PEG介导gus基因转化西瓜枯萎病菌

为进一步研究西瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌西瓜专化型的致病机理,以西瓜枯萎病菌GY16为受体菌株,优化了其原生质体的制备条件,通过PEG介导进行hph和gus基因的共转化,并对转化子生物学特性以及转化子中gus基因表达活性进行研究。结果表明:以0.8 mol/L的NaCl为渗透压稳定剂,10 mg/ml溶壁酶酶解3 h可以释放出1 ml 2.48×108个原生质体,两个基因共转入受体菌株的效率为40%以上。对转化子进行gus基因PCR检测和活性表达检测,检测结果显示该基因已转进西瓜枯萎病菌基因组中,并能在转化菌株中表达。在PSA培养基上继代培养7代后,所有转化子仍能稳定表达gus。接种西瓜植株后,通过染色观察可以清晰地观察到转化子对不同抗性西瓜品种的侵染差异。     

玫烟色棒束孢IfB01菌株原生质体制备与转化条件研究

为了提高虫生真菌玫烟色棒束孢If B01原生质体的产量和转化效率,进而为该菌株的基因工程和细胞工程改良奠定基础,本文研究了不同细胞壁降解酶配比、渗透压稳定剂、酶解温度、时间、p H值和转速等对玫烟色棒束孢If B01原生质体制备以及不同聚乙二醇4000(PEG4000)浓度对原生质体转化的影响。结果显示,培养30 h的菌丝用1%蜗牛酶+2%纤维素酶配比、以0.7 mol/L的Na Cl溶液(p H6.0)为渗透压稳定剂,30℃、100 r/min酶解8 h,获得的原生质体产量最高,达6.72×106个/m L;此原生质体在40%的PEG4000作用下可获得最高的转化效率,达7.05%。研究表明酶液、酶解温度、时间、p H值、渗透压、稳定剂、转速和PEG4000的浓度等因素对原生质体的制备和转化有较大影响。     

PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola原生质体转化

为建立PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola的遗传转化体系,以果生刺盘孢SQ06-E的幼嫩菌丝为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素标记的质粒pCB1003转入果生刺盘孢菌丝的原生质体中;对获得的转化子进行遗传稳定性检测、PCR检测和Southern杂交分析。试验获得果生刺盘孢的最优转化体系为:密度为1×106 mL-1分生孢子在M3S培养基中,28℃、200r/min震荡培养8h;过滤收集菌丝,在质量浓度为0.25g/mL崩溃酶+0.05g/mL溶壁酶的10mL酶解液中加入0.5g湿菌体酶解3h;整个试验的渗透压稳定剂为0.8mol/L KCl。试验共得到76个转化子,转化率为1μg DNA获得3~4个转化子。对转化子的PCR检测和Southern杂交分析都表明hph基因已整合入果生刺盘孢的基因组中。所有转化子在PDA培养基上继代5次后仍能正常生长,说明外源基因hph能在果生刺盘孢中稳定遗传。     

梨炭疽病菌原生质体遗传转化体系的建立及GFP标记菌株的获得

为建立梨炭疽病菌的原生质体遗传转化体系,以梨炭疽病菌菌株II-17为供试菌株,研究了菌龄、酶解液组合及酶解时间等对梨炭疽病菌原生质体制备的影响。结果表明,制备梨炭疽病菌原生质体的适宜条件为:CM液体培养基培养分生孢子24 h后,再转接到新的CM液体培养基中培养24 h,获得新鲜的菌丝;最适酶解液组合为9.0 mg/ml裂解酶+1.0 mg/ml崩溃酶+1.0 mg/ml蜗牛酶;酶解时间为2.5~3.0 h时酶解效率最高。对获得的转化子进行PCR鉴定和荧光观察,结果表明,GFP标记基因已成功整合到梨炭疽病菌的基因组中,转化子发出强烈的绿色荧光且遗传性稳定。致病性测定结果表明,转化子致病性与野生型菌株无明显差别,成功获得了梨炭疽病菌的GFP标记菌株。     

苹果腐烂病菌原生质体制备与再生条件优化

大量高质量且能再生的原生质体是真菌遗传转化、基因修饰的重要保证。本试验选用苹果腐烂病菌强致病力菌株SDAU11-175,从酶种类、菌丝年龄、酶解时间、渗透压稳定剂及再生培养基五个方面对原生质体制备及再生条件进行了优化。结果显示:获得苹果腐烂病菌原生质体最大产量的条件是菌丝年龄54 h、3%崩溃酶和3%裂解酶组合、0.7 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂、28℃酶解3 h,所得原生质体在YPS培养基上再生效果最好,再生率可达42.21%。     

玉米大斑病菌原生质体的制备

以玉米大斑病菌(Exserohilum turcium)菌株9948N为供试菌株，进行了原生质体制备条件的研究。主要探讨了酶、渗透压稳定剂、温度、时间等条件对原生质体产出率的影响。结果表明玉米大斑病菌原生质体制备的适宜条件是：28℃下以10mg／mL纤维素酶 10mg／mL蜗牛酶的混合酶处理经过研磨的菌体，酶解72h，以0．8mol/L甘露醇做渗透压稳定剂。     

水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化

为获得进行水稻纹枯病菌遗传转化所需的高质量原生质体,选用该病菌强致病力菌株GD-118,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。结果表明:优化后的水稻纹枯病菌原生质体制备的最佳条件组合是"纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶"组合酶、总酶终质量浓度10mg/mL、菌丝菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4.7H2O为渗透压稳定剂,此最佳条件组合所制备的原生质体产率高达4.00×107/g;原生质体最佳的再生条件是酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上26℃时进行培养,在此条件下可获得最佳的再生效果,再生率为39%。     

冬虫夏草无性型菌丝体的原生质体制备条件研究

以冬虫夏草无性型中国被毛孢为原材料,通过液体培养获得菌丝体,经酶解处理后在不同条件下获得原生质体,以研究酶的种类及浓度、渗透压稳定剂及浓度、酶液pH值以及酶解时间等不同因素对中国被毛孢原生质体制备的影响。结果显示,中国被毛孢菌株原生质体的最佳制备条件为:使用浓度配比分别为4和3 mg·mL-1的Yatalase和Glucanex酶,在1.0 mol·L-1KCl作为渗透压稳定剂,酶液pH值为6,酶解3 h,所得原生质体量最多。     

偏肿革裥菌 MnP基因在构巢曲霉中转化方法的建立1）

对已经构建好的携带有白腐菌偏肿革裥菌（Lenzites gibbosa）锰过氧化物酶完整编码序列基因的载体质粒pMDTM18-T/Lg-mnp、以及整合型表达载体质粒pLB01分别双酶切,然后进行连接构建了重组质粒pLB01/Lg-mnp。对构巢曲霉（Aspergillus nidulans）尿嘧啶尿苷营养缺陷体菌株TN02A7进行了制备分生孢子原生质体酶解方法的摸索。结果表明：将溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶3种酶以1∶1∶1的比例混合,能有效地使构巢曲霉的分生孢子形成原生质体。采用PEG/CaCl2介导的原生质体转化方法成功地将L．gibbosa的MnP基因转入到了构巢曲霉中,获得了携带有白腐菌基因的构巢曲霉转化子菌株。     

草菇原生质体制备、再生及转化研究

用酶解法对草菇原生质体制备及再生条件进行了研究.结果表明: 液体静置培养4 d的菌丝,以0.6 mol/L的甘露醇作渗透压稳定剂,溶壁酶质量浓度15 mg/mL,34 ℃下酶解3 h,原生质体制备率最高;草菇原生质体预培养16 h后涂布在再生培养基上,再生率最高.同时,采用PEG法将潮霉素抗性基因转入草菇的原生质体中,经过抗性筛选,得到了具有潮霉素抗性的草菇转化子.