家蚕γ-谷氨酰转肽酶和谷胱甘肽的研究

膜结合的γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP),广泛地分布于家蚕的中肠、马氏管、脂防体、体壁、后丝腺和脑组织中,马氏管和中肠的酶活力较高.产丝量较高的品种苏6×苏5,中肠γ-GTP活力也较高,各品种中肠γ-GTP活力峰均在5龄中期.大部分必需氨基酸是该酶很好的氨基酸受体,但谷氨酰胺等几种氨基酸明显抑制该酶活力.蚕中肠组织的GSH含量变化与γ-GTP活力变化有关.γ-GTP活力较高的苏6×苏5品种,其中肠GSH浓度也较高.以上结果反映出,家蚕中肠γ-GTP和GSH在吸收氨基酸,尤其是必需氨基酸中起重要作用.     

对乙酰氨基酚在家蚕体内的糖基化代谢特点和对组织的损伤作用

以临床解热镇痛药基本成分对乙酰氨基酚(APAP)为模药,调查APAP在家蚕体内的代谢和对蚕体主要组织(系统)的损伤以及蚕体主要解毒酶基因的表达变化,探讨家蚕作为肝毒性药物毒理研究替代实验动物的可能性。家蚕5龄2 d幼虫经口给予APAP后0.5 h,在消化管、脂肪体和血淋巴中均能够检测到原药,APAP主要糖基化解毒代谢途径中的关键酶——尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)活性也随即快速上升,其中脂肪体中的UGT酶活性上升早于血淋巴和消化管。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示,幼虫消化管和脂肪体细胞中UGT家族基因Ugt30、Ugt86和Ugt89的转录水平在给予APAP后0.5 h开始显著上调。HE染色显示,高剂量APAP对蚕体消化管和脂肪体组织具有损伤作用,但AO/PI染色未发现血淋巴中死细胞增多。研究结果表明,家蚕的消化管、脂肪体和血淋巴都有通过糖基化代谢APAP的解毒功能,过量的APAP对消化管和脂肪体组织都有损伤作用。     

家蚕γ-谷氨酰环化转移酶的纯化及其性质的研究

首次从家蚕(Bombyx mori L.)蛹体脂肪织织及真皮细胞分离得到催化丫-L-谷氨酰-2-L-氨基丁酸反应生成吡咯烷酮羧酸和2-L-氨基丁酸的Y-谷氨酰环化转移酶。并采用硫酸铵沉淀、葡聚糖G-75柱层析、DEAE-纤维素DE_(32)柱层析和羟基磷灰石柱层析等步骤,将该酶提纯了1,285倍。高度纯化后的酶,对Y-L-谷氨酰-2-L-氨基丁酸具有最适pH7.2-7.4,最适酶反应温度为47℃,米氏常数(Km)为0.04M。在分离纯化过程中未发现蚕体内有该酶的同功酶存在,纯化后的酶溶解于pH8.0、0.01M的Tris—HCl缓冲掖中,-30℃经过一个月没有发现明显的失活现象,但在4℃中一个月后丧失活性76％。     

家蚕烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶基因(BmNADK)的高温应激表达分析

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(NAD kinase,NADK)是生物体内氧化还原调节和氧化应激反应的重要酶类。以对高温耐受性不同的家蚕品种的5龄幼虫为材料,进行34℃连续高温处理和42℃高温冲击3 h处理,通过实时荧光定量PCR检测家蚕NADK基因(Bm NADK)在雌蚕和雄蚕的脂肪体、中肠、丝腺3个器官组织中的表达水平,探究该基因是否与家蚕对高温的应激反应有关。结果显示,5龄期2种高温环境胁迫均可引起Bm NADK基因在蚕体3个器官组织中上调表达,其中在脂肪体表达的上调最为显著,且雄蚕脂肪体中的上调表达明显高于雌蚕,当恢复常温环境条件时,Bm NADK基因在蚕体组织的表达量也随之下降;高温胁迫下Bm NADK基因在耐高温家蚕品种7532幼虫组织中的表达量高于对高温耐受性差的品种皓月。研究结果显示Bm NADK基因与家蚕对高温的应激反应相关,在耐高温家蚕品种及雄蚕体内的应激表达水平相对较高。     

野桑蚕和不同家蚕品系幼虫体内1-脱氧野尻霉素含量测定

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)-紫外检测法测定了野桑蚕和不同品系家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量,并调查了家蚕5龄幼虫不同组织不同生长时期1-DNJ含量的变化。野桑蚕与家蚕、家蚕不同品系间的1-DNJ含量存在极显著差异:野桑蚕全蚕粉中1-DNJ含量最高,质量分数平均为0.427 8%;家蚕以黄血蚕最低,平均0.220 5%。家蚕5龄幼虫不同组织的1-DNJ含量也存在明显差异:家蚕血干粉中的1-DNJ含量最高,质量分数达0.848 7%;其次是中肠、体壁和脂肪体组织,分别为0.512 2%、0.472 2%、0.308 5%;而在丝腺中几乎检测不出1-DNJ。家蚕5龄幼虫体内1-DNJ含量随发育时期呈明显变化,5龄第4天含量最高,达0.329%,第5天以后迅速下降。     

家蚕谷胱甘肽硫-转移酶的组织分布及发育期变化规律

为明确家蚕谷胱甘肽硫-转移酶(GSTs)的生物学信息,对家蚕不同发育阶段GSTs的变化规律、5龄幼虫主要组织及不同品种间的GSTs活性差异进行了研究。家蚕GSTs在中肠、脂肪体、血淋巴、表皮、头部等组织中都有分布,脂肪体中GSTs活性最高,其次是中肠,头部最低。各发育阶段中,在由一种虫态变为另一种虫态的初始期GSTs活性较高,以后逐渐降低。在幼虫主要组织中GSTs活性5龄第3天最高,以后逐渐下降,至吐丝前达到较低的水平。抗性较强的夏秋蚕品种的GSTs活性高于春用蚕品种,杂交种的GSTs活性高于原种。研究结果提示家蚕GSTs活性与其组织器官的生理功能、品种抵抗性等相关联。     

家蚕经菊酯类农药诱导后脂肪体蛋白的表达谱及烯醇酶基因的组织转录活性

为了从蛋白质水平探讨家蚕对菊酯类农药的抗性机制,采用双向电泳结合基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,分析家蚕5龄幼虫经氯氰菊酯诱导前后脂肪体蛋白的表达特征。采用ImageMaster6.0软件分析表明,对照组共检测到432个蛋白点,诱导实验组检测到369个蛋白点,其中能匹配的蛋白点有342对,匹配率为76.68%。对特征蛋白进行MALDI-TOF-MS分析鉴定的蛋白包括烯醇酶、线粒体醛脱氢酶、伴侣素、肌动蛋白、gag-like蛋白。烯醇酶(enolase)是糖酵解过程中极为重要的酶类。采用半定量RT-PCR对经氯氰菊酯诱导后的家蚕脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管、血液等7个组织器官的烯醇酶基因进行表达分析,结果表明,烯醇酶基因转录水平在7个组织器官中都呈现下调趋势,分别下调了13.79%、10.71%、22.48%、7.40%、27.00%、11.50%、14.52%,其中脂肪体的烯醇酶基因表达和蛋白的表达下调一致。受菊酯类农药诱导的影响,家蚕5龄幼虫脂肪体蛋白的数目减少,烯醇酶基因在各组织器官减量表达,提示可能与蚕体的基础生理代谢受到抑制有关。     

一种适于研究家蚕色素代谢的眠蚕体壁组织培养方法与黑色素合成抑制试验

利用家蚕幼虫眠时形成新表皮以及重新合成黑色素分布于新表皮上形成固有体色斑纹等特点,用4龄入眠后的家蚕幼虫体壁组织为材料,观察离体培养体壁的色素代谢变化,探索适宜的家蚕幼虫体壁培养基及培养温度条件,眠蚕体壁的取材方法及取材时间,色素代谢观察的外观标志性状等。实验结果表明:含10%优等胎牛血清的Grace培养基适于家蚕幼虫体壁组织培养,培养温度为26℃;取4龄期入眠11～12 h后剥去旧表皮的体壁组织更容易观察色素代谢的外观性状变化;体壁培养24 h后,刚毛再生和色素沉积是易于观察的色素代谢变化标志性状。通过对家蚕4龄眠蚕离体培养体壁组织的黑色素合成抑制试验,观察到体壁外观性状变化,证明酪氨酸羟化酶催化酪氨酸转化成多巴是家蚕黑色素合成代谢途径中的一个重要环节。     

家蚕5龄幼虫蛋白质代谢研究初探

家蚕幼虫5龄期间蛋白质含量的变化约为体重变化的3倍,整个蚕体的蛋白质含量在第3和第4天之间有一个明显的突增。分析相应的蛋白水解酶活力变化,发现酶活力呈现先升后降的变化趋势,在第4和第5天时活力达到峰值。进一步提取血液、消化液以及脂肪体蛋白水解酶进行研究,结果表明血液和消化液蛋白水解酶的活力变化与蚕体消化、吸收和转化桑叶蛋白的生理进程基本一致。     

家蚕和蓖麻蚕体内的乳酸脱氢酶及昆虫激素对该酶的调控作用

本文研究了家蚕和蓖麻蚕体内的乳酸脱氢酶(LDH),探讨了不同发育阶段和不同组织内LDH的含量,活力和同工酶区带的变化。结果表明:(1)家蚕和蓖麻蚕体内均存在LDH,后者的含量均高于前者。家蚕幼虫期的LDH有三条区带,而蓖麻蚕仅有一条。(2)家蚕体内的LDH以脂肪体中含量最高,肠壁组织次之,血淋巴中仅见痕量。(3)昆虫保幼激素类似物(JHA)和β—蜕皮素对蚕体内的LDH有明显的调控作用。以ZR515和ZR512处理家蚕和蓖麻蚕,均能不同程度地提高LDH的活力。还对蚕体内LDH活力的变化与其生理功能的关系、以及两种昆虫激素对该酶的调控作用的意义进行了讨论。     

杀虫剂辛硫磷诱导家蚕脂肪体蛋白的表达特征及SerB基因的组织转录活性分析

为了从蛋白质水平探讨家蚕对有机磷杀虫剂的抗性机制,采用双向电泳结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术,分析家蚕5龄中期幼虫在添食杀虫剂辛硫磷前后脂肪体蛋白的表达特征。经ImageMaster6.0软件分析表明,对照组共检测到465个蛋白点,实验组检测到396个蛋白点,其中能匹配的蛋白点有348对,匹配率为73.54%。对特征蛋白进行质谱分析,已鉴定的蛋白包括磷酸丝氨酸转氨酶(SerB)和5'-甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。采用半定量RT-PCR分析家蚕5龄幼虫添食辛硫磷后脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管等6个组织器官中SerB基因mRNA的转录水平,结果与对照组相比均呈现上调趋势,其中在脑组织的转录水平上调尤为明显,在脂肪体中的转录水平上调与其蛋白的表达上调一致。受辛硫磷诱导的影响,家蚕5龄中期幼虫脂肪体的蛋白数目减少,SerB基因在各组织器官增量表达,推测可能与蚕体对农药的代谢解毒作用有关。     

家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。     

蜕皮激素诱导家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的表达变化

昆虫蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)是一种核内受体,为蜕皮激素的分子靶标。用0.002 g/L蜕皮激素溶液浸泡过的桑叶饲喂家蚕5龄幼虫,采用双跟踪标定定量PCR(dual-spike-in qPCR)方法,检测家蚕蜕皮激素受体基因BmEcR-A、BmEcR-B1和超气门蛋白(ultraspiracle,USP)基因BmUSP在家蚕幼虫马氏管、脂肪体、中肠组织的转录水平变化,分析蚕体组织以及BmEcR和BmUSP基因在蜕皮激素代谢过程中的作用与表达调控特征。结果表明:家蚕EcR的2种同工型基因BmEcR-A和BmEcR-B1的mRNA转录水平均变化显著,在脂肪体中的转录水平最高,其它组织相对较低;BmUSP的mRNA转录水平同样变化显著,且在脂肪体中的转录水平最高,马氏管次之,中肠最低。另检测正常情况下4龄眠期和5龄末期BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP的mRNA转录水平相对于其它发育时期较高,且脂肪体中的转录水平要明显高于其它组织。BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP均在家蚕幼虫脂肪体中高水平表达,表明了脂肪体在蜕皮激素代谢过程中的重要性。     

家蚕质型多角体病毒感染应答的假定蛋白基因全长cDNA克隆与表达特征分析

在感染家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个差异表达的假定蛋白基因。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该假定蛋白基因的全长cDNA。用生物信息学方法进行基因序列与结构分析表明:该基因全长cDNA序列为486bp,包含108bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和153bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR),开放阅读框(ORF)为225bp,编码74个氨基酸,蛋白分子质量为6.888kD,等电点为5.27;该基因由3个外显子和2个内含子组成,ORF位于第2外显子内,编码蛋白含二次跨膜结构,多肽链表现为疏水性,在多肽链上的第15～16氨基酸残基可能是信号肽的切割位点。RT-PCR结果显示该基因在家蚕5龄幼虫的丝腺、血液、脂肪体、生殖腺及中肠组织中均有表达;荧光定量PCR结果表明该基因在感染Bm-CPV的家蚕中肠组织中的表达水平为正常家蚕中肠组织的6.28倍。研究结果为进一步解析该基因的功能奠定了基础。     

野桑蚕CYP305BlVl基因的组织表达特异性初探

抽提不同处理的野桑蚕各组织总mRNA，利用地高辛标记的野桑蚕CYP305BlVl的cDNA基因作为探针，通过点杂交方法研究野桑蚕CYP305lBl基因的组织表达特异性。实验结果显示，CYP305BlVl基因在氟化物诱导后的野桑蚕中肠、脂肪体、马氏管、体壁中有特异性转录。     

家蚕细胞色素P450基因CYP9A22的克隆及在中肠和脂肪体的诱导转录

细胞色素P450对昆虫的生长发育、环境适应性以及抗药性具有重要作用。为了探讨氯氰菊酯对家蚕(Bombyxmori)细胞色素P450基因转录的诱导作用,采用RT-PCR技术和cDNA末端快速扩增(RACE)策略,从家蚕5龄幼虫克隆到细胞色素P450基因CYP9A22(GenBank登录号:EF535804)。CYP9A22基因的cDNA编码区长1 596 bp,编码531个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为61 kD,等电点为7.71。将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,有9个内含子;与已知的CYP9家族的棉铃虫(Helicoverpa armigera)CYP9A14基因的相应氨基酸同源性达到62.3%。用半定量RT-PCR方法分析氯氰菊酯诱导家蚕CYP9A22表达水平,结果表明:CYP9A22的mRNA转录表达具有组织特异性,在中肠的表达量高于脂肪体;氯氰菊酯诱导家蚕24 h,在其脂肪体的表达量是未诱导家蚕脂肪体的3.1倍,初步推测CYP9A22的过量表达可能与抗药性有一定关系。