基于代谢组解析大黄鱼对低温和饥饿胁迫的适应机制

为探讨大黄鱼Larimichthys crocea对低温和饥饿氧化损伤的响应机制,本实验将体质量为（21.38±2.46）g的大黄鱼在低温（8°C）或/和禁食条件下饲养。实验组可分为4个处理组：对照组（C组）、低温组（CC组）、饥饿组（F组）和饥饿+低温组（CF组）,每组3个平行。低温和饥饿胁迫30 d后,计算成活率;采取肝脏样本,进行组织学观察,并利用化学荧光法和LC-MS非靶向代谢组学技术分析处理组间活性氧（ROS）和代谢产物的差异。结果表明,与C组相比,CC组、F组和CF组的成活率显著降低,而ROS含量显著升高（P < 0.05）,且肝细胞均出现不同程度的空泡和核萎缩现象,表明低温和饥饿胁迫对大黄鱼产生了氧化损伤。大黄鱼低温应激后,从CC vs. C和CF vs. F中分别筛选出84种和154种差异代谢物,有5种重要的重叠代谢途径：甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚生物合成和自噬等,表明细胞膜流动性和自噬在大黄鱼低温适应过程中发挥重要作用。大黄鱼饥饿应激后,从F vs. C和CF vs. CC中分别筛选出184种和50种差异代谢物,有4种重要的重叠代谢途径：甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚生物合成、ABC运输体和自噬等,表明能量代谢和自噬在大黄鱼饥饿过程中发挥重要作用。从CF vs. C中筛选出差异代谢物126种,主要富集在糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚生物合成、甘油磷脂代谢、氧化磷酸化、淀粉和蔗糖代谢、FoxO信号通路、自噬和谷胱甘肽代谢等,表明细胞膜流动性、能量代谢、自噬和抗氧化系统在大黄鱼适应低温和饥饿联合胁迫过程中发挥重要作用。本文结果为深入研究低温及其诱导的饥饿对大黄鱼生理功能的影响提供科学依据。     

大黄鱼肿瘤抑制因子cylindromatosis (LcCYLD)的序列与免疫反应特征及其功能

为研究大黄鱼肿瘤抑制因子cylindromatosis（CYLD）在免疫反应中的作用,本实验克隆了大黄鱼CYLD的全长cDNA（命名为LcCYLD）并对其进行序列分析;采用荧光定量PCR的方法对大黄鱼各组织及免疫刺激后的大黄鱼肾细胞系中的LcCY LD表达变化进行检测;构建了重组表达载体pTurboGFP-CYLD及pcDNA3.1-CYLD,分别用于亚细胞定位实验及过表达实验;在HEK293T细胞系中过表达LcCYLD后采用双荧光素酶报告系统检测了 NF-κB、TNF-α及IL-1β 启动子活性的变化。结果显示,LcCYLD的ORF包含2 754 bp,编码917个氨基酸,推测具有保守的3个N端的CAP-GLY结构域,1个磷酸化区域和1个C端的UCH结构域,多序列比对结果显示各物种CYLD间高度保守;系统进化分析显示,LcCYLD与来源于其他硬骨鱼的CYLD聚为一支,其中与条纹鲈的CYLD关系最近;转录水平表达分析发现LcCYLD在大黄鱼各组织均有表达,其中在脑中表达量最高;LPS及poly I:C刺激能够显著诱导LcCYLD的表达;亚细胞定位实验表明LcCYLD在细胞质及细胞核中均有表达;过表达LcCYLD能够显著抑制NF-κB及促炎细胞因子TNF-α及IL-1β的转录激活。以上研究结果表明大黄鱼CYLD能够抑制NF-κB的转录激活,为深入了解LcCYLD在大黄鱼先天免疫信号转导中的作用奠定基础。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)的染色体研究

利用胸腔注射植物血凝素和秋水仙碱溶液制备肾细胞的方法,对大黄鱼(Pseudosciaena crocea)染色体组型进行分析研究。结果表明,大黄鱼染色体数目为 48条,全部是端部着丝点染色体,核型为2N=48t,臂数NF=48。     

三倍体大黄鱼的诱导及其对生长、性腺发育的影响

自20世纪50年代以来,采用染色体操作技术人工诱导多倍体在鱼类遗传育种领域已得到广泛的应用。国内外已先后在三棘刺鱼[1]、鲤[2]、水晶彩鲫[3]等30多种鱼类成功获得三倍体。在理论上,由于三倍体性腺发育受阻,其用于性腺发育的能量可全部用于生长。因此鱼类育种学家期望通过诱导三倍体,使经济鱼类生长更快,经济效益更高。但历经30余年的研究,诸家看法仍未统一。一些学者认为三倍体鱼比二倍体生长快[4,5],另一些学者则认为三倍体鱼并不比二倍体生长快[6,7]还有一些学者的研究表明三倍体鱼在性成熟以后比二倍体生长稍快[8,9]。对于三倍体…     

网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与鉴定

浙江宁波、台州等地相继发生网箱养殖大黄鱼的大量死亡,主要症状为脾脏、肾脏有许多白色结节,大小为0.1～1mm。从病鱼体内分离出致病力极强的菌株GYCWS,人工感染试验证实为大黄鱼的病原菌,其半数致死量(LD50)为8.5×104CFU/ml。对该细菌进行了形态、生理生化特性的测定,并进行了全自动微生物分析系统(ID32GN)及16S rRNA分子鉴定。经PCR扩增获得了大小约1.5Kb的16S rRNA部分基因片段,产物经回收纯化,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1,对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定确认阳性重组质粒,将测定的序列递交NCBI进行BLAST同源序列比对,与恶臭假单胞菌的16S rRNA基因(DQ201403、AY785244)具有较高的同源性(99%),该序列在Genbank上的登录号为DQ648602。结合细菌的生理生化特性,GYCWS菌株属于恶臭假单胞菌(Pseudo monas putida)。药敏试验结果表明,病原菌GYCWS对卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、氟派酸、四环素、链霉素药物敏感。     

养殖大黄鱼冷藏过程中细菌菌相的变化

采用感官、挥发性盐基氮(TVBN)、菌落总数对大黄鱼(Pseudosciaena crocea)在0℃、5℃冷藏过程中的品质变化特征进行分析,并对细菌菌相进行定性和定量研究。结果表明,冷藏初期、高品质期和货架期终点菌落总数N(CFU/g)的对数值(lgN)分别为5.40±0.17、6.98±0.17、7.38±0.09,TVBN分别为(7.00±1.82)mg.100-1.g-1、(13.00±1.42)mg.100-1.g-1、(29.92±1.75)mg.100-1.g-1。冷藏初期分离获得211株菌株,84.8%是革兰氏阴性菌,出现少量革兰氏阳性菌(6.2%),优势菌群是肠杆菌科细菌(6.6%)、气单胞菌属(14.2%)、不动杆菌属(13.3%)、摩氏杆菌属(11.8%),并出现了一定比例的假单胞菌属、嗜麦芽窄食单胞菌和其他细菌。冷藏过程中细菌菌相逐渐变得单一,腐败希瓦氏菌上升趋势明显。高品质期时,0℃冷藏大黄鱼优势菌群为腐败希瓦氏菌(45.8%)和缺陷短波胞单胞菌(13.6%);5℃冷藏大黄鱼优势菌群为腐败希瓦氏菌(37.9%)和假单胞菌属(15.6%)。货架期终点时,0℃、5℃冷藏大黄鱼优势菌为腐败希瓦氏菌,比例分别为75.5%和59.6%。     

自然海区大黄鱼围养技术的研究

从环境的选择、围网的架设、日常管理等方面,按照绿色食品标准开展大黄鱼围养技术的研究,取得成功,并制定了一套较完善的大黄鱼围养技术规范。研究结果表明：每口围养大黄鱼3年总产值614．5万元,利润494万元;大黄鱼体形较为修长,体色呈淡金黄色,蛋白质含量18．7％,脂肪含量13．6％,氨基酸总含量181．5g／kg,其中鲜味氨基酸总含量87．1g／kg。     

大黄鱼肝脏病变组织病理学观察

采用石蜡切片和HE染色法,对不同生存条件下的大黄鱼以及肝脏病变的大黄鱼肝组织进行组织切片,在显微镜下进行组织病理学观察,采用酸水解法测定不同生存条件下以及患肝肿大的大黄鱼肝脏的脂肪含量,了解其变化情况。以野生大黄鱼的肝组织细胞结构为参照,初步探明了小网箱养殖大黄鱼的脂肪肝、肝肿大、肝胆汁淤积、肝淤血的组织病理变化情况,讨论了大黄鱼肝脏病变的原因和病变致死原因,并提出了防治措施。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏白点病的组织病理和超微病理分析

利用组织切片及超薄切片电镜技术对患内脏白点病大黄鱼(Pseudosciaena crocea)的肝脏、脾脏和肾脏3种组织进行病理学分析,探讨该病的致病机理.结果显示,大黄鱼的临床症状为体表无明显病症,脾、肾、肝等内脏有大量白色结节;组织病理显示,肝、肾和脾是感染损伤的主要靶器官,出现组织变性坏死,空泡化严重,炎性细胞浸润;病变组织均出现病理性结节.超微病理显示,病鱼肝、肾、脾细胞超微结构受损严重,尤以线粒体和细胞核损伤明显.线粒体肿胀,嵴断裂消失,空泡化;细胞核核膜破裂,染色质浓缩边集;肾脏和脾脏均发现大量菌聚集成团的病原.研究表明,大黄鱼内脏白点病的组织细胞病理变化特征显示了病原菌的入侵和危害,造成鱼体生理代谢紊乱,免疫力和抵抗力下降,鱼体终因无法维持正常的生命活动而导致死亡.     

冷藏养殖大黄鱼指数腐败货架期模型的构建与评价

通过感官、化学、微生物学分析对0~10℃冷藏养殖大黄鱼鲜度和货架期进行研究,构建和验证了指数腐败货架期模型。结果表明,0~10℃冷藏养殖大黄鱼货架期终点时菌落总数、假单胞菌数、嗜冷菌数和产H2S细菌数分别为6.64~7.60、6.24~6.96、6.16~6.90、6.14~6.62 lg cfu/g,挥发性盐基氮和三甲胺分别为27.15~30.12 mg/100g和8.44~10.83 mg/100g。0、5、8和10℃冷藏大黄鱼的货架期分别为17.8±2.5、9.3±1.1、7.0和5.4±1.3 d,并用于构建指数腐败货架期模型。用0、3、7℃冷藏养殖大黄鱼货架期验证指数腐败货架期模型,相对误差为?6.1%~4.6%,显示该模型可以快速有效预测0~10℃冷藏养殖大黄鱼的剩余货架期。     

福建官井洋大黄鱼AFLP指纹多态性的研究

对福建官井洋大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)野生种群和2个养殖群体进行5对选择性引物(共37个标本)的AFLP分析。结果表明,共检出503个不同的扩增片段(50～450bp),每对引物扩增出的片段数目为76～155个;在5对引物检出的扩增片段中,101个(20.1%)为全部37个受试个体共有,312个(62.0%)为部分野生与养殖个体共有,53个(10.5%)仅见于野生个体,37个(7.4%)仅见于养殖个体,养殖群体中出现野生种群所没有的扩增片段;野生种群、养殖1、养殖2多态片段比例分别为76.6%、70.6%、69.2%,遗传差异度分别为0.2464、0.2322、0.2299,养殖群体多态片段比例与个体间的遗传差异度均低于野生种群。养殖群体的遗传多样性水平较低,遗传变异相对贫乏。     

大黄鱼消化道器官显微与亚显微结构

采用电镜和光镜技术研究大黄鱼消化道的组织结构。大黄鱼舌粘膜上皮为复层扁平上皮，其中含有杯状细胞和味蕾，舌腹面固有膜有浆液性腺泡；食道粘膜上皮为复层扁平上皮，表层扁平细胞下有粘液细胞。胃粘膜上皮为单层柱状，细胞游离端含有大量成熟粘液原颗粒，核周有不同成熟阶段的粘原颗粒，细胞器位于核周及下方，贲门和盲囊部胃小凹处有粘液腺，固有膜含大量胃腺，幽门部没有胃腺；胃腺细胞为矮锥形，细胞内含微管泡系和酶原颗粒，是一种典型的泌酸胃酶细胞。前肠、中肠和后肠粘膜上皮均为单层柱状上皮，其中有许多杯状细胞，肠上皮有密集的微绒毛，侧面有连接复合体，胞内各种细胞器均较丰富。大黄鱼消化道组织结构的特点与消化、吸收作用密切相关。