荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析

 从荔枝‘桂味’的败育胚中提取总RNA，利用GeneRacer^TM Kit将RNA经去磷酸化反应、去mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，分别用SSH分离得到的胚败育相关差异表达s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列(599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物，进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp，编码393个氨基酸，与其它物种的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79%~82%之间，氨基酸序列同源性在88%～91%之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因。关键词：     

‘金煌’杧果胚正常与胚败育果实内源激素的变化

 研究了‘金煌’杧果果实发育前期内源激素变化与胚胎败育的关系。结果表明：胚胎败育在坐果后30 d完成,20 ~ 30 d为胚发育的关键时期,胚败育果实与胚正常果实大小差异主要缘于果肉的差异。在果实发育初期,败育胚的IAA、ABA含量高于正常胚,GA₃和ZT含量低于正常胚。胚败育果实的果肉中GA₃含量低,而ZT含量高于胚正常果实果肉,IAA和ABA的含量在后期也高。胚中高含量的GA₃、ZT和低含量的ABA有利于胚正常发育。胚中ZT的下降和ABA的持续增加以及（GA₃ + IAA + ZT）/ABA的比值小于其果肉中的比值,是导致胚胎败育的重要因素;在果实发育中,胚胎的败育和胚胎与果肉中（GA₃ + IAA + ZT）/ABA均低是导致胚败育果实小的重要原因。     

苹果MxIrt1基因的克隆与原核表达

根据植物IRT(Iron Regulated Transporter)家族的功能保守区设计引物,通过RACE法从缺铁胁迫处理的小金海棠根系cDNA文库中克隆得到了Fe²⁺转运蛋白基因cDNA全长,将其命名为MxIrt1(Malus xiaojinensis Iron regulated transporter 1)。将MxIrt1 cDNA片段与pET30a构建原核表达载体pEIrt,转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol·L^-1 IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个40kD的蛋白。为进一步纯化和鉴定目的蛋白提供了试验基础。     

月季突变体抑制差减杂交cDNA文库构建及分析

为了分析月季花色花香突变机理和揭示花色花香代谢的相关基因, 利用抑制性消减杂交技术分离了月季红花无香突变体‘往日情怀’ (以下简称突变体) 与其野生型金黄色浓香品系‘金银岛’ (以下简称野生型) 之间表达差异cDNA片段。分别以突变体作为驱赶子, 野生型为检测子, 以及以野生型作为驱赶子, 突变体为检测子建立了两个差异表达cDNA文库WSSH和JSSH, 分别代表在突变体和野生型中特异表达的cDNA; 再经文库高密度点阵膜的杂交差示筛选分析, 在WSSH库中获得特异表达的27个阳性克隆, 在JSSH文库中得到25个阳性克隆。差异表达克隆测序后经BLAST比对分析发现WSSH文库中含有与红花突变体的花青素积累直接相关的CHS、DFR、细胞色素P450加单氧酶、乙二醛酶Ⅰ、己糖转移因子、MYB1 转录因子、S - 腺苷蛋氨酸转移酶、ADR等花色相关EST; JSSH文库中含有与野生型花香形成相关的月季甲基间苯二酚O - 甲基转移酶、转醛醇酶、Acyl-CoA 结合蛋白、钙调素结合蛋白、MYB92转录因子的EST以及导致芽变的Ty1-cop ia-like逆转座子。     

应用抑制性消减杂交分离板栗短雄花序芽变相关基因

利用抑制性消减杂交技术分离了板栗正常花序与芽变花序之间表达的差异cDNA片段。以芽变板栗雄花序cDNA为试验方(tester),以对照板栗雄花序cDNA为驱动方(driver),构建了一个板栗芽变花序消减文库。菌落PCR显示插入片段主要在100～1000 bp,文库质量良好。通过对文库阳性克隆随机测序共得到了30个有效EST序列。利用Blast同源性比较,其中一些EST可能与板栗雄花序发育中变短的生物学形态形成密切相关,为后续板栗短雄花序芽变相关基因的研究奠定了基础。     

琯溪蜜柚及其早熟红肉突变体成熟果实SSH 文库的构建及初步分析

 分别以琯溪蜜柚及其突变体红肉蜜柚（成熟期早20 ~ 25 d）的成熟果肉cDNA 作驱赶子和检测子,利用结合分子镜像选择技术的SSH 技术,构建了红肉蜜柚和琯溪蜜柚的正向差减cDNA 文库。通过PCR 检测cDNA 克隆外源插入片段,其大小介于100 ~ 1 000 bp。通过点杂交差异筛选文库,得到102 个表达增强2 倍或以上的克隆并测序,结果表明这102 个克隆代表44 个Unigenes,通过序列同源性比对分析,发现获得的Unigenes 在功能上主要涉及信号传导、蛋白质合成、应激反应、转运等代谢反应。     

荔枝果实发育的研究Ⅱ.成熟期间某些生理生化特点

‘桂味’和‘M-选’荔枝假种皮中的糖浓度,在花后52～53天加速上升之前,葡萄糖和果糖有一明显的低落,系假种皮前期生长导致的稀释效应所致。糖积累的速率与假种皮生长的快慢一致、种子正常果的糖积累落后于种子败育果,与胚争夺溶质有关。品种间蔗糖向单糖的转化率不同与pH值不同导致蔗糖酶活性不同有关。琥珀酸从初期的极高水平迅速降至与苹果酸相近的低水平乃荔枝的一大特点。单果含酸量在下降前有个积累过程与呼吸商偏低有关。荔枝具有“转熟”(veraison)征候群的若干要素,但荔枝假种皮与葡萄中果皮的发育成熟殊异。     

枇杷种子败育与内源激素含量的动态变化关系研究

采用酶联免疫法测定大五星枇杷果实发育早期果肉(花托)及不同败育程度种子内源激素IAA、GA3、ABA、ZR和i PA含量,分析其对枇杷种子退化的影响。结果表明:枇杷开花当天至花后20天,正常种子IAA、ZR、i PA与GA3含量均较高,并分别出现1次高峰值;花后35~80天,果肉IAA、ZR与GA3含量及其与ABA比值均高于种子,高度败育种子中ABA含量及其与其他内源激素的比值均明显高于果肉、正常种子与中度败育种子;花后70~80天,高度败育种子IAA/GA3值和IAA/(ZR+i PA)值均明显上升,花后80天时,这2个比值均高于正常种子和中度败育种子。上述研究结果表明,高含量与高比例的生长类激素对枇杷幼果与胚的正常发育有重要作用,在种子败育中起主导作用的是高含量与高比例的ABA。     

番茄抗病基因Tm-22及其等位基因氨基酸序列的比较

 从4个番茄栽培品种（Lycopersicon esculentum Miller）中获得了Tm-2²等位基因的同源克隆，进行序列分析，结果表明：'沙龙'、'渝抗2号'和'97-4'分别与'GCR-267'（Tm-2²）、'GCR-236'(tm-2)、以及'GCR-26'(tm-2)有100％的同源性, 而樱桃番茄（Lycopersicon peruvianum. var.cerasiforme）品种'樱红1号'与'GCR-26'（tm-2）仅有98％的同源性；在C-端的LRR结构域中，抗病基因 Tm-2²和Tm-2 编码蛋白的氨基酸序列与感病基因tm-2存在624和704两个位点的氨基酸差异，即624位点的脯氨酸（P）对应亮氨酸（L）、704位点的甲硫氨酸（M）对应异亮氨酸（I）； 在601-790个氨基酸的LRR结构域中，抗病基因Tm-2²、Tm-2及其秘鲁种（Lycopersicon peruvianum var. dentatum）lptm-2三者均与感病基因tm-2的编码蛋白存在23个氨基酸的差异；（4）樱桃番茄品种'樱红1号'与含有tm-2基因的栽培种之间具有同源性关系。     

Screening of phage antibodies against HBsAg from the constructed phage display library and sequencing of the positive clones

AIM:Screening of phage antibodies against HBsAg from the constructed phage display library and sequencing of the positive clones.METHODS:RNAs were extracted from blood lymphocytes of a HBsAg-immunized volunteer. Then cDNAs were synthesized by RT-PCR. To construct the phage antibody display library, cDNAs of Fd fragments and κ chains of the antibodies were amplified through PCR and were inserted into vector pComb3H. Three rounds panning against coated HBsAg showed the specific enrichment of phage antibody. Positive clones were selected and sequenced.RESULTS:A phage antibody display library was constructed after amplifing of Fd fragments and κ chains of IgG1. Three Fab antibodies from the library were selected and sequenced. The result of sequencing showed that two of the three antibodies had the same Fd fragment and all of the three had the same light chain. CONCLUSION:The phage antibody display library was constructed successfully and three specific antibodies (Fab fragments) have been obtained from it.     

华东葡萄抗白粉病杂种后代cDNA文库的构建及EST序列分析

以抗白粉病的华东葡萄杂种后代6-12-4株系为试材,利用SMARTTM技术构建了白粉病病原菌诱导的全长cDNA文库。经检测,原始文库滴度为2.50×106pfu·mL-1,重组率达到99%,扩增文库滴度为3.0×109pfu·mL-1,重组率达到95%,插入片段长度在500～2000bp。随机挑取300个克隆,测序获得260条质量较高的ESTs,聚类及拼接后,共得到183个一致序列(所获序列已经提交GenBank,登录号为FG579859-FG580039)。经蛋白功能预测分析,获得含有TPR结构域的小的富含谷氨酰胺的蛋白、MYB类转录因子、水通道蛋白、富含脯氨酸蛋白、亲环素蛋白、ACI14蛋白、转脂蛋白等抗病相关基因,涉及到植物的信号转导,胁迫诱导,防卫反应等方面。这些EST序列为利用中国野生华东葡萄进行抗白粉病育种研究和利用提供了有价值的抗病基因片段,为丰富世界葡萄属植物抗白粉病基因提供序列数据。     

抑制性消减杂交分离苹果缺铁诱导的相关基因

以铁高效基因型植物———苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et J iang) 为材料, 利用抑制性消减杂交( SSH) 方法, 成功构建了小金海棠缺铁条件下的消减cDNA文库。该文库包含1 152个克隆, 通过PCR检测插入片段大小在300～1 000 bp之间。对构建的消减cDNA文库进行差异筛选, 得到差异表达片段( ESTs) 105个。GenBank上BLAST结果如下: 50个ESTs与其它物种同源性较高, 视为已知基因, 并根据其功能分为9个组; 32个ESTs在GenBank中无法查到对应的同源序列, 可能代表了新基因;另外23个是与已知ESTs重复的基因片段。     

Construction of lymphocyte subtracted cDNA library of unstable angina

AIM:To construct a subtracted cDNA library of differentially expressed genes in human unstable angina lymphocytes.METHODS:Suppression subtractive hybridizations (SSH) were performed between the patients with unstable angina pectoris and stable angina pectoris. Lymphocyte RNA, the obtained forward and reverse cDNA fragments were directly inserted into T/A cloning vector and transformed into E.coli JM 109 to construct a subtractive cDNA library. The inserting fragments were screened by blue and while blot screening and bacterium liqulid PCR.RESULTS:Each subtractive cDNA library contained more than 2000 positive bacteria clones. Most of them distributed between 200-600 bp inserts.CONCLUSION:The library is efficient and lays solid foundation for screening and cloning new and specific expressed genes in unstable angina lymphocyte RNA.     

黄瓜多抗自交系NC-46转基因不定根的高频诱导及其cDNA文库的构建

利用发根农杆菌K599（带有质粒pBIN-35S-GFP）,以具有抗爪哇根结线虫和花生根结线虫等多种抗性基因的黄瓜自交系NC-46离体子叶为外植体,高效诱导出转基因不定根（诱导率达76.7 %）;并在此基础上成功构建了转基因不定根的cDNA文库。构建的cDNA文库重组率为98.3%,原始库容量达2.02 × 106 cfu,其中基因的完整性比率为47.6%,Unigene比例为66.7%。选用转基因不定根构建根的cDNA文库,克服了实生苗难以获得大量均一状态根的缺陷;克服了实生苗根受到土壤根际微生物、线虫等对根生理状态的影响以及对提取RNA的污染问题;利用改良的Smart cDNA文库构建法,获得的文库克隆含有完整的5′端非翻译区的全长cDNA;此外,构建的文库由于利用改良的pUC19载体替代了λTripIEx2噬菌体载体,获得的克隆无需再将插入到噬菌体载体上的cDNA转染到质粒载体,可直接用于杂交和测序筛选,因此在基因克隆筛选时更加方便。