表明VvCS在葡萄果实、茎、叶和叶柄组织中均有表达,且在果皮、果肉和种子中的表达变化趋势相似,与盛花后5周的果实相比,盛花后11周果实各部位中VvCS表达丰度均有不同程度增加。     

番茄茸毛相关基因ShMYB1的克隆与表达分析

番茄茸毛具有多种生物学功能,为了探究番茄中控制茸毛的基因,本研究采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从野生种多毛番茄(Solanumhabroc haites)LA1777中,获得了一个与茸毛相关的R2R3 MYB Subgroup 9家族新成员EST241733的全长编码区cDNA序列,命名为ShMYB1。经生物信息学分析,克隆的ShMYB1基因长1350bp,编码338个氨基酸。该基因具有保守的R2R3MYB结构域和Subgroup 9特异motif序列。荧光定量PCR结果表明,ShMYB1基因在番茄叶和花中表达量高,在根、茎、果实中没有表达。在不同发育时期的叶片中表达量差异不大,但是在幼花蕾表达量最高,随花蕾的增大,表达量显著降低。在几个番茄茸毛突变体与对应的野生型中,这个基因表达量存在明显差异。推测该基因与番茄表皮茸毛发生和花发育有关。     

茶树脱水素基因(CsDHN)的克隆及表达分析

脱水素(dehydrins,DHNs)是植物胚胎发育后期丰富蛋白(late embriogenesis abundant protein,LEA)中的一类,与低温、干旱以及盐胁迫等多种逆境反应相关.本研究采用cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cDNA ends,RACE)技术从茶树(Camellia sinensis)中获得一种茶树脱水素基因CsDHN (GenBank登录号:FJ436978),序列分析显示,该基因cDNA全长960 bp,编码201个氨基酸,推测编码蛋白质分子量约为21kD,等电点为8.3,属于Y3SK2型脱水素.CsDHN基因有2个外显子和1个内含子.生物信息学预测显示,该脱水素蛋白亲水性强、无信号肽和跨膜区,亚细胞定位于细胞质中.表达特性分析表明,CsDHN在逆境及脱落酸(abscisic acid,ABA)诱导下可上调其转录水平,4℃低温处理下表达量可提高4.2倍,而脱水处理能提高93.4倍,高盐处理能提高17.8倍,CsDHN对脱水、高盐胁迫的响应程度优于低温胁迫.CsDHN在茶树各组织器官中都有表达,其中种子中表达量最高,为叶片的11.2倍.研究表明脱水素基因CsDHN可能在茶树防御非生物逆境胁迫和参与茶树种子成熟脱水的活力保护过程起一定作用,为了解茶树抗逆分子机制提供了一定的理论基础.     

西农萨能奶山羊脂联素受体1基因(AdipoR1)cDNA克隆、表达及功能分析

脂联素(adiponectin)具有改善胰岛素敏感性,调节脂肪酸代谢和参与细胞增殖和分化的功能。本研究参考Gen Bank中已收录的牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)等物种脂联素受体1基因(adiponectin receptor 1,Adipo R1)序列的同源比对结果,设计和合成PCR扩增引物,采用反转录PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Adipo R1的c DNA序列。结果显示,Adipo R1全长2 032 bp(Gen Bank登录号:HQ846828),包括开放阅读框(open reading frame,ORF)1 128 bp,3’非翻译区(untranslated regions,UTR)719 bp和5’UTR 185 bp,该基因编码375个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现,山羊与牛、猪(Sus scrofa)、小鼠和人的Adipo R1相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析表明,其蛋白质的分子量为42.44 k D,等电点为7.19,含7个跨膜结构域,并且整个序列中不含信号肽。组织表达分析显示,该基因在肺中的表达量最高,小肠次之,在心脏中表达量最低,而其余8个组织中Adipo R1m RNA水平变化则比较平缓;奶山羊乳腺组织中Adipo R1表达量分析表明,Adipo R1的表达量在干奶期和泌乳盛期乳腺组织差异显著(P<0.05)。用不同浓度胰岛素(insulin)和催乳素(prolactin)处理奶山羊乳腺上皮细胞,结果发现,用胰岛素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量下调,在胰岛素浓度为50 nmo/L时效果最明显(P<0.01);用催乳素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量上升,在浓度为100 mg/m L时作用最明显(P<0.05),表明该基因在奶山羊乳腺上皮细胞中具有一定的调控作用。本研究为进一步揭示Adipo R1基因在奶山羊乳腺组织中的功能提供基础资料。