利用CRISPR/Cas9技术高效创制长粒香型水稻

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为水稻分子育种的重要手段。为了促进水稻育种的发展,本研究以非香型粳稻品种龙粳11为试验材料,对GS3、GS9和Badh2基因进行编辑,以期获得能稳定遗传的长粒香水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以GS3、GS9和Badh2为靶基因,构建敲除载体pYLCRISPR/Cas9-GS3/ GS9/Badh2-gRNA,通过农杆菌介导法,在龙粳11的GS3、GS9和Badh2基因中引入了特定的突变。【结果】T₂代无转基因的gs3/gs9/badh2纯合突变体与野生型龙粳11相比,粒长增加26.43%~27.01%,单株产量增加10.82%~12.11%,千粒重增加18.34%~41.36%,稻米变香,高效地将圆粒水稻变成长粒香型水稻。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得能够稳定遗传并具有长粒香品质的纯合突变株系,为组合多个品质性状提供了一种方便有效的方法,从育种角度加快了新品系创制过程。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻粒长和穗粒数性状

【目的】基因组定点编辑技术已成为分子育种的重要手段。本研究拟对GS3和Gn1a功能缺失突变对目标性状的改良效应进行分析,以期为培育高产水稻提供理论基础。【方法】利用CRISPR/Cas9系统,以控制粒型基因GS3和控制每穗粒数基因Gn1a为编辑对象,构建了共敲除载体p C1300-2×35S::Cas9-g~(GS3)-g~(Gn1a)a,用农杆菌介导法转化4个优质水稻品种,分析了基因突变的特征和相应农艺性状。【结果】构建的敲除载体成功地实现了对GS3和Gn1a基因的定点编辑。在4个转化受体的T_0代均分别获得了gs3和gs3gn1a的移码突变体。对T_1 代中无选择标记突变体的农艺性状分析表明,突变体gs3和gs3gn1a与野生型相比粒长变长,千粒重增加;突变体gs3gn1a与突变体gs3相比,每穗粒数显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9系统进行水稻基因编辑可以快速改良品种的目标性状,在水稻品种的定向改良方面具有巨大的潜力。     

利用CRISPR/CAS9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】香稻作为一类特殊的水稻群体,以其清香可口的品质特性备受消费者的欢迎。到目前为止,水稻中的香味主要受第8染色体上编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2控制。【方法】通过CRISPR/CAS9技术对中花11的香味基因Badh2进行编辑。【结果】获得转基因T_0代植株并对其所衍生的T_1代20个单株进行了鉴定分析,获得了一个剔除了载体骨架且第1外显子上插入一个碱基T的突变体材料。该材料中Badh2 RNA水平显著下调;利用GC-MS技术测定野生型及突变体材料籽粒2-乙酰-1-吡咯啉含量,结果表明突变体材料中的香味物质显著增加;此外,我们还对野生型及T_2代香型植株水稻产量及稻米蒸煮食味品质进行了考查及测定分析,发现除分蘖数及结实率呈现出显著差异外(P0.05),其余各项指标在两组材料间都无显著差异。【结论】通过CRISPR/CAS9技术成功地对水稻香味基因进行了编辑,可为香稻育种提供丰富的理论指导,加快香稻的育种进程。     

应用CRISPR/Cas9技术与分子标记辅助选择创制广东丝苗米新种质

【目的】创制优质香型丝苗米水稻新种质，探索水稻育种改良新途径，助力广东丝苗米品牌建设。【方法】以广东省农业主导品种粤农丝苗(YNSM)与优质稻粤王丝苗(YWSM)为材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑上述品种的香味基因Badh2，创制香稻新品系，随后通过分子标记辅助选择(MAS)技术定向导入GW7/GL7位点，系谱选育优质香型丝苗米水稻新种质。【结果】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功创制两个香稻新品系yn-ko^badh2与yw-ko^badh2，其2-AP含量均极显著提高，达到239.39～440.79μg/kg，而有效穗数、每穗实粒数、糙米外观品质、千粒重与产量等主要农艺性状均未受到显著影响；MAS技术结合系谱选育的方法成功选育两个丰产性好、籽粒长宽比超过4.3的优质香型丝苗米水稻新品系NW^badh2GW7-1与NW^badh2GW7-2，达到广东丝苗米品种关于香味与外观粒型的认定标准。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑与分子辅助选择技术相结合可精准、高效地创制新的优...     

利用CRISPR/Cas9技术编辑粒长基因GS3改善粳稻花时

【目的】花时不遇是影响杂交水稻制种产量的直接因素之一,已有研究表明水稻粒型差异对花时有影响。本研究采用GS3功能缺失突变来研究粳稻花时差异,以期为粒型影响花时提供佐证。【方法】利用CRISPR/Cas9技术来定向编辑控制粒长基因GS3,获得13对粒型差异的近等基因系粳稻,小区种植,采用目测法来调查花时。【结果】获得转基因T0植株并对其T1植株测序分析,发现长白25、吉粳102、浙粳88、武运粳27和J42均发生单碱基插入移码突变,垦鉴稻6号、空育131、浙粳22、扬粳4227、南粳9108、J5933、J6167和J5938均发生部分碱基缺失突变。对T1植株粒型考查表明,gs3突变体的粒长均显著长于野生型。对稳定的后代花时统计分析发现,粒型变长的突变体均比野生型花时有所提前,且吉粳102、空育131、浙粳88、武运粳27、扬粳4227这5个材料的gs3突变体花时均显著早于野生型,其余材料开花也提早,但不显著。【结论】长粒型粳稻GS3突变体的花时早于短粒粳稻野生型,这一研究可为粳稻粒型育种提供参考,加速长粒粳稻亲本选育,有望推动杂交粳稻发展。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑，以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以Pita、Pi21和ERF922为靶基因，构建共编辑载体pC1300-2×35S::Cas9-gPita-gPi21-gERF922 ，用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014，筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。【结果】在T0代转基因株系中，Pita、Pi21和ERF922突变频率分别为75%、85%和65%，突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代，并从中获得Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明，与野生型相比，突变株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此，我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系，为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

[目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 为靶基因,构建共编辑载体 pC1300-2×35S::Cas9-g^Pita-g^Pi21-g^ERF922 ,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。[结果]在T0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922 突变频率分别为 75%、85%和 65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含 T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代,并从中获得 Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。[结论]利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

利用CRISPR/Cas9系统定向编辑水稻SD1基因

【目的】半矮秆水稻品种的选育和应用是水稻育种的最重大成果之一。半矮秆品种大多是半矮秆基因SD1(semi-dwarf1)功能缺失突变体,为了获得sd1突变体,本研究对SD1基因进行了定向编辑。【方法】利用CRISPR/Cas9系统,以SD1基因为靶基因,构建基因编辑载体CRISPR-SD1,用农杆菌介导的方法转化水稻恢复系申繁17和申繁24。【结果】在2个转化受体的T₀代均获得了纯合的sd1突变体,并且在T₁代株系中分离出了不含转基因序列的植株。2个品种的sd1突变体与各自的野生型相比,株高分别下降了25%左右。【结论】利用CRISPR/Cas9系统可以有效地对目的基因进行编辑,在水稻分子育种领域具有巨大的应用价值。     

利用CRISPR/Cas9技术创制高效抗除草剂水稻

【目的】培育抗除草剂品种在水稻育种中具有重要意义。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以黑龙江优质粳稻品种为材料,编辑乙酰乳酸合酶ALS基因,创制具有抗除草剂特性的水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术,以乙酰乳酸合酶ALS为靶基因,构建单碱基突变载体pH-nCas9-PBE-ALS,以松粳22、龙粳46和绥粳18为转化材料,利用农杆菌介导转化获得转基因植株,通过对转基因植株的突变位点进行测序结合除草剂喷施试验,鉴定基因型及表型。【结果】经分子水平检测验证,获得ALS^S627N突变植株10株,ALS^S627N且¹⁸⁸⁴G-A但第628位氨基酸未改变突变植株1株,ALS^S627N/G628E突变植株1株。相较于野生型,以上三类突变植株均具有较强抗除草剂特性。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得具有抗除草剂特性,能够稳定遗传,不含转基因标记的纯合株系,可为抗除草剂水稻育种提供基础材料。     

利用CRISPR/Cas9技术创制抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系

【目的】创制新型抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系，为高产优质杂交水稻选育提供资源。【方法】利用CRISPP/Cas9技术在水稻稻瘟病基因Pi21、温敏不育基因TMS5和香味基因Badh2的第1外显子处设计靶位点，构建多基因表达载体pC1300-2×35S::g^TMS5-g^Badh2-g^Pi21，转化优质常规籼稻品种中早70，测序鉴定分析获得纯合阳性稳定株系。利用稻瘟病喷雾接种和打孔接种方法对稻瘟病基因Pi21的纯合突变株系进行稻瘟病抗性鉴定，利用GC-MS技术对Badh2纯合突变株系的香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量进行测定。【结果】在T₀转基因株系中，Pi21、TMS5和Badh2突变频率分别为87.5%、80.0%和87.5%，突变类型多为双等位突变。从T₁代中筛选不含载体骨架的纯合突变株系，获得两种三突变纯合株系。稻瘟病接种结果表明，与野生型相比，T₂代Pi21纯合变异株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内相关防卫基因的表达量显著上调，ROS积累量也显著增加。tms5纯合变异株系表现出典型的温敏不育特性，TMS5基因的表达水平与野生型相比显著降低，高温下Ub_L404基因的表达水平明显高于野生型。与野生型相比，在Badh2纯合突变体植株中Badh2的表达水平显著下调，并且香味物质2-AP含量极显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功对Pi21、TMS5和Badh2基因同时进行定向编辑，获得了具有高抗稻瘟病的香型温敏不育系，为高抗、香型不育系材料的选育提供参考，加快高产优质杂交水稻的选育。     

利用CRISPR/Cas9技术创制Rc基因恢复红稻

【目的】将栽培稻品种恢复为米质优、抗逆性强的红稻具有较大的研究价值。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，编辑原花青素转录调节因子Rc基因，恢复红种皮特性，以改良水稻米质，提升抗逆性。【方法】利用CRISPR/Cas9技术，以Rc为靶基因，构建突变载体pYLCRISPR/Cas9-Rc-gRNA，以空育180、上育453为材料，转化获得转基因植株，通过测序手段和表型观察验证成果。【结果】分子水平检测获得Rc突变材料2种，其中KY-1在1414―1417 bp缺失4个碱基，终止子突变为苯丙氨酸；SY-1在1411 bp处缺失1个碱基，终止子突变为天冬氨酸。2种编辑材料均恢复为红米表型，且具有一定耐盐碱能力。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得恢复红种皮表型的纯合株系，为红米改良提供基础材料。     

敲除TMS5基因获得温敏不育粳稻新材料

【目的】水稻温敏不育系的选育是两系杂交稻育种工作中的关键环节。TMS5是控制温敏不育的重要基因，在生产上也应用较广。为了加快水稻温敏不育系的选育进程，【方法】利用CRISPR/Cas9技术，在武运粳7号背景下对TMS5基因进行编辑。【结果】通过测序从22株T0代中筛选获得6株纯合的突变体，分析发现6个纯合的突变体产生了相同的遗传变异，都在TMS5基因第2外显子44 bp和45 bp之间插入碱基“A”，导致翻译提前终止。通过细胞学观察和人工辅助授粉证实获得的株系花粉败育而雌配子正常发育。【结论】这些结果表明对温敏不育基因TMS5基因进行编辑可以快速获得粳型温敏雄性不育系。     

Effects of GS3 and GL3.1 for Grain Size Editing by CRISPR/Cas9 in Rice

Grain size is one of key agronomic traits associated with grain yield and grain quality. Both major quantitative trait loci GS3 and GL3.1 play a predominant role in negative regulation of grain size. In this study, a CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing system was used to simultaneously edit GS3 and GL3.1 in a typical japonica rice Nipponbare. In T_1 generation, we found that gs3 formed slender grain with lower chalkiness percentage, while gs3gl3.1 produced larger grain with higher chalkiness percentage. In terms of other agronomic traits, flag leaf size, grain number and grain yield of both gs3 and gs3gl3.1 mutants were affected. It is noteworthy that gs3 and gs3gl3.1 mutants both led to dramatical reduction of grain number, thereby decreased grain yield. In conclusion, these results indicated that knockout of GS3 and GL3.1 could rapidly improve grain size, but probably have some negative influences on grain quality and grain yield.     

敲除TMS5基因获得温敏不育粳稻新材料

【目的】水稻温敏不育系的选育是两系杂交稻育种工作中的关键环节。TMS5是控制温敏不育的重要基因,在生产上也应用较广。为了加快水稻温敏不育系的选育进程,【方法】利用CRISPR/Cas9技术,在武运粳7号背景下对TMS5基因进行编辑。【结果】通过测序从22株T0代中筛选获得6株纯合的突变体,分析发现6个纯合的突变体产生了相同的遗传变异,都在TMS5基因第2外显子44 bp和45 bp之间插入碱基"A",导致翻译提前终止。通过细胞学观察和人工辅助授粉证实获得的株系花粉败育而雌配子正常发育。【结论】这些结果表明对温敏不育基因TMS5基因进行编辑可以快速获得粳型温敏雄性不育系。     

一份水稻OsWOX3B基因敲除突变体的鉴定

【目的】水稻OsWOX3B基因调控叶片形态和表皮毛发育,根据表型被命名为LSY1、DEP、NUDA和GLR1等。深入了解OsWOX3B基因对水稻发育调控的功能具有重要意义。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对籼稻品种R401的OsWOX3B进行基因敲除。对所获材料进行突变位点分析和表型分析,同时进行相关基因的表达分析。【结果】所获材料的OsWOX3B基因的编码区第341位碱基由T变为C,第395–397位碱基缺失,其叶片和颖壳光滑,与突变体dep、nuda、glr1的表型相同,可确认其为Oswox3b突变体。除了与已报道的OsWOX3B的功能缺失突变表型相关外,Oswox3b突变体也有新表型出现。与野生型R401相比,突变体Oswox3b表现为生育期延长、分蘖数减少、叶片变宽、稻穗变长和每穗粒数增多。同时,突变体Oswox3b的剑叶维管束增多,小维管束间距增大,2个水稻侧生器官发育相关基因在突变体Oswox3b中的表达变化也与其表型变化一致。【结论】鉴定了一个新的水稻OsWOX3B基因突变体,其影响水稻侧生器官发育。     

生长素调控因子OsGRF4协同调控水稻粒形和稻瘟病抗性

【目的】水稻粒形为多基因控制的复杂数量性状,同时影响稻谷产量和稻米外观及碾磨品质,挖掘粒形相关基因并解析其遗传机制,对于水稻高产和优质品种选育具有重要意义。【方法】以前期利用大粒籼稻品种特大籼(TDX)为供体亲本、小粒粳稻品种日本晴(Nipponbare,NPB)为轮回亲本获得的一个大粒近等基因系,在水稻第2染色体上初定位粒形调控基因GS2.2(grain size 2.2)的基础上,对GS2.2基因进行了精细定位和候选功能基因的克隆鉴定。【结果】利用BC₄F₂群体中2887份极小粒单株及该群体中70份基因型杂合的大粒单株自交获得的BC₄F₃群体,将GS2.2基因精细定位在2M-7-1与2M-9之间的160.6 kb的区间内。该区间编码18个基因开放阅读框(ORF1-18)。测序发现ORF18基因在大粒近等基因系与小粒日本晴等位基因间存在5个SNP差异,ORF18编码生长素调控因子蛋白OsGRF4。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大粒近等基因系中ORF18进行敲除,发现ORF18敲除株系粒长变短,证实ORF18是GS2.2的功能基因。进一步对ORF18大粒近等基因系和基因编辑敲除株系进行稻瘟菌室内离体和病圃接种鉴定,发现ORF18大粒近等基因系稻瘟病抗性增强,而基因编辑敲除株系稻瘟病抗性减弱,表明ORF18正调控水稻稻瘟病抗性。【结论】本研究发现的生长素调控因子OsGRF4协同调控水稻粒形和稻瘟病抗性,为协调水稻高产和抗性育种提供了重要的基因资源。     

Progress of CRISPR/Cas9 technology in breeding of Brassica napus

Gene editing technology provides important technical basics for the research in plant functional genes and crop genetic improvement. CRISPR/Cas9-mediated gene editing is an effective experimental tool for crop genome directed editing in recent years, which has been widely used in many crops as rice, wheat and other crops. CRISPR/Cas9 system was expected to be a powerful experimental tool in genetic improvement and molecular design breeding of rapeseed. This paper, which based on the development history and the latest research of CRISPR/Cas9-mediated gene editing technology in rapeseed, summarized the progress of CRISPR/Cas9 including plant type improvement, yield traits, quality improvement, disease and stress resistance improvement, yellow seed creation and other utilizes at present. The application scope, development direction and target analysis method of this technology in rape were focused. The problems of CRISPR/cas9 system in rapeseed breeding were analyzed and the improvement strategies were discussed. Finally, views on direction of rapeseed breeding by gene editing were emphasized.     

利用CRISPR/Cas9技术编辑粒长基因GS3改善粳稻花时

【目的】花时不遇是影响杂交水稻制种产量的直接因素之一,已有研究表明水稻粒型差异对花时有影响。本研究采用GS3功能缺失突变来研究粳稻花时差异,以期为粒型影响花时提供佐证。【方法】利用CRISPR/Cas9技术来定向编辑控制粒长基因GS3,获得13对粒型差异的近等基因系粳稻,小区种植,采用目测法来调查花时。【结果】获得转基因T₀植株并对其T₁植株测序分析,发现长白25、吉粳102、浙粳88、武运粳27和J42均发生单碱基插入移码突变,垦鉴稻6号、空育131、浙粳22、扬粳4227、南粳9108、J5933、J6167和J5938均发生部分碱基缺失突变。对T₁植株粒型考查表明,gs3突变体的粒长均显著长于野生型。对稳定的后代花时统计分析发现,粒型变长的突变体均比野生型花时有所提前,且吉粳102、空育131、浙粳88、武运粳27、扬粳4227这5个材料的gs3突变体花时均显著早于野生型,其余材料开花也提早,但不显著。【结论】长粒型粳稻GS3突变体的花时早于短粒粳稻野生型,这一研究可为粳稻粒型育种提供参考,加速长粒粳稻亲本选育,有望推动杂交粳稻发展。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑AFP1基因提高水稻耐逆性

目的 为鉴定水稻AFP1在非生物胁迫响应中的作用,创制非生物胁迫抗性的水稻新材料。方法 以优异籼稻恢复系华占为转化受体,利用CRISPR/Cas9技术创制afp1突变体,并对afp1突变体的耐逆性进行初步鉴定。结果 AFP1靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67%和75.00%。所有突变株系中,突变类型仅有插入和缺失突变,90%突变株系的突变长度为小片段突变（<5bp）。获得了6种无转基因成分的afp1纯合突变体。正常条件下,afp1突变体株高和结实率降低,有效分蘖增加,穗长显著升高,单株产量在-4.06%和11.75%之间变化。和野生型相比,afp1突变体的ABA敏感性和叶片水分散失率降低,耐干旱、热和渗透胁迫能力提高。结论 编辑AFP1基因可提高水稻多种非生物胁迫抗性。