拟南芥突变体在磷饥饿反应研究中的应用

磷是构成生命的重要元素之一,也是土壤中有效性最低的一种营养元素。农作物的产量常受到缺磷的影响而受损。研究植物对磷饥饿的反应对于培育耐低磷农作物、减轻农民大量施磷肥的负担具有重要意义。将单基因拟南芥突变体与野生型进行比较是从分子到生理研究植物功能的一种理想方法。目前广泛应用的突变体主要有磷转运功能缺陷突变体、有机酸分泌功能缺失突变体、为研究某一特定基因功能而创造的突变体和根部形态突变体四类。它们在研究植物体内磷的转运、代谢、对磷的吸收和验证基因功能等方面发挥了重要作用。但是,在植物对磷饥饿的反应中,磷的跨液泡膜运输、植物对磷的具体调控机制等重要问题目前还没有明确的结果。如何创造针对性强的筛选方法,诱导筛选更多的专一突变体是将来解决这些问题的一个基本途径。     

一种筛选拟南芥低铁响应突变体的有效方法

铁是植物必需的一种微量营养元素。农作物的产量及品质经常因土壤缺铁而降低。研究植物在低铁条件下生长发育及对铁缺乏响应的分子机制,有助于揭示植物铁营养的遗传基础,有利于改良和培育耐低铁的农作物。笔者根据野生型拟南芥在低铁条件下的生长和生理表型确定了遗传筛选突变体的指标,并建立了筛选拟南芥与缺铁信号及信号转导相关突变体的方法。利用这种方法,笔者筛选出11株突变体并克隆了一个可能与植物耐低铁胁迫相关的基因,证明该方法适用于鉴别铁营养相关的重要基因以及分子遗传学的研究。     

拟南芥H~+_-焦磷酸化酶AVP1互作小GTP结合蛋白AtRAB的特性鉴定与功能分析

以拟南芥AVP1为诱饵,采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与AVP1互作的小GTP结合蛋白AtRAB。酵母互作试验表明,AVP1和AtRAB存在互作;双分子荧光互补实验(BiFC)证明,AVP1和AtRAB能在质膜和细胞核上发生相互作用。野生型拟南芥(WT)、AtRAB和AVP1的拟南芥突变体rab和avp1在高盐胁迫条件下,随着NaCl浓度的加大,突变体rab和avp1的表型变化相似,相对于WT都表现为根长缩短,侧根数减少;在低磷处理条件下,随着磷浓度的逐渐降低,2个突变体的表型相似,相对于WT同样表现为根长缩短,总根面积减少,侧根数减少;在相同磷浓度条件下,突变体rab对胁迫的反应比avp1强;在低钾处理条件下,随着钾浓度的降低,2个突变体的表型与在低磷胁迫处理条件下的表型相似。结果说明,AVP1和AtRAB可以在细胞膜和细胞核上相互作用,AtRAB能够影响植物对离子的吸收,AVP1和AtRAB的突变体在高盐、低磷和低钾等胁迫条件下表型变化相似,证明了2个基因都正向调控植物对高盐、低磷和低钾胁迫的反应,它们属于同一信号途径。     

拟南芥SB10基因在耐盐中的功能研究

为了研究拟南芥SB10基因在耐盐中的功能,我们利用CRISPR/Cas9技术构建载体敲除SB10基因,对转基因植株进行筛选成功获得SB10基因沉默的突变体材料。本研究通过观察突变体根长及萌发率等表型,测定突变体植株脯氨酸含量相关的抗逆生理指标,研究拟南芥SB10基因在耐盐中的功能。结果显示:NaCl胁迫下,sb10突变体的根长和萌发率明显高于野生型拟南芥,sb10突变体拟南芥植物体内脯氨酸含量明显高于野生型拟南芥。说明SB10基因功能的缺失可提高拟南芥植株的耐盐能力。该研究为SB10基因参与拟南芥植株耐盐中的分子作用途径及分析提供线索。     

拟南芥ft-1突变体对非生物胁迫的响应

对植物生存与生长不利的不良环境称逆境。在逆境条件下,植物往往提早开花,快速完成生活史来适应逆境。因此,开花基因与逆境有着密切的关系。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)开花基因FLOWERING LOCUST(FT)突变体ft-1和野生型Col-0为材料,对在胁迫下生长的幼苗主根长进行了表型分析。结果显示,在正常条件下生长的ft-1突变体与Col-0根长相似。突变体ft-1和野生型Col-0对NaCl处理显示出极显著差异,且只在高浓度渗透胁迫下表现出显著差异。表明ft-1可能参与植株抗盐过程,与渗透胁迫关系不大。磷盐与钾盐处理与渗透处理结果类似。铵盐下生长的突变体ft-1和野生型Col-0的根长无显著差异,表明ft-1可能不参与铵盐胁迫。硝盐和混合氮盐处理下,两者均产生了极显著或显著差异,表明ft-1可能参与硝盐胁迫过程。     

金鱼草AmPIN1a基因过表达载体的构建及转基因分析

本研究以金鱼草的AmPIN1a为目的基因,AmPIN1a基因全长CDS为1 836 bp,通过热激法(电击发)将构建过表达载体pCAMBIA1302 (1301)-AmPIN1a导入根癌农杆菌GV3101中,采用叶盘法转化拟南芥,观察其表型并用外源IAA对其进行处理。结果表明,转化AmPIN1a基因的拟南芥突变体在0～12 d内主根长度略短于野生型主根长度,而且侧根发育明显增多。移栽后,AmPIN1a拟南芥突变体的前期叶片大小也小于野生型,24 d后叶片逐步超过野生型,花序轴萌发晚,但发育较快。过表达AmPIN1a基因的拟南芥在外缘IAA处理下表现出比野生型拟南芥更敏感的性状,由此推测AmPIN1a基因可能在生长素运输过程中起作用。     

过表达海马齿SpSOS1基因能增强转基因拟南芥的耐盐性

细胞膜Na~+/H~+逆转运蛋白SOS1在植物耐盐过程中起重要作用。本研究将盐生植物海马齿中的细胞膜Na~+/H~+逆转运蛋白基因SpSOS1构建到植物双元表达载体pCAMBIA1304上,采用农杆菌介导的方法将SpSOS1基因转入到拟南芥中,在含有50μg/mL潮霉素B的MS培养基上筛选转基因后代,结合目标基因和标记基因的PCR验证,获得了超表达的转基因拟南芥。利用T_3代转基因幼苗进行耐盐性分析。研究表明,转SpSOS1基因的拟南芥在50 mmol/L NaCl的培养基中发芽率在80%以上,明显高于野生型拟南芥的45%。转SpSOS1基因拟南芥幼苗的耐盐性明显提高,在100 mmol/L NaCl条件下能正常生长,具有较高的生物量、根长和侧根数,而野生型拟南芥在50 mmol/L NaCl的胁迫下明显萎蔫、失绿、甚至死亡。说明过表达SpSOS1基因显著提高了拟南芥的耐盐性。     

拟南芥CPK6在钙离子信号转导过程中的生理功能研究

为了研究拟南芥CPK6基因在钙离子信号转导过程中的生理功能,进一步明确植物适应缺钙环境的分子机制,首先对CPK6基因缺失突变体(cpk6)进行纯合鉴定,获得了2种纯合突变体:cpk6-2和cpk6-3。通过分析野生型拟南芥Col-0和cpk6突变体在Ca~(2+)、Fe~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)二价阳离子缺失培养基上的生长表型,结果发现,拟南芥cpk6突变体在缺Ca~(2+)条件下,相对野生型Col-0,表现出生长受抑制的表型。构建含有CPK6启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的转基因材料,通过GUS组织化学染色法,发现CPK6启动子在叶片生长点部位和根上有活性,并且在缺Ca~(2+)条件下,CPK6启动子在叶片中的活性明显增强。通过原子吸收光谱法,发现拟南芥野生型Col-0和cpk6突变体之间,在对照和缺Ca~(2+)条件下,总钙含量没有显著差别,表明CPK6基因不影响植物对钙的吸收和积累。利用组织化学染色法和荧光探针,结果发现,缺Ca~(2+)条件下,cpk6突变体根和叶中H2O2的积累量明显高于Col-0,表明CPK6是介导缺Ca~(2+)诱导植物积累H2O2的负调控因子。     

棉花磷胁迫响应基因GhWRKY6克隆及功能分析

【目的】提高棉花在低磷胁迫下的抗性,挖掘棉花磷胁迫相关功能基因。【方法】用生物信息学方法分析Gh WRKY6基因的结构特征和进化关系;构建基因超表达载体转化拟南芥,分析转基因拟南芥在低磷胁迫下的抗性;利用荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析拟南芥中磷信号途径Marker基因表达量的变化。【结果】以陆地棉cDNA为模板克隆得到Gh WRKY6基因,生物信息学分析表明该基因序列含有一个WRKY保守结构域,是WRKY家族转录因子。在低磷胁迫下,转基因拟南芥与野生型相比,种子萌发速度、主根长度、侧根数目、生物量均低于野生型,而在正常生长条件下两者并无差别。qRT-PCR分析表明GhWRKY6能够影响关键的磷转运蛋白基因的表达。【结论】GhWRKY6作为一个负调控因子参与到植物低磷胁迫响应信号途径中。     

拟南芥长链脂肪醇氧化酶(AtFAO3)在抗病防卫反应中的作用分析

长链脂肪醇氧化物酶(FAO)基因编码一个与膜结合,包含黄素,产生H_2O_2的长链脂肪醇氧化酶.在拟南芥基因组中包含4个FAO同源基因.然而,拟南芥FAO在响应非生物和生物环境胁迫中起何种作用还不得而知.本研究中,我们分析了拟南芥AtFAO3在植物防卫病原细菌Pseudomonas syringae pathovar(pv.)tomato strain DC3000(Pst DC3000)中的作用.拟南芥原生质体细胞瞬时表达AtFAO3偶联GFP融合蛋白表明,AtFAO3定位于细胞膜.与野生型植株相比,拟南芥AtFAO3基因T-DNA插入突变体Atfao3在正常条件叶片中H_2O_2含量下降,在氧胁迫或生物胁迫下积累活性氧含量减少.接种病原细菌Pst DC3000后,与野生型植株相比,Atfao3突变体体内细菌繁殖数量增加,叶片病害症状加重,防卫相关基因PR1、PR2和PAL表达减弱.我们基于以上T-DNA突变体分析结果表明,AtFAO3在植物对病原细菌防卫中起重要作用.     

植物对磷饥饿的反应研究进展

磷是构成生命的重要元素之一,也是土壤中有效性最低的一种营养元素。我国是世界上最大的小麦生产国。但是我国耕地中有59%的土壤缺磷。农作物的产量常受到缺磷的影响而受损。土壤缺磷并不是土壤中总磷量低,而是土壤中可供植物直接吸收利用的有效态磷含量低。植物在磷饥饿时会发生各种各样的变化,以尽最大可能满足自身对磷的需求。植物对缺磷的反应是一个复杂的网络过程。大约有100多个基因参与了植物对缺磷的反应。其中主要的有磷转运蛋白基因、核糖核酸酶基因、磷酸酶基因等。植物在吸收外界的磷的过程中磷转运蛋白发挥了重要作用。植物磷转运蛋白基因按照序列相似性可以划分为H+/Pi共转运家族(Pht1家族)和Na+/Pi共转运家族(Pht2家族)。按照吸收动力学的标准可以分为高亲和力磷转运蛋白和低亲和力磷转运蛋白两种。磷饥饿时植物对磷吸收能力的增强的原因之一是增加了磷转运蛋白分子的合成数目。目前尽管人们对植物吸收磷的理解已经有了长足的进步,但是在植物对磷的具体调控机制、磷的跨液泡膜运输等重要方面仍然没有明确的结果。     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

Tryptophan synthesis block-associated sugar response, a physiological marker for rapid selection of Arabidopsis thaliana transformants, marked with feedback-inhibition-insensitive anthranilate synthase gene

The feedback-insensitive anthranilate synthase (AS) gene was used as a selection marker for transformants of Arabidopsis thaliana . The mutant gene ( mAS1-2 ) was constructed by substituting nucleotide at the effector-binding site of the intrinsic AS gene via PCR-mediated site-directed mutagenesis and flanked with the myrosinase promoter pyk10 to drive its expression during initial root elongation. This inducible gene cassette was first introduced into Agrobacterium tumefaciens and then delivered into A. thaliana by floral-dip inoculation. 5-methyltryptophan (5-MT) inhibited AS and suppressed seedling growth of wild type plants as a result of tryptophan starvation. With the addition of sucrose (10 mg/ml), 5-MT inhibited cotyledon opening and caused anthocyanin to accumulate in juvenile seedlings. The present mutant reversed the tryptophan starvation caused by 5-MT and blocked subsequent sugar responses. The sugar responses were detected in non-transformed plants grown on a selection medium containing 10 mg/ml of sucrose and 10 μg/ml of 5-MT after 3 days of incubation. Thus, true transformants could be selected after a short incubation, compared to the conventional kanamycin-selection method that did not eliminate all non-transformed plants.     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻miR1866突变体构建

microRNA(miRNA)是长度为18~25个碱基的非编码单链RNA,在植物生长发育过程中起着重要的调节作用。水稻是世界上重要的粮食作物之一,近年来调控水稻生长发育的miRNA不断被发掘,但目前关于miR1866的研究还比较少。本研究通过构建miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,创制miR1866的突变体,挖掘水稻miR1866的功能。依据CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计了miR1866的突变靶点,通过人工合成的方法得到包含突变靶点的特异序列,经过磷酸化修饰和退火后与载体Sg RNA连接进而与Cas9重组得到miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,获得转基因植株,结合测序结果判断转基因植株突变单株的突变基因型。本研究比较了野生型和突变体(KO1866-1-2和KO1866-2-4)在相同培养条件下苗期的根长、株高、茎基粗、鲜重和干重,结果表明:在营养液培养条件下,突变体的株高、根长、茎基粗、鲜重和干重均显著低于野生型。据此推测,miR1866对水稻的生长发育有一定的调节作用。本研究利用CRISPR/Cas9创制水稻miR1866的突变体,对研究miRNA调控途径,完善水稻miRNA调控的分子机制具有重要的意义。     

枯草芽孢杆菌B931防治植物病害和促进植物生长的作用

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B931是分离自小麦田的植物病害生物防治细菌,对多种作物土传病害都有很好的防治效果,并能促进作物生长。本研究通过转座子Tn917的转座诱变,构建了菌株B931的突变体库。自3 000多个突变体中,筛选得到了6个对小麦全蚀病菌抑制能力丧失的突变体（B931-A^－）,和多个产生长素、赤霉素、细胞分裂素能力增加的突变体B931-I⁺、B931-G⁺、B931-C⁺,以及产这3类激素能力减少的突变体B931-I^－、B931-G^－、B931-C^－。温室测定这些突变体对小麦全蚀病及棉花立枯病的防治作用,结果表明抗生素的产生是B931具有病害防治能力的主要原因。产植物激素能力变化的突变体对苗期小麦和棉花没有促生长作用,但对甘薯苗的生根有显著的促进作用。     

拟南芥AT2G14260基因功能及其表达特异性分析

拟南芥AT2G14260基因编码脯氨酸亚氨基肽酶，基因芯片表达谱数据显示该基因响应高盐、低温等非生物胁迫。为研究其功能和表达特性，本研究采用野生型和突变体植株pip-1进行低温、干旱和盐胁迫处理，结果显示在正常培养基中野生型与pip-1植株表型没有区别。而在逆境处理下pip-1植株的根比野生型明显短，且在干旱胁迫下，突变体的叶子比野生型植株明显变黄萎蔫。在正常环境、冷、干旱、盐胁迫下，野生型植株脯氨酸含量的平均值分别是突变体的1.11、1.23、1.10和1.34倍，这说明AT2G14260基因对提高非生物胁迫的耐性具有一定的作用。同时分离了该基因的启动子，构建了表达GUS基因的载体并转化拟南芥，结果表明该启动子在正常环境中不表达。胁迫处理时从两叶期开始在根、叶、茎中表达，到达花期后，干旱处理下的花瓣、花枝和冷处理下的花柱头中也有表达。GUS相对活性试验也证明对胁迫的响应能力。可见AT2G14260基因启动子是逆境胁迫诱导表达启动子，同时具有组织表达特异性，因此，AT2G14260基因及其启动子在转基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

Allelic relationship between spontaneous and induced mutant genes for stem fasciation in chickpea

Stem fasciation is a morphological abnormality observed in plants where the stem is widened and leaves and flowers or pods are clustered at the apex. Several spontaneous mutants and one induced mutant for stem fasciation are found in chickpea (Cicer arietinum L.). This study was aimed at determining allelic relationship between spontaneous and induced mutant genes controlling stem fasciation and effects of stem fasciation on grain yield. Two spontaneous (ICC 2042 and ICC 5645) and one induced (JGM 2) stem fasciation mutants were crossed in all combinations, excluding reciprocals. The F₁ and F₂ plants from a cross between the two spontaneous mutants had fasciated stem. This indicated the presence of a common gene (designated fas1) for stem fasciation in the two spontaneous mutants. The F₁s of the crosses of the induced mutant JGM 2 with both spontaneous mutants had normal plants and segregated in a ratio of 9 normal : 7 fasciated plants in F₂. Thus, the gene for stem fasciation in the induced mutant JGM 2 (designated fas2) is not allelic to the common gene for stem fasciation in spontaneous mutants. The two genes in dominant condition produced normal non‐fasciated stem. The fasciated and the non‐fasciated F₂ plants did not differ significantly for number of pods per plant, number of seeds per plant, grain yield per plant and seed size, suggesting that it is possible to exploit the fasciated trait in chickpea breeding without compromising on yield.     

矮杆和半矮杆大豆突变体植株生长对外源GA3的响应

矮杆和半矮杆突变体是研究植物基因功能和培育高产作物新品种的重要材料。本研究以矮杆和半矮杆大豆突变体与各自野生型品种为材料, 利用外源赤霉素(GA₃)处理不同发育时期植株, 研究植株生长速率和成熟期株高性状发育对外源GA₃的响应及主茎纵向细胞的形态学变化, 分析两类突变体与各自野生型之间的内源赤霉素含量差异。结果表明, 外源GA₃(40 mg L^-1)对半矮杆和矮杆突变体的作用效果明显不同, GA₃处理后半矮杆突变体植株在不同测定时段的平均生长速率达到2.76 cm d^-1, 而矮杆突变体的平均生长速率仅为0.92 cm d^-1, 而且成熟期半矮杆突变体植株的平均高度、主茎平均节间长度与节间纵向细胞长度均显著超过对照, 外源GA₃能够恢复其正常的野生型株高表型; 而矮杆突变体较对照的上述3项增幅均明显小于半矮杆型, 外源GA₃不能恢复其正常的野生型株高表型。说明半矮杆突变体的植株生长对外源GA₃有明显响应, 为GA₃敏感型突变体; 而矮杆突变体仅在生育前期对外源GA₃有一定程度响应, 为GA₃钝感型突变体。半矮杆和矮杆突变体成熟期植株的内源GA₃₊₁含量均显著低于各自野生型品种, 这可能是二者表型矮化的生理原因。