DSS诱导血管内皮细胞ECV304凋亡及机制研究

为了研究葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导血管内皮细胞:ECV304增殖和凋亡的影响。体外培养血管内皮细胞ECV304,采用不同浓度DSS诱导细胞,流式细胞术分析细胞凋亡、活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)、细胞周期;WST-1法检测细胞增殖抑制率。结果显示,随着DSS浓度的增加细胞凋亡率增加,并导致细胞GOG1期阻滞,细胞内活性氧含量减少,同时线粒体膜电位下降,细胞增殖抑制率明显升高。结果表明,DSS可以抑制血管内皮细胞ECV304增殖并诱导细胞凋亡。     

两种活性羰基类物质对 ECV304细胞的毒性研究

为探讨乙二醛（GO）和甲基乙二醛（MGO）对上皮细胞的细胞毒性及其机制,分别以 MTT 法检测两种活性羰基化合物（RCS）对 ECV304细胞活力的影响,评价其细胞毒性;DCFH-DA 探针法检测氧化应激;用罗丹明123检测线粒体膜电位及线粒体形态变化。结果表明,GO 和 MGO 对 ECV304细胞的 IC50分别为3．6 mmol／L±0．1 mmol／L 和1．3 mmol／L±0．1 mmol／L;氧化应激水平小幅度增高,线粒体膜电位随发生改变;线粒体形态发生改变。GO 和 MGO 的细胞毒性与氧化应激水平增加相关性较低而与线粒体损伤相关。     

乐果引起大鼠肝细胞凋亡的机理

通过给大鼠肝细胞培养液中加入乐果(0、3、10、30、100、300μmol/L),染毒122、4 h后,Annexin V/PI双染法检测肝细胞凋亡率;分别用Fluo-2/AM、双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)和罗丹名123检测细胞内Ca2+浓度、活性氧(ROS)和线粒体膜电位(Δψm)变化,并在扫描电镜和荧光显微镜下观察凋亡细胞情况,探讨乐果对大鼠肝细胞凋亡的影响。结果显示,肝细胞染毒12、24 h后,出现了明显的细胞凋亡的形态学变化,细胞凋亡率明显升高,除3μmol/L组外,与对照组相比差异显著(P0.05或P0.01),且呈时间-剂量效应。3μmol/L组细胞内Ca2+浓度极显著高于对照组(P0.01),之后随染毒剂量的增加,细胞内Ca2+浓度逐渐下降;细胞内ROS水平在3~100μmol/L随染毒剂量的增大和染毒时间的延长而升高,而在300μmol/L组略有下降,除3μmol/L组外,与对照组相比均差异极显著(P0.01);Δψm除24 h 300μmol/L组外均出现持续下降。结果表明,低剂量乐果染毒可诱导肝细胞发生凋亡,细胞内Ca2+、ROS和Δψm可能参与了这一过程。     

血管紧张素Ⅱ协同LPS诱导巨噬细胞活化和凋亡的研究

为了研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导巨噬细胞活化和凋亡的影响,在体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,流式细胞术分析不同浓度AngⅡ对细胞TLR4表达的影响;AngⅡ处理细胞8 h后用LPS诱导细胞,流式细胞术分析细胞内活性氧(ROS),p H值,细胞凋亡和线粒体膜电位。通过研究发现,AngⅡ以浓度依赖的方式上调小鼠巨噬TLR4表达,而在AngⅡ与LPS协同诱导后,细胞内ROS含量显著增加,p H值下降幅度也较LPS单独作用组增大;与LPS单独作用比较,AngⅡ与LPS协同诱导增加了巨噬细胞凋亡和线粒体损伤效应。表明AngⅡ对LPS活化巨噬细胞具有增敏作用,同时也促进LPS诱导的细胞凋亡。     

脂多糖对牛乳腺上皮细胞自噬和凋亡的影响

为探究脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对牛乳腺上皮细胞(MAC-T)自噬和凋亡的影响,以MAC-T细胞为试验对象,用CCK-8和乳酸脱氢酶(LDH)法检测不同浓度LPS(100、150、200、250μg/mL),检测细胞的存活率和损伤,从上述分组中挑选浓度为0(对照)、50、100、200μg/mL的LPS建立试验组,Hoechst33342检测细胞核形态,qPCR法检测MAC-T细胞中自噬和凋亡基因(LC3B、p62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3)mRNA的表达量,Western blot检测MAC-T细胞中自噬和凋亡(LC3B、p62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3)相关蛋白表达。结果显示,MAC-T细胞的活力会随着LPS的浓度和时间的推移下降,细胞上清中的LDH随着LPS浓度上升而增加,Hoechst33342染色后可以发现细胞核形态出现异型性,染色质碎裂、固缩。qPCR和Western blot检测结果显示LPS在50～100μg/mL浓度下可引起MAC-T细...     

苜蓿黄酮对脂多糖诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响

研究苜蓿黄酮对脂多糖(LPS)诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响。将奶牛乳腺上皮细胞分成4个组,即基础培养基、基础培养基中加入1 μg·mL^-1的LPS、基础培养基中加入1 μg·mL^-1的LPS和75 μg·mL^-1苜蓿黄酮、基础培养基中加入75 μg·mL^-1苜蓿黄酮。细胞在37 ℃, 5% CO₂的培养箱中培养。结果表明:1)LPS刺激12 h后奶牛乳腺上皮细胞活性下降,而添加苜蓿黄酮能够极显著抑制LPS诱导下细胞活性的下降(P<0.01)。2)在LPS刺激下,细胞内的活性氧(ROS)浓度升高,而添加苜蓿黄酮能够显著降低其浓度(P<0.05)。3)LPS显著上调细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR2、TLR4和MyD88表达(P<0.01),而苜蓿黄酮能够显著下调细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α和TLR2表达(P<0.01或P<0.05)。4)在LPS刺激下,p53、Caspase3、p38和P-p38蛋白的表达显著升高(P<0.01或P<0.05),而添加苜蓿黄酮能够显著降低p53和p38蛋白的表达(P<0.05)。在LPS诱导下,苜蓿黄酮能够通过降低ROS浓度,抑制细胞凋亡,提高细胞活性;可能通过抑制TLR2/MyD88信号通路来降低细胞炎症因子的表达,从而保护细胞免受炎性损伤。     

白藜芦醇通过抑制炎症和细胞凋亡预防脂多糖对小鼠肝脏的损伤

本试验旨在研究白藜芦醇( RES)对脂多糖( LPS)诱导小鼠肝脏损伤的预防作用.首先,将50只小鼠随机分为5组,分别为对照组、LPS组、RES-L+LPS组、RES-M+LPS组、RES-H+LPS组,每组10只.其中,RES-L+LPS组、RES-M+LPS组、RES-H+LPS组小鼠分别连续灌胃300 μL含10...     

藏药绿萝花水提物对成纤维细胞线粒体抗氧化作用的研究

为探讨不同浓度的绿萝花制剂对线粒体的抗氧化作用及毒理作用,以小鼠胚胎成纤维细胞及其线粒体为研究对象,在最大无毒作用浓度(TC_0)的基础上设计3个浓度药物组,在TC_0下设计6个浓度药物组,以成纤维细胞线粒体膜电位(MMP)和线粒体总活性氧含量(ROS)为检测指标,在4个不同作用时间点,研究绿萝花对成纤维细胞线粒体的影响。结果表明,绿萝花制剂对鼠胚成纤维细胞(MEF)的TC_0为0.25g/mL,但ROS已急剧上升,MMP下降;绿萝花浓度为0.03g/mL时,抗氧化能力最强,随着浓度的上升(0.03g/mL~0.25g/mL),线粒体抗氧化能力减弱或消失;随着给药浓度的升高,细胞凋亡现象出现趋势明显,浓度高于TC_0时,表现出毒性作用,浓度升高,毒性增大。绿萝花干膏制剂0.03g/mL(以生药含量计算)具有抵抗由H_2O_2引起的MEF线粒体MMP下降和ROS的升高的功能,表现出一定的抗氧化能力和阻滞细胞凋亡发生的作用;TC_0及之上浓度具有细胞毒性作用。     

内毒素对微循环及血管内皮细胞功能影响的研究进展

大肠杆菌在繁殖或死亡过程中 ,所释放出的内毒素可对动物机体微循环和血管内皮细胞造成损害 ,引起微循环障碍和血管内皮细胞分泌大量细胞因子如内皮素、血栓调节蛋白、粘附因子、选择素、一氧化氮及血小板激活因子等 ,从而引起血管内皮细胞正常功能形态损伤和全身炎症的发生 ,为大肠杆菌病引起的感染、休克等综合征发生的主要病理基础。通过对大肠杆菌内毒素致病机制的研究 ,对有效防治大肠杆菌病具有重要意义。     

猪脐静脉血管内皮细胞的分离及体外培养研究

为建立一种操作简单并且能获得大量猪血管内皮细胞的分离培养方法,本研究采集新生健康长白猪脐带,取其脐静脉血管,灌注0.1%的Ⅰ型胶原酶,于37℃水浴消化10 min后收集内皮细胞,培养于含20%胎牛血清的M199培养基中,长满单层后用胰酶消化传代培养。并对培养的细胞形态学、相关抗原和其他特征以及对病毒的易感性进行鉴定。结果表明,Ⅰ型胶原酶消化后可获得大量内皮细胞,细胞培养后的形态学观察显示细胞贴壁生长良好,呈典型的铺路石状排列;第Ⅷ因子相关抗原和细胞摄取乙酰化低密度脂蛋白均呈阳性,内皮细胞比率可高达100%。传3代后的生长曲线显示细胞传代后延迟期小于1 d,对数生长期约3 d,第5 d进入平台期,第7 d开始脱落死亡。病毒感染试验表明所获得的内皮细胞对猪瘟病毒高度易感,病毒生长与常用的PK-15没有区别。上述研究结果表明本研究建立的血管内皮细胞分离培养方法简便有效,为大量制备原代血管内皮细胞提供了可靠的方法。     

亚硒酸钠对游离脂肪酸致肝细胞凋亡和线粒体膜电位降低的保护作用

为研究亚硒酸钠对游离脂肪酸 (free fatty acid,FFA) 致体外培养大鼠肝细胞凋亡和线粒体膜电位降低的保护作用,本试验通过胶原酶两步灌流法分离培养肝细胞,在细胞培养液中添加FFA和亚硒酸钠 (0.1 μmol/L)测定细胞的凋亡情况、细胞功能和线粒体膜电位。结果表明,随着培养液中FFA浓度的升高,细胞凋亡加重,肝细胞功能受到影响,线粒体膜电位降低且FFA的这种作用呈剂量依赖性;亚硒酸钠能抑制由FFA引起的肝细胞的上述变化。     

敌百虫对体外培养大鼠大脑皮质神经细胞凋亡的影响

为探讨敌百虫对大鼠大脑皮质神经细胞的毒性作用及机理,本研究在建立体外培养新生24h内SD大鼠大脑皮质神经细胞模型的基础上,在细胞培养液中添加0、5、20、80mg/L敌百虫染毒,在染毒后的不同时间测定细胞凋亡率、线粒体膜电位、细胞内[Ca2＋]i、ROS含量和ATP酶的变化。结果显示：①染毒12h,细胞凋亡率明显增加;②染毒12h,各染毒组线粒体膜电位逐渐降低,其中80mg/L组与对照组存在极显著差异（P〈0.01）;③染毒0.5h,各染毒组细胞内[Ca2＋]i显著高于对照组（P〈0.01）;染毒12h,各染毒组细胞内[Ca2＋]i呈下降趋势,但仍显著或极显著高于对照组（P〈0.05或P〈0.01）;④染毒12h和24h,细胞内ROS水平显著或极显著高于对照组（P〈0.05或P〈0.01）;⑤染毒12h,细胞Na＋-K＋-ATPase和Ca2＋-Mg2＋-ATPase活性逐渐降低,20、80mg/L组与对照组有极显著差异（P〈0.01）;上述指标的变化呈显著的剂量-效应关系。结果表明,低质量浓度敌百虫暴露可致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡率和细胞内ROS含量升高,线粒体膜电位下降,细胞内钙离子超载且ATPase活性降低,提示细胞凋亡在敌百虫所致的大脑皮质神经细胞损伤过程中发挥主导作用。     

外源性金属硫蛋白对中国荷斯坦奶牛血淋巴细胞凋亡/坏死及线粒体膜电位的影响

选取20头处于热应激环境的泌乳奶牛,随机分成A、B、C和D组4组,分别按剂量0.0(对照),4.0,8.0和16.0 mg/头静脉注射金属硫蛋白(MT),以探讨外源性MT对奶牛淋巴细胞凋亡、坏死和线粒体膜电位(ΔΨm)的影响。结果表明,注射MT后,在51~60 d时,校正标准产奶量B、C和D组均显著性高于A组(P<0.05); 35 d时C组(8 mg/头)的血淋巴细胞凋亡率显著性低于B、D组(P<0.05),但与A组无显著性差异(P>0.05),D组(16 mg/头)35 d时凋亡率达到最大,随后(50~60 d)显著性下降(P<0.05);细胞的坏死率A组50 d时较1 d时显著下降(P<0.05),C组(8 mg/头)35,50 d时显著下降(P<0.05),但60 d时开始呈上升趋势(P>0.05),而D组(16 mg/头)坏死率呈现下降趋势,且在50,60 d时均显著低于注射MT之前的血淋巴细胞坏死率;35 d时,A组的线粒体膜电位值(ΔΨm)最高,但上升速度最快的是B组(4 mg/头),在35 d时显著高于20 d时的ΔΨm (P<0.05);50 d时A组和B组的ΔΨm不但不上升,反而下降,其中A组下降的速度更快,35~50 d C组(8 mg/头)保持基本恒定,60 d略有上升,D组(16 mg/头)1~35 d时逐步上升,50~60 d时保持恒定。在60 d时,ΔΨm与注射MT浓度呈正相关。说明外源性MT不仅能提高热应激状态动物的体质,还可让泌乳母牛从热应激状态平稳的过渡到热应激损伤修复状态,若注射8~16 mg/头,能抑制南方泌乳母牛夏季热应激引起的滞后效应。     

载脂蛋白CⅢ刺激猪主动脉血管内皮细胞差异表达基因的研究

本研究旨在探究载脂蛋白CⅢ (ApoCⅢ)刺激猪主动脉血管内皮细胞前后的差异基因表达谱,从而揭示ApoCⅢ的功能。利用酶解法成功分离猪主动脉血管内皮细胞并进行体外培养,采用高通量测序技术筛选出ApoCⅢ刺激前后的差异表达基因。结果表明,ApoCⅢ刺激猪主动脉血管内皮细胞前后共有647个差异表达基因,包括390个上调表达基因和257个下调表达基因。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测表明,高通量测序数据结果正确可靠。GO及Pathway分析结果显示,差异表达基因的功能涉及免疫应答、细胞凋亡及死亡等。这表明ApoCⅢ可通过炎症反应、细胞黏附、细胞凋亡等分子通路影响猪主动脉血管内皮细胞的生理功能,为进一步解析ApoCⅢ引发动脉粥样硬化发生的分子机制提供了理论基础。     

PPARγ对猪血管内皮细胞增殖、迁移及小管形成的影响

试验旨在研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptors γ,PPARγ）对猪血管内皮细胞增殖、迁移及小管形成的影响,并探讨PPARγ在猪体外血管生成中的作用。设置PPARγ激动剂组（5、10、15、20 μmol/L罗格列酮）、抑制剂组（5、10、15、20 μmol/L T0070907）及对照组,通过iCelligence细胞功能分析、划痕试验和Matrigel基质胶三维培养,构建猪体外血管生成的模型,模拟猪体内血管生成的环境,分别对猪血管内皮细胞的增殖、迁移、小管形成能力进行测定,同时根据NCBI已有的相关序列,应用Primer Premier 5.0软件设计PPARγ基因特异性引物,利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测PPARγ基因mRNA相对表达量,对PPARγ的体外作用效果进行验证。结果显示,5、10 μmol/L罗格列酮能促进猪血管内皮细胞增殖、迁移及小管形成,T0070907的抑制效果在试验浓度区间内（5~15 μmol/L）随浓度升高而加强,较高浓度（20 μmol/L）的两种药物均由于药物毒性的影响对细胞活动产生干扰。此外,5~20 μmol/L罗格列酮和5~20 μmol/L T0070907能分别提高和降低PPARγ基因mRNA相对表达量,且浓度趋势与增殖、迁移、小管形成的试验结果一致。综上所述,通过激活PPARγ可以对猪血管内皮细胞的增殖、迁移及小管形成产生促进效果,提示其在猪体外血管生成中具有积极作用,可为研究PPARγ对猪胎盘血管发生的影响提供参考依据。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导血管内皮细胞凋亡及其凋亡相关因子的初步研究

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是由镰刀菌属病原真菌产生的真菌毒素之一,在自然界广泛存在,可引起人畜中毒。为了解DON对血管内皮细胞的危害及其可能机制,本试验采用不同浓度的DON（0.25-10μg/mL）作用于猪髋动脉内皮细胞（PIEC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）2种细胞24 h,倒置显微镜下观察其形态变化,MTT法测定细胞增殖的变化,TUNEL法检测细胞凋亡率,免疫组织化学染色方法测定细胞凋亡过程中Caspase-9和Bax表达的变化。结果显示,高浓度DON可明显改变细胞的形态;不同浓度的DON均可抑制细胞的增殖;TUNEL凋亡检测结果显示,不同浓度的DON对这2种细胞均有诱导凋亡的作用;对于PIEC细胞,在DON浓度为0.5μg/mL时,凋亡率达到最高（71.74%）;HUVEC细胞则在DON浓度为5μg/mL时,凋亡率达到最高（26.61%）,此后随浓度的升高,凋亡率下降,可能与凋亡细胞崩解脱离细胞片有关。根据试验结果初步推断,DON诱导PIEC凋亡可能与Caspases途径有关,Bax在其中起到了一定的凋亡促进作用;而在诱导HUVEC细胞凋亡的过程中未检测到Caspase-9和Bax的变化,故认为DON诱导HUVEC细胞凋亡与Caspases途径和促凋亡因子Bax均无关。     

接种猪瘟兔化弱毒株的永生化猪血管内皮细胞传代情况研究

在传至70代的永生化猪血管内皮细胞接种猪瘟兔化弱毒,72 h后收取细胞上清液并对处理的细胞进行传代培养,分别检测第70、75、80、90、100、105代接毒细胞中病毒,观察各代细胞的生长情况。结果表明,接种猪瘟兔化弱毒后20代(第90代永生化猪血管内皮细胞)的细胞与正常的形态相似,但传至接毒后35代(第105代永生化猪血管内皮细胞)时,细胞稍有拉长现象。各代次细胞中都有猪瘟兔化弱毒的检出。本研究为永生化猪血管内皮细胞生产猪瘟兔化弱毒疫苗奠定了基础。     

犬UC-MSC-Exo来源miRNA表达分析及其cfa-miR-34a/-143对血管内皮细胞增殖的影响

试验旨在分离鉴定犬脐带间充质干细胞分泌的外泌体（UC-MSC-Exo）,并研究犬UC-MSC-Exo来源miRNA的表达情况及其对血管内皮细胞（VEC）增殖的影响。采用超高速离心法从犬脐带间充质干细胞培养上清中分离外泌体,采用Western blotting、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析法（NTA）进行鉴定。通过对犬UC-MSC-Exo中的miRNA进行测序,筛选出2个目标miRNA（cfa-miR-34a和cfa-miR-143）并合成相应的mimic和inhibitor,转染犬VEC;采用荧光显微镜和实时荧光定量PCR法检测mimic和inhibitor转染情况及其转染效率;CCK-8法检测转染mimic和inhibitor对犬VEC增殖能力的影响,并对其靶基因进行预测。结果显示,犬UC-MSC-Exo表达特异性的外泌体表面蛋白CD9、CD63和CD81,粒径集中在100~200 nm,电镜检测成典型的杯状。免疫荧光结果表明,miRNA mimic和inhibitor均已转染进细胞内,并且聚集于细胞质中;实时荧光定量PCR结果表明,转染cfa-miR-34a mimic和cfa-miR-143 mimic后,细胞内cfa-miR-34a和cfa-miR-143表达量分别升高约400和78倍;而转染cfa-miR-34a inhibitor和cfa-miR-143 inhibitor后,细胞内cfa-miR-34a和cfa-miR-143表达量分别降低了77%和83%;CCK-8检测结果表明,cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可极显著促进血管内皮细胞的增殖（P<0.01）。cfa-miR-34a靶基因预测结果发现,共有195个保守靶位点,与miRDB预测结果共有69个交集靶基因;cfa-miR-143则有448个保守靶基因,其与miRDB预测结果有128个交集靶基因。本试验成功分离得到犬UC-MSC-Exo,且证实目标miRNA cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可极显著促进VEC增殖。     

大肠杆菌热敏肠毒素对肠黏膜微血管内皮细胞的影响及白头翁素对其保护作用的研究

大肠杆菌病是严重危害养殖业的疾病之一,可引起动物腹泻,导致死亡,造成了较大的经济损失.研究表明,细菌产生的热敏肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)是引起腹泻的主要毒素之一.肠黏膜微血管内皮细胞(RIMECs)不仅构成肠道局部的血液与组织细胞间的物理屏障,保证血管内外的物质交换,并且通过合成和释放各种血管活性物质,在调节正常的血液循环、维持周围细胞环境的稳定方面具有十分重要的作用.白头翁素是传统抗腹泻中药白头翁的主要成分.本试验在建立LT损伤RIMECs体外病理模型的基础上,研究了白头翁素对其作用,以进一步了解白头翁素的抗腹泻机制.