牛白血病病毒反转录酶的理化及生物学特性

采用外源法及内源法对牛白血病病毒反转录酶(BLV-RT)的理化及生物学特性进行了探讨。结果表明;纯化的BLV-RT对病毒RNA和细胞RNA没有模板特异性;对细胞DNA和poly(dA)。oligo(dT)12-18仅有较低的亲和性;以poly(A)。oligo(dT)_(12-18)为模板引物时酶活性最高。BLV-RT对热不稳定;酶作用的最适pH为8.3;在内源性反应中。Mn~( )和Mg~( )对酶活性均有促进作用;高浓度K 及放线菌素D对BLV-RT有抑制作用;无机磷酸盐列酶活性影响不大。     

牛白血病病毒反转录酶的纯化及结构的研究

将FLK/BLV培养上清经差速和梯度离心提纯的牛白血病病毒(BLV).经NP-40裂解后.分别采用Poly(A)·oligo(dT)_(12_18_)纤维素.Poly(G)-DEAE-纤维素和Poly(G)-磷酸纤维素等亲和层析法纯化了BLV反转录酶(RT)及前体.酶活性回收率分别为16.6％、3.34％和38.6％。经Cs-930凝胶扫描分析,酶制剂中RT的相对百分含量分别为53.9％、67.5％.实验表明,Poly(G)-磷酸纤维素层析是提纯BLV-RT的有效方法;用DEAE-纤维素和肝素-琼脂糖层析法不能提纯BLV-RT.提纯的酶制剂经SDS-PAGE分析,测得RT分子量为69.6kd(P69.6).发现了酶的前体蛋白.其分子量为95kd(P95)同时还发现有一条分子置为15kd(P15)的多肽区带,推测为BLV该酸内切酶结构的一部分。     

柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍法从孢子化7h的卵囊中提取总RNA，链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA与E再用oligo(dT)n-纤维素从总RNA中分离mRNA。mRNA以Not Iolig(dT)15作第一链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA用Ecor I Aaptors的连接后，经Not I酶切，再与EcoR I和Not I预切好的λ载体连拉，构建成鸡球虫cDNA文库。     

地方流行性牛白血病病毒对绵羊胎肺细胞继代及鉴定

地方流行性牛白血病病毒(BLV)感染绵羊胎肺细胞已至第65代。在传代过程中,与国外带毒细胞株——FLK/BLV(下称国外株)进行了多项对比试验。结果,除对裸鼠致癌性有明显不同外,其余各项试验结果均与国外株一致:电镜下见有BLVC型病毒粒子、有较好的抗原性、200个细胞即可感染绵羊、在指示细胞中能形成合胞体和有明显的BLV逆转录酶活性。     

猪瘟病毒国内分离株(HL-LY)E2基因的克隆及序列分析

用猪肾细胞（pK-15)繁殖猪瘟病毒（CSFV）分离株HL－LY，根据基因库已发表的CSFV E2基因序列，设计并合成一对引物，以CSFV总RNA为模板，通过RT－PCR技术扩增出约1.1kb的片段，即E2基因。将RT－PCR产物克隆到pMD18-T载体上，构建了重组质粒T－E2，经酶切、PCR鉴定和序列测定，表明均已成功获得了CSFV E2基因的重组体T－E2。将该测序结果与国内几个毒株SHIMEN，C，C－V－LZ,GS-LT,GS-LX德育了列同源性比较，核苷酸同源性分别为96.59%,96.005,88.495,78.24%,77.82%；氨基酸同源性分别为99.46%,98.39%,93.54%,90.70%,90.44%。表明该毒株与国内标准毒株SHIMEN株和C株具有较高的同源性。     

T、B淋巴细胞功能对流行性牛白血病发生发展的影响

本文回顾了T、B淋巴细胞功能与牛白血病发生发展的相关性。阐明了感染BLV牛B细胞淋巴瘤细胞除了来源于Bla(CD5^ CD11b^ )细胞，也可来源于B1b(CD5^-CD11b^ )及常规B2（CD5^-CD11b^-)细胞。探讨了T细胞功能对牛白血病的发生发展的影响，指出IL－12表达下降和IL－10表达增加可能导致了B细胞淋巴肉瘤的形成，Ⅰ型和Ⅱ型细胞因子的不平衡引起了BLV的发展。同时讨论了B－T细胞的相互作用在BLV感染时疾病阶段性发展过程中的作用。     

肉雏鸡肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶mRNA表达产物的RT—PCR检测

细胞谷胱甘肽过氧化物酶（cGPX)是动物体内一种重要的抗氧化酶。建立了利用RT－PCR并以β－肌动蛋白（β-Actin)为内参照定量cGPX mRNA表达的方法。提取肉鸡肝总RNA，经反转录和PCR扩增，PCR产物的电泳条带于VDS摄像系统扫描灰度。寻求PCR线性扩增范围，确定PT－PCR的的最佳循环次数和模板量。通过计算cGPX PCR产物与β-肌动蛋白PCR产物的灰度之比，即可得出cGPX mRNA的相对含量。     

家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测

DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。     

牛白血病病毒羊胎肺传代细胞毒株的逆转录酶活性测定

用内源法和外源法对 FLL/BLV 传代细胞24～70代中的28个代次39份样品进行了逆转录酶(下称酶)活性测定.结果,外源法计数(cpm)比内源法高3.5～10倍以上;培养上清和细胞均有较高的酶活性;不同收毒期的酶活性大小为144小时>120小时>72小时>96小时;细胞长成50%以上单层后,连续收毒换液,可较常规一次性收毒多收集三倍量酶活性高的培养上清;随着代数增加,酶活性逐渐增大,以61～70代为最高.     

O型口蹄疫病毒O/LZ株拯救

以构建的口蹄疫病毒O／LZ株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,得到病毒RNA。用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞,可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT—PCR、免疫荧光以及免疫电子显微镜观察等方法进行鉴定,结果表明拯救到特定的口蹄疫病毒。同时用空斑试验法观察了拯救病毒及其母本毒株的生长特性,结果表明二者没有明显差异,这将为进一步探索猪口蹄疫病毒致病的分子机制及研制新型口蹄疫疫苗奠定良好的基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4ORF6基因的克隆与序列分析

将猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒BJ－4株在HS．2H细胞上增殖，经超速离心浓缩病毒。用TRIXOL LS试剂提取病毒基因组RNA后，用RT－PCR方法特异性扩增PRRS病毒BJ－4的ORF6基因片段；经Sma Ⅰ酶切鉴定正确后，将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体上，经Amp/IPTG/X-Gal平板筛选、酶切鉴定和质粒PCR鉴定，初步获得含ORF6基因的阳性重组质粒pGEM-T-ORF6。对重组质粒进行序列测定，并同美洲代表株VR2332和欧洲代表株LV进行比较，结果表明，BJ－4 ORF6与VR2332的ORF6差异较小，核苷酸和氨基酸同源性均为99．43％；而与LV株的差异性较大，核苷酸同源性为70．6％，氨基酸同源性77．4％。     

猪囊虫酸性核糖体磷蛋白基因P2重组杆状病毒的构建及鉴定

用O1igo(dT)软件设计了1对酸性核糖体磷蛋白P2(arpP2)基因特异引物，以pUCl8—P2为模板，经PCR扩增出366bP的猪囊虫arPP2片段，酶切回收后与经过相同处理的pFASTBAC供体质粒连接，转化DH5α感受态细胞；对重组质粒经酶切和PCR鉴定后再转化DHl0BAc感受态细胞，提取高分子BacmidDNA，用Lipofectin法转染Sf9单层昆虫细胞，待出现细胞病变后收集培养上清液，重新感染昆虫细胞，提取细胞DNA进行PCR鉴定，证明含有arPP2基因的重组杆状病毒成功地感染了昆虫细胞。     

猫杯状病毒2280株反向遗传系统的构建

为构建猫杯状病毒(FCV)2280株感染性克隆,本研究在FCV 2280株基因组5'末端和3'末端分别引入T7 RNA聚合酶启动子和丁型肝炎核酶(Hdv Rz)序列;并将FCV基因组中唯一的XbaⅠ限制性酶切位点序列进行同义突变作为遗传标记;将基因组分为3段分别进行RT-PCR扩增,通过酶切依次克隆于pOK-12载体中,构建FCV基因组全长cDNA重组质粒。以其为模板经体外转录制备其全长基因组RNA,并在5'末端加帽,转染CRFK细胞,24 h后出现典型的细胞病变。提取出现细胞病变的病毒液的总RNA制备cDNA模板,PCR扩增FCV遗传标记片段并进行XbaⅠ酶切鉴定分析,表明拯救的病毒为FCV重组病毒。而且拯救的病毒生长动力学与亲本病毒无明显差异。本实验为进一步研究FCV的生物学特性和致病机制奠定了基础。     

LPS、poly(i:c)对BV-2小胶质细胞中HMGB1核质穿梭的影响

运用荧光定量PCR方法确定细菌细胞壁的组成成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、病毒模拟物聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly(i:c))对BV-2小胶质细胞中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)核质穿梭影响的最佳作用质量浓度和时间；免疫荧光方法观察BV-2小胶质细胞活化的特异性标志物IBA-1以此确定LPS、poly(i:c)能否激活BV-2小胶质细胞；Western blot方法检测LPS、poly(i:c)诱导BV-2小胶质细胞中促炎细胞因子(IL-1β、TNF-ɑ、NLRP3和iNOS)的蛋白表达量变化；分离细胞核、细胞质蛋白分别检测细胞质和细胞核组分中的HMGB1。结果显示，终质量浓度为10μg/L LPS、50 ng/L poly(i:c)、刺激时长6 h时能够显著增加促炎因子蛋白表达量；免疫荧光结果显示在LPS、poly(i:c)刺激下，BV-2小胶质细胞激活；核质分离结果显示BV-2小胶质细胞被LPS、poly(i:c)刺激后，HMGB1细胞质移位增加。结果表明，细菌或病毒感染都能够使BV-2小胶质细胞内的HMGB1由细胞核向细胞质移位。     

犬细小病毒感染F81细胞microRNA荧光定量PCR内参基因的筛选

犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)是犬急性胃肠炎的主要病原之一，对犬类的健康造成极大危害。MicroRNA(miRNA)是小的、非编码的RNA,在转录后水平调节基因表达。荧光定量PCR(RT-qPCR)是评估miRNA表达水平最常用的方法，而合适的参考基因在RT-qPCR数据归一化中起着至关重要的作用。本研究在分析F81细胞空白对照组和感染CPV组小RNA高通量测序结果基础上，结合参考文献，在CPV感染后12 h和24 h,通过poly(A)延伸RT-qPCR定量方法检测候选内参基因小RNA的表达情况，并使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper算法评估这些候选小RNA的稳定性。结果选取了5种高通量测序中表达相对稳定的miRNAs(dno-miR-186-5p、pha-miR-152、dno-miR-374a-5p、tch-miR-26a-2-5p和oga-miR-26b)和常用作参考基因的小核RNA U6(RNU6-1)、核仁小RNA(small nucleolar RNA)SNORD95以及SNORD96a,经过扩增分析及对高通量测序中差异...     

对牛白血病病毒合胞体检出的评价

作为牛白血病病毒检定的一种新方法,合胞体检出是以被感染牛和羊的淋巴细胞来评价的。只有当采用地方流行性白血病牛和BL实验感染羊的淋巴细胞时,始在指示细胞中诱发合体形成。合胞体形成数与BLV—感染牛接种淋巴细胞数显示一种用量的正比反应关系。成熟型淋巴肉瘤牛的胚淋巴细胞用抗BLV血清处理能抑制合胞体形成,然而用牛合胞体病毒的抗血清或用散发性淋巴肉瘤牛血清均不能引起抑制。这些结果表明这种检出方法对BLV感染的检定是特异性的和有用的。关于牛白血病病毒的作用与在数个指示细胞上可形成合胞体已有报导[2,6,7],在其试验体系中,正常牛胚胎细胞和变态细胞被用作指示细胞。已往的研究已经确认合胞体检出(SA)对定量BLV的感染性是一种简易、可靠的技术。了解具有抗BLV抗体的牛是否在它们的淋巴细胞中携带有BLV是很重要的。电子显微镜及合胞体检出揭示了在具有BLV抗体牛的外周血液淋巴细胞培养中病毒复制物已有产生。[4,10] 这篇论文是关于用BLV所感染的牛和羊的淋巴细胞测定SA的进一步评价。     

狂犬病的分子生物学诊断

从攻击咬伤人并致其死亡的犬脑组织中提取总RNA，用特异性引物通过反转录聚合酶链反应(RT—PCR)获得了长度约为1423bp的核酸片段，与预期的片段大小相符；将扩增产物连接到pMD18-T载体中，转化大肠埃希氏菌JM109，筛选氨苄青霉素抗性菌落，提取质粒，经酶切鉴定、PCR分析及测序，证明所克隆的1423bp片段含有完整的狂犬病病毒N基因，与国外参考毒株的序列相比同源性较高，从而做出正确的诊断。试验表明，用RT—PCR技术检测狂犬病病毒灵敏度高、特异性强，适合于实验室应用。     

牛白血病病毒对家兔感染试验

牛白血病病毒(BLV)接种家兔可产生 BLV 抗体;FLK/BLV 细胞株以静脉接种为最好;感染家兔细胞数不应低于8×10~6个;不同品种的家兔在感染性上无明显差别:BLV阳性兔复归绵羊和家兔可使少数绵羊产生 BLV抗体,而对家兔则无反应.     

牛白血病病毒的传染

近年来,我们对牛白血病病毒(BLV)传染的了解取得了很大进展。现在普遍承认,BLV 引起牛成熟型的淋巴肉瘤,而且还是奶牛中最普遍的一种肉瘤。BLV 首次分离于1969年,自那时起,就成为重点研究的课题,大大增加了对该病毒、及它引起的传染和与它相关的疾病的了解。BLV 在动物逆转录病毒中是刚刚增加并得到公认的一个成员。尽管逆转录病毒都含有能使病毒本身插入寄主细胞的 DNA 中的逆转录酶,然而,并不是     

牛白血病病毒在绵羊胎肺细胞上培养继代试验

关于牛白血病病毒(BLV)在细胞上增殖的报导,早在1969年Miller等人首先用患牛的淋巴细胞做了短期培养,并利用电子显微镜等方法测定了病毒粒子。1974年Maaten等人又成功地在羊胎肾细胞上和羊胎脾细胞上对BLV进行了长期培养,并可以连续传代和释放出足够量的病毒粒子。