植物SnRK2基因家族的研究进展

蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)是一类在植物中普遍存在的蛋白激酶，属于Ser/Thr类蛋白激酶，在多种信号转导中均能发挥作用。为了研究SnRK2蛋白激酶在植物抗逆中的作用，分析了SnRK2基因家族的特点及研究历程，归纳了SnRK2基因在调控植物叶片气孔孔径，响应干旱胁迫、盐胁迫以及响应种子萌发和发育等方面的功能，指出SnRK2基因在多种信号转导中均能发挥作用，可以有效提高植物的抗逆能力。SnRK2基因在种子萌发和发育过程中具有重要意义，本研究为今后SnRK2分子机理研究和植物品种培育提供了参考依据。     

苹果SnRK2基因家族的鉴定和生物信息学分析

SnRK2（蔗糖非发酵1型相关蛋白激酶2）是植物特有的一类Ser/Thr 类蛋白激酶,参与植物体内多种信号途径的转导,在植物逆境生理过程中扮演了重要的角色。本文利用隐马可夫模型搜索和系统建树的方法,在苹果基因组中鉴定出了16个SnRK2基因家族成员,然后从系统发生、理化性质、二级结构、motif、C末端序列和EST等方面对其进行了预测和分析,并分析了苹果与拟南芥、水稻、玉米等的SnRK2基因家族之间的关系。结果表明,苹果中鉴定的基因与拟南芥、水稻、玉米所有的SnRK2蛋白一起分成了3个亚族。系统发生、motif和C末端序列分析表明,苹果SnRK2蛋白激酶家族具有较高的保守性。本研究为苹果SnRK2基因家族生物学功能的研究奠定了生物信息基础。     

植物SnRK2基因家族研究进展

蔗糖非依赖1蛋白激酶2(SnRK2)激酶家族,是众多应答渗透压胁迫的蛋白激酶家族之一。本综述主要介绍了SnRK2蛋白激酶家族的研究进展,包括分子结构、活性调控、下游的靶标基因及其生理学功能等。总结了近年来Sn RK在联系植物中特有的代谢和胁迫应答、调控ABA和SOS信号转导途径及ABA依赖的植物生长等方面研究所取得的进展,试图为深入开展植物环境胁迫机制研究提供参考。     

拟南芥蛋白激酶SnRK1.1的激酶活性分析

本研究分别纯化了细菌内的蛋白激酶SnRK1.1融合蛋白和拟南芥中的蛋白激酶SnRK1.1蛋白,使用合成的SP11多肽片段作为底物,通过体外激酶试验结合放射性同位素γ32P检测了SnRK1.1蛋白对底物SP11的磷酸化活性。与GST蛋白相比,GST-SnRK1.1融合蛋白能够显著磷酸化底物SP11多肽片段;与野生型Col-0纯化产物相比,从转基因拟南芥中免疫沉淀得到的GFP-SnRK1.1蛋白也能够显著磷酸化底物SP11多肽片段。最终,本研究成功建立了蛋白激酶SnRK1.1的体外磷酸化检测体系,为深入研究SnRK1.1的功能及其SnRKs家族成员参与调控的信号通路奠定了基础。     

甘蓝型油菜SnRK基因家族生物信息学分析及其与种子含油量的关系

蔗糖非发酵相关蛋白激酶(sucrose non-fermenting-1-related protein kinase,SnRK)是植物中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它们参与调控植物的信号传导、逆境响应和种子生长等生物学过程。为了解析甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中SnRK基因家族的性质及其对种子含油量的影响,本研究对BnSnRK基因家族的系统进化、基因结构、蛋白质理化性质、保守基序、蛋白质二级结构、顺式作用元件和亚细胞定位预测等进行分析,并通过候选基因关联分析、单倍型分析和qRT-PCR筛选影响种子含油量的BnSnRK基因。结果显示,鉴定得到92个BnSnRK成员,分为3个亚族,分布于甘蓝型油菜19条染色体上,亚族之间蛋白质理化性质差异显著。多数基因拥有7~14个外显子;同一亚族的motif分布情况更相似。BnSnRK家族主要在细胞质中表达,蛋白质二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主。关联分析筛选出与油菜种子含油量相关的12个家族成员,基因BnaC02g10730D可能负向调控甘蓝型油菜种子含油量,基因BnaA07g12290D、BnaA10g22850D、BnaA08g18050D、BnaC04g44390D可能正向调控甘蓝型油菜种子含油量。不同环境之间种子含油量差异显著,且与含油量相关的12个成员均含有MYB、MYC和ABA响应元件,环境特异的含油量关联基因可能与植物非生物胁迫响应相关。本研究为BnSnRK基因功能验证及育种工作提供了理论参考。     

三个胡杨SnRK基因的克隆和序列分析

蔗糖非依赖1蛋白激酶(sucrose non-fermenting-1-related protein kinase,Sn RK)是广泛存在于植物中的一类Ser/Thr蛋白激酶,参与各种胁迫信号传导通路,对植物抵御不良环境起到重要作用。本研究根据胡杨转录组测序结果克隆出了三条Sn RK基因,进行序列对比和系统进化分析预测其基因功能。结果显示这三个胡杨Sn RK基因属于Sn RK2家族成员,三个胡杨Sn RK基因又与AtSnRK2.2、AtSnRK2.3、AtSnRK2.6序列相似性较高,可能在逆境应答过程中具有重要功能。胡杨Sn RK的功能预测和分析,将为进一步研究林木非生物逆境胁迫响应机制奠定基础。     

拟南芥蛋白激酶SnRK1.1对转录因子FD的磷酸化分析

为了获得纯化的SnRK1.1与FD蛋白,分析蛋白激酶SnRK1.1是否能够磷酸化开花调控途径中的转录因子FD,成功克隆了1 608 bp的SnRK1.1基因以及858 bp的FD与FD-T282A基因,分别与PGEX-4T-3载体连接,获得原核表达载体GST-SnRK1.1、GST-FD和GST-FD-T282A,并分别转化大肠杆菌BL21菌株;SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色(CBB)表明,0.5 mmol/L IPTG能够成功诱导出GST-SnRK1.1、GST-FD和GST-FD-T282A蛋白。利用GST纯化介质纯化获得了84 k Da的GST-SnRK1.1蛋白以及58 k Da的GST-FD与GST-FD-T282A融合蛋白;利用体外磷酸化体系证实SnRK1.1能够磷酸化FD,不能磷酸化突变的FD-T282A。研究结果为进一步解析SnRK1.1通过磷酸化转录因子FD参与开花途径调控的机制奠定了良好的基础。     

小桐子SnRK2基因家族的全基因组鉴定及特征分析

蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶2(sucrose non-fermenting-1 related protein kinase 2,Sn RK2)属植物特有的一类Ser/Thr类蛋白激酶,参与植物体内多种信号转导途径及逆境胁迫的应答。基于小桐子基因组数据,利用生物信息学的方法鉴定到7个小桐子Sn RK2基因家族成员,并对其从系统进化、理化性质、基因结构及顺式作用元件等进行了分析。结果表明,小桐子Sn RK2基因在进化上较为保守,并聚类为3个亚家族。基因结构包含9~10个外显子,编码的蛋白序列都鉴定到典型的激酶结构域以及C末端酸性补丁区域。同时,在Sn RK2基因上游调控区域都鉴定到多个激素与逆境应答元件。表达分析显示,Sn RK2.1、Sn RK2.2在低温处理下上调表达显著,经过干旱处理,7个小桐子Sn RK2基因在叶中都上调表达,而Sn RK2.1、Sn RK2.2、Sn RK2.5上调表达量达到极显著水平(p0.01)。本研究为进一步的克隆小桐子Sn RK2基因以及研究其在信号转导与激素、逆境应答中的功能提供了参考。     

木薯蛋白激酶MeSnRK2.12与转录因子MebHLH1的互作鉴定及其表达分析

蛋白激酶SnRK2s (Sucrose Non-fermenting Related Protein Kinase 2)是植物抗逆境机制中的关键组分。木薯是全球重要的食品和工业作物,具有高淀粉累积和耐逆境的特点。迄今对木薯MeSnRK2家族成员参与逆境下淀粉合成调控的内在机制尚不清楚。本文围绕SnRK2家族受ABA微弱诱导的成员MeSnRK2.12展开研究,先对其进行生物信息学分析后发现其启动子区分布逆境响应元件:干旱胁迫MBS和ABA应答ABRE等顺式作用元件,且其氨基酸序列与AtSnRK2.8和OsSAPK1/2高度同源。ABA和PEG6000处理木薯SC8植株后发现, MeSnRK2.12可以在2 h内快速响应ABA和PEG6000处理,其转录活性在根中被抑制;在茎中被诱导上调,最高值分别为对照的15.0倍和8.0倍;在叶中也呈现上调趋势,但程度低于茎中。亚细胞定位试验结果显示MeSnRK2.12分布于细胞质和细胞核,利用酵母双杂交和双分子荧光互补(BiFC)试验均验证了MeSnRK2.12和转录因子MebHLH1间存在互作,且前期研究发现MebHLH1可以上调木薯蔗糖合酶基因M...     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

甜菜BvM14-STPK蛋白激酶互作蛋白的鉴定及筛选

为进一步探究BvM14-STPK蛋白激酶在甜菜中应答盐胁迫的信号途径,本研究对BvM14-STPK蛋白激酶进行了互作蛋白的鉴定及筛选。使用转基因技术获得转基因烟草,使用亲和纯化串联质谱技术鉴定蛋白复合物,通过搜索烟草蛋白质数据库,获得BvM14-STPK蛋白激酶的候选互作蛋白;使用实验室甜菜M14品系盐胁迫转录组数据,对得到的互作蛋白的编码基因进行盐胁迫下的转录水平分析。结果表明,在烟草数据库中,非盐处理条件下获得3个BvM14-STPK蛋白候选互作蛋白质,盐处理条件下获得6个候选互作蛋白质;经过盐胁迫转录组数据分析,发现有4个互作蛋白编码基因在不同的组织部位、不同的盐浓度条件下应答盐胁迫。为后续进一步在植物体内验证BvM14-STPK蛋白激酶与候选互作蛋白的相互作用及甜菜抗盐机理奠定良好的基础。     

对虾白斑综合症病毒(WSSV)蛋白激酶wsv083的初步研究

为探讨VP19和VP28是否由蛋白激酶wsv083催化发生磷酸化,将wsv083、VP19和VP28分别进行原核表达。将wsv083蛋白、wsv083表达菌株的裂解液上清以及去磷酸化的wsv083蛋白分别和2种膜蛋白相互作用,以及将wsv083、VP19和VP28的表达质粒共转化至同一菌株中进行表达。结果均未能发现VP19和VP28被磷酸化,但发现wsv083蛋白自身具有苏氨酸和酪氨酸磷酸化的现象。改变wsv083表达质粒,wsv083蛋白同样出现了磷酸化现象。而在将wsv083的序列改变使其失去激酶活性后,表达出的wsv083蛋白不再具有磷酸化的现象。因此认为VP19和VP28的磷酸化不是由wsv083催化产生,wsv083能够自我磷酸化。     

抗小麦黄矮病相关蛋白激酶TiDPK1与BYDV外壳蛋白的互作

小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)引起的小麦重要病毒病。分离于小麦–中间偃麦草易位系的蛋白激酶编码基因TiDPK1, 是一个抗小麦黄矮病相关基因。本文报道利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术对TiDPK1与BYDV外壳蛋白(coat protein, CP)互作的研究结果。酵母双杂交分析结果表明, TiDPK1能够与BYDV-GAV、-PAV株系的CP互作, 双分子荧光互补分析结果进一步表明, TiDPK1可与BYDV的CP互作、产生双分子荧光互补信号, 说明TiDPK1确可与BYDV CP相互作用, 该结果对了解TiDPK1在小麦抗BYDV反应机制具有一定意义。     

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR以及其他分子生物学方法，以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对MLPK基因进行扩增克隆，首次得到长度分别为1615bp和1294bp的基因片段。序列分析表明，甘蓝MLPK与芜菁MLPK的cDNA序列相似性达98％，前者的内含子数为4个，比后者少了3个；同时，在前者内含子中发现了不同于典型的GU—AG规则的新的序列，即第3、4个内含子5，端碱基是TA、CG，3′端碱基为CAGG、GT，推测甘蓝MLPK的mRNA具有独特的剪切机制。这为甘蓝自交不亲和分子机理研究提供了新内容。     

酿酒酵母蛋白激酶Tos3在氧化胁迫应答中的作用

旨在研究TOS3蛋白激酶在酿酒酵母细胞氧化胁迫应答信号通路中的作用。通过PCR扩增得到TOS3基因的蛋白质编码序列片段,将其克隆到pYES2/NTA上构建pYES2/NTA-TOS3质粒上,用构建好pYES2/NTA-TOS3质粒转化酵母菌细胞得到相应酵母菌株细胞,此细胞即为TOS3过量表达细胞。诱导此酵母细胞过量表达带His6标签TOS3蛋白激酶,免疫印迹方法鉴定过表达的蛋白激酶。最后,用H2O2处理TOS3过量表达细胞、TOS3缺失突变体细胞、野生型细胞、转入空载的野生型细胞。结果表明：4种细胞在未处理条件下生长状态无明显差异;在H2O2处理后,野生型细胞在125倍稀释生长点上比TOS3突变体细胞生长状态略好,而TOS3过量表达细胞与转入空载的野生型对照细胞和野生型细胞对比均显示出TOS3过量表达细胞的生长状态较好。野生型细胞对H2O2胁迫的耐受性比TOS3突变体细胞略强;过量表达TOS3蛋白的细胞对H2O2胁迫耐受性比野生型增加;说明TOS3在酵母细胞氧化胁迫应答过程中起正调控作用。     

采用花粉管通道法将蛋白激酶基因导入玉米自交系的研究

通过花粉管通道法将ZmPtil,ZmPtil-1,ZmCIPK2三种蛋白激酶基因植物表达载体分别导入玉米自交系吉444,经草丁膦筛选后得40株抗性植株,通过PCR检测其中28株为PCR阳性植株,平均转化率为1.33％,最后收获11株转基因植株.干旱条件下通过对转基因T1植株的单株籽粒产量、千粒重两个指标进行差异显著性和...     

一个棉花类受体蛋白激酶基因的克隆与表达分析

 利用简并引物扩增、染色体步移以及RT-PCR的方法,分离了棉花的一个类受体蛋白激酶基因的全长序列。序列分析表明,该基因没有内含子,开放读码框的长度为2964 bp,编码的多肽序列含有988个氨基酸并与拟南芥控制花器官脱落的基因HAESA-like2具有60%左右的相似性,将该基因命名为GRLK5。半定量RT-PCR分析发现GRLK5在种子、茎皮、根和纤维中的表达量较高,并且受ABA的诱导表达。将GRLK5整合到植物表达载体pCAMBIA2301中,构建植物过量表达载体,通过农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR检测证明目的基因已经整合到烟草基因组中。