茉莉酸甲酯对橡胶树花药愈伤乳管细胞分化的影响

橡胶树老化的愈伤组织存在乳管细胞。茉莉酸甲酯（MeJA）与茉莉酸（JA）同属茉莉酸类物质（JAs），但MeJA对橡胶树愈伤乳管细胞分化的效果尚不清楚。系统研究MeJA对橡胶树愈伤乳管细胞分化的效果，结果发现，低浓度的MeJA(0～1 mg/L)对花药愈伤组织的生长影响不明显，而高浓度的MeJA(2～3 mg/L)会抑制愈伤组织生长，且MeJA浓度与愈伤组织生长呈负相关关系。组织化学制片结果显示，低浓度的MeJA能显著提高愈伤乳管细胞发生频率，其中浓度为1 mg/L效果最佳；而高浓度的MeJA则会降低其发生频率。荧光定量PCR结果显示，培养基中添加MeJA后SRPP、REF、CPT等与橡胶生物合成相关的重要基因的表达量在愈伤组织中变化趋势与愈伤乳管细胞发生频率的变化趋势基本一致，进一步证实MeJA能促进愈伤乳管细胞分化。透射电镜观察发现愈伤乳管细胞内含有橡胶粒子、黄色体等细胞器。研究结果对促进橡胶树愈伤组织在乳管分化研究中的应用，以及开发新型橡胶树增产刺激剂，促进橡胶树天然橡胶的生产具有一定意义。     

巴西橡胶树剥皮再生及乳管发生的研究

用光学显微镜技术研究了巴西橡胶树剥皮再生过程中的组织分化和乳管发生。研究结果表明：（１）巴西橡胶树茎干小面积剥皮后,新皮再生经过愈伤组织形成和维管形成层发生２个阶段。愈伤组织由靠近伤口表面未成熟的木薄壁组织细胞和木射线细胞分裂产生,维管形成层在愈伤组织内层发生,且是一个渐进的过程。（２）愈伤组织细胞不能分化形成乳管细胞,新生皮中最初形成的乳管组织从新形成的维管形成层细胞分裂产生,成列分布,并具有不     

巴西橡胶树胶乳黄色体中多酚氧化酶的活性及其橡胶粒子凝集作用的研究

橡胶粒子凝集在乳管伤口堵塞中起重要作用,研究胶乳中橡胶粒子凝集相关蛋白对于阐明乳管伤口堵塞机制具有重要的意义。对巴西橡胶树初生乳管和次生乳管胶乳黄色体中的多酚氧化酶活性进行了检测,并分析了多酚氧化酶对橡胶粒子凝集的影响。结果表明,初生乳管和次生乳管胶乳的B-乳清蛋白种类有明显差异,但B-乳清都有较高的多酚氧化酶（PPO）活性和具有明显的凝集橡胶粒子的作用。标准PPO也具有凝集橡胶粒子的效应。DTT对标准PPO的活性具有明显的抑制效果,并抑制其对橡胶粒子的凝聚作用。本研究首次证明巴西橡胶树的初生乳管和次生乳管的胶乳黄色体中都含有PPO蛋白,PPO是有效凝聚橡胶粒子的蛋白质成分之一,为深入研究乳管伤口堵塞机制奠定了基础。     

外源茉莉酸诱导巴西橡胶树乳管分化的酶学研究（I）

以巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Mull.Arg.）无性系热研7-33-97芽条增殖苗圃中具有3篷稳定叶的萌条和橡胶树无性系RRIM600成龄树为材料，研究外源茉莉对萌条树皮组织的脂氧合酶、苯丙氨酸解氨酸、过氧化物酶的活性与过氧化物酶同工酶以及对成龄树胶乳和树皮组织脂氧合酶活性的影响。结果表明，⑴外源茉莉酸处理使橡胶树7-33-97萌条第1篷（顶篷）叶和第3篷叶伸长单位树皮组织的脂氧合酶活性升高，外源茉莉酸与脂氧合酶抑制剂去甲二氢愈伤酸（nordigyroguaiaretic acid,NDGA）一起作用时可降低外源茉莉酸对脂氧合酶的诱导效应，并相应地抑制了外源茉莉酸刺激橡胶树乳管分化的作用；⑵外源茉莉酸可显地诱导成龄开割橡胶树RRIM600胶乳的脂氧合酶活性，而对其树皮组织的脂氧合酶活性几乎没有影响；⑶外源茉莉酸大幅度地提高了橡胶树7-33-97萌条第1篷叶和第3篷叶伸长单位树皮组织的茉丙氨酸解氨酶活性；⑷外源茉莉酸处理中，橡胶树7-33-97萌条第1篷叶和第3篷叶伸长单位树皮组织的过氧化物酶对外源茉莉酸的反应不同，即外源茉莉酸对萌条第3篷叶伸长单位树皮组织的过氧化物酶活性及其同工酶谱没有影响，但使萌条第1篷叶伸长单位树皮组织的过氧化物酶活性升高，其同工酶谱也发生了相应的变化。因此，橡胶树萌条次生乳管的分化与树皮组织脂氧合酶和苯丙氨酸解氨酸活性的变化具有一定的联系，而与过氧化物酶可能无关。提出了“外源茉莉酸与机械伤害是通过对橡胶树内源茉莉酸的诱导作用而刺激橡胶树乳管分化”的假说。     

巴西橡胶树HbCCoAOMT基因克隆及其表达分析

木质素是植物细胞壁的成分之一,其含量高低影响到细胞壁的弹性。橡胶树乳管膨压是割胶后胶乳排出的初动力,乳管细胞壁的物理性能可能是影响乳管膨压的因素之一。本研究采用QRT-PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97的乳管细胞中克隆到一个木质素合成关键酶CCo AOMT基因的同源基因,命名为HbCCoAOMT。该基因的开放阅读框为741 bp,编码1个由246个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为27.76 ku,理论等电点为5.255。实时荧光定量PCR结果表明,割胶和乙烯利处理均下调HbCCoAOMT基因在胶乳中的表达。该基因的表达量以及内层树皮的木质素含量在两个橡胶树品种(CATAS8-79和PR107)间存在显著差异。HbCCoAOMT差异表达可能影响到乳管细胞木质素含量和乳管细胞壁的物理性能。     

季节、采胶和外源茉莉酸对成龄橡胶树乳管分化的影响

橡胶树树干树皮中的乳管列数目与橡胶产量密切相关。为了建立成龄橡胶树乳管分化的调控技术,笔者采用实验形态学的手段,研究季节、采胶和外源茉莉酸对成龄橡胶树乳管分化的影响。结果表明,在海南岛自然条件下,乳管分化开始于6~7月份,在11月~翌年的5月没有乳管分化;割胶包括正式割胶前的预割能显著提高橡胶树形成层分化乳管的能力,其影响的范围相当大;外施茉莉酸对未开割树和割胶树的乳管分化都有促进作用。这些知识对于发展高效合理的采胶技术可能具有指导意义。     

外源JA的移动对巴西橡胶树萌条次生乳管分化的诱导效应

利用碘-溴染色法结合石蜡切片技术,研究移动的JA(Jasmonic Acid,茉莉酸)对橡胶树萌条次生乳管分化的诱导效应。结果表明:在自然条件下,第一和第二叶蓬均无次生乳管分化,但第一叶蓬经0.07%JA处理,40 d后在施用部位、施用部位上下5 cm、10 cm处及远离施用部位的下一叶蓬均有次生乳管分化,该乳管细胞大小相近,离形成层区的远近相似,可见这些乳管是同期被诱导出来的,外源JA的移动是施用部位之外的茎皮分化次生乳管的原因。同一萌条的不同叶蓬同时施加JA比单叶蓬施加JA更易诱导次生乳管,表明移动的JA诱导乳管分化具有叠加效应和剂量效应。本研究为茉莉酸的信号传导及诱导橡胶树乳管分化机制的深入研究奠定基础。     

巴西橡胶树次生乳管分化能力早期预测的相关基因初步研究

目前通过常规的试割测产进行橡胶树产量育种的方法,周期长且效率低,亟须改进。橡胶树次生乳管分化能 力是决定橡胶产量的关键因子之一,因此,次生乳管分化能力的早期预测对缩短橡胶树产量育种周期具有重要意义。 本研究采用分子生物学技术,割胶处理不同次生乳管分化能力等级的橡胶树种质的杂交后代,对水囊皮组织中的茉莉 酸生物合成关键酶基因、茉莉酸途径关键环节基因和橡胶生物合成关键酶基因等 20 个基因的表达模式进行分析,并将 基因表达与橡胶树种质次生乳管分化能力等级进行相关性分析。结果发现：茉莉酸生物合成关键酶基因 HbAOCa 和橡 胶生物学合成关键酶基因 HbHevb7 在割胶处理后上调表达,且与橡胶树种质的次生乳管分化能力等级相关性较好。该 方法可用于区分橡胶树种质间次生乳管分化能力的差异。研究结果不仅可以夯实橡胶树种质的乳管分化能力的早期预 测方法,而且可为开发次生乳管分化能力的相关分子标记提供理论基础。     

巴西橡胶树割胶树皮伤口的组织学和组织化学的变化

用光学显微镜技术和组织化学方法研究了巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell．Arg．）割胶树皮伤口的变化，并测定了乳管中重要的防卫蛋白质几丁质酶在树皮伤口的积累和消失。结果表明，割胶诱导割口树皮组织产生伤害反应使割口得到保护。割口树皮依次出现3种防卫机制：（1）乳管预先形成的物理和化学防卫物质（橡胶粒子和包括几丁质酶在内的防卫蛋白质）在树皮伤口表面和乳管伤口末端的积累；（2）伤口周围的组织形成的化学防卫物质单宁、木质素和木栓质等；（3）在较长时间停止割胶（如冬季停割）时形成防卫结构创伤周皮。前两种防卫机制的作用是暂时的，只有最后创伤周形成时，树皮伤口才能得到充分有效的保护。     

巴西橡胶树乳管分化的研究

巴西橡胶树的乳管组织，是决定橡胶产量的是最重要的结构成份。人们一直从两个方面来研究乳管分化，即乳管分化的细胞学和植株内外固子对乳管分化的影响。我们认为，在这些研究中，最值得注意的结果，是采胶对乳管分化的影响。有证据表明，排胶促进乳管分化和原有全部成熟乳管的死亡或去除导致形成密集乳管。据此，我们假定在已有的成熟乳管中存在有抑制将来乳管分化的物质。我们相信，这一假定是深入研究这分化的一个可能的途径。     

橡胶树树皮miRNA定量表达分析的内参筛选

世界所需天然橡胶主要来自橡胶树，橡胶树的乳管是合成和储存天然橡胶的组织，树干树皮中的次生乳管与天然橡胶生产密切相关，由维管形成层分化而来。次生乳管数量与天然橡胶产量呈显著正相关。因此，乳管分化是天然橡胶生产面临的一个重大理论课题。植物miRNAs是一类长约20~24个核苷酸的非编码小RNA分子，通过介导基因沉默在植物生长发育、细胞分化及逆境适应中起着非常重要的调节作用。橡胶树乳管分化过程中差异miRNAs的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR（qPCR）已广泛用于miRNA的定量表达分析，选择合适的miRNA内参对于准确进行miRNA的表达定量至关重要。本研究以冠菌素（coronatine, COR）诱导橡胶树萌条分化次生乳管的实验系统，采用小RNA Poly A加尾的qPCR技术分析COR处理对形成层区3个非编码RNA（U6 snRNA、5S rRNA、18S rRNA）和6个miRNA（hbr-miR159b、hbr-miR396b、miR169-x、miR172-y、miR535-x、miR894-x）候选内参的表达稳定性的影响。geNorm和NormFinder软件的联合分析结果显示，表达稳定性最高的是hbr-miR396b和miR894-x，稳定性较差的是U6 snRNA。hbr-miR396b和miR894-x可作为合适的内参基因，用于分析COR影响下的miRNA相对定量表达，为鉴定橡胶树次生乳管分化相关的差异表达miRNAs奠定良好基础。     

橡胶树1981’IRRDB野生种质预割诱导次生乳管分化的比较分析

巴西橡胶树树干树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要组织,次生乳管列的多少与胶乳产量密切正相关。割胶是天然橡胶生产中的核心环节,是当前获得天然橡胶的唯一途径,而割胶伤害能诱导次生乳管分化。采用碘-溴染色方法和石蜡切片技术,观察预割前后1981’IRRDB野生种质成龄树的树皮结构,对不同种质预割前后黄皮层和水囊皮区域的乳管列进行统计,并分析新分化的次生乳管列。研究结果表明,选取的85份8年生野生种质在自然条件下的乳管分化能力普遍较弱,黄皮层和水囊皮中成列的次生乳管数量均较少,2个部位合计乳管列数普遍低于8列。预割后不同种质水囊皮中次生乳管列数普遍增多,但黄皮层尚无明显变化。根据伤害诱导分化新的次生乳管列数的多少,将预割诱导乳管分化的能力由低到高分为1、2、3级,分别对应于新分化乳管列数为少于2列、2~3列(含2列)、3~4列（含3列）。在85份种质中,对应1级57份、2级23份、3级5份的种质,所占比例分别为67.06%、27.06%、5.88%,可见,诱导分化次生乳管能力强的种质占比较低,大部分种质为1、2级乳管分化,3级分化能力的种质极少。被诱导新分化次生乳管的能力与种质在自然条件下的分化能力有关,尤其是高乳管分化能力的种质通常在自然条件下也有较强的分化乳管的能力。通过预割判断乳管分化能力不仅为野生种质鉴定和评价奠定基础,也为橡胶树高产育种以及早熟、晚熟品种的早期预测提供有效指标。     

橡胶树1981′ IRRDB野生种质苗期初生乳管分化的研究

巴西橡胶树的乳管是产生和贮存天然橡胶的组织。成龄树树干中的次生乳管因与割胶生产直接相关得到了全面的研究,而幼茎、叶初生生长形成的初生乳管因与天然橡胶生产没有直接关系研究相对较少。利用光学显微技术以及Image J统计分析软件,对182份1981’IRRDB野生种质苗期的初生乳管分化进行了研究。结果表明,不同种质叶片以及绿色茎皮中的初生乳管分化能力存在明显差异;而同一种质小叶柄和茎皮中的初生乳管分化能力也并不完全一致。在这182份种质中,小叶柄初生乳管面积比例在0.08%~2.6%范围内,但1%以上的种质数量仅占总数的30.8%;在茎皮中,初生乳管面积百分比在1.3%~13.3%范围内,但7.5%以上的种质数量仅占总数的19.2%,可见,野生种质初生乳管分化能力普遍较低。来源于不同州的野生种质乳管分化能力存在明显差异,由强到弱分别是朗多尼亚州(RO/)、阿克里州(AC/)、马托格罗索州(MT/)以及其他非主选区域,其中,朗多尼亚州(RO/)可能更容易筛选到优良的种质。研究结果可为将来种质的引进以及灌木化栽培种质的选育提供依据。     

形成层活动对机械伤害诱导巴西橡胶树次生乳管分化的影响

为了进一步优化机械伤害诱导次生乳管分化的实验系统,采用实验形态学的方法,分析了形成层的季节性活动、新梢和顶芽的发育状态以及伤害程度对机械伤害诱导巴西橡胶树萌条次生乳管分化的影响。结果表明,橡胶树萌条的形成层活动具有明显的休眠期和活动高峰期。在形成层活动的高峰期,小面积的机械伤害容易诱导淡绿期和稳定期萌条分化次生乳管,而且稳定期萌条次生乳管分化程度显著大于淡绿期萌条。但在形成层活动的休眠期,小面积的机械伤害不能诱导萌条的次生乳管分化。新梢和顶芽发育状态对机械伤害诱导次生乳管分化程度的影响都与形成层的季节性活动密切相关。大面积的机械伤害抑制次生乳管分化,可能与伤害部位的形成层细胞分裂活性受抑制有关。     

橡胶树枝条初生乳管形态发育研究

橡胶树的初生乳管主要存在幼嫩树干、枝条、叶片、花和果实中,其发育过程依然不清楚。本研究利用石蜡制片和改良的碱处理剥离2种方法研究了幼嫩枝条初生乳管的形态发育过程,发现碱处理剥离法能观察到乳管从起源到发育成熟的连续过程,优于石蜡制片。采用碱处理剥离法系统研究橡胶树枝条不同发育时期初生乳管形态特征。从古铜期枝条不同部位分离的乳管形态差异较大,顶端分生组织附近的乳管呈线性长管状、不分支、无隔,外凸结构不明显;距顶端7 cm左右的乳管具有明显的外凸结构或珠状结构;距顶端14 cm处的乳管明显增粗,相邻乳管间外凸结构联结贯通形成乳管桥,最终形成网状结构。稳定期枝条各部位的乳管形态趋同,外凸或珠状结构的密度和乳管桥的密度均显著高于古铜期枝条对应的部位,都形成了复杂的网络结构。同时发现初生乳管是多核的。本研究结果表明橡胶树枝条初生乳管为无节联结乳管,是一种新的乳管类型。本研究对植物乳管发育研究有重要意义。     

橡胶树魏克汉种质成龄树经预割诱导后次生乳管分化的比较

巴西橡胶树树干中次生乳管列的多少与胶乳产量密切正相关,而割胶伤害能诱导次生乳管分化。分析不同魏克汉种质成龄树在预割伤害后树皮次生乳管的分化,不仅为不同种质鉴定和评价提供依据,也为成龄大树割胶后次生乳管分化能力提供预测。采用碘-溴染色方法和石蜡切片技术,对不同种质材料新分化的次生乳管进行了统计分析。研究结果表明,选取的110份魏克汉种质预割后新分化的次生乳管列数不同,具有明显的种质特征。根据分化次生乳管列数的多少,将预割诱导乳管分化的级别由低到高分为1、2、3、4级。在110份种质中,对应1级32份、2级49份、3级24份和4级5份的种质,所占比例分别为29.09%、44.55%、21.82%和4.55%,可见,分化能力强的种质占比较低,大部分种质为2级乳管分化。国外直接引种和国内自主选育的种质在预割诱导分化能力上也存在差异。在110份种质中,国外引种58份种质中对应分化能力1、2、3、4级的种质占比分别为29.31%、44.83%、22.41%以及3.45%;国内选育的52份种质中对应1、2、3、4级的种质占比分别为28.85%、44.23%、21.15%和5.77%;可见,国内选育种质受预割诱导乳管分化的能力优于国外引种的种质,尤其是4级分化能力的种质比例明显高于国外引种的种质。不同系列来源的种质乳管分化能力也存在差异,其中,国外PB、RRIM和RRIC系列和国内的大岭、海垦和大丰系列表现出较强的乳管分化能力。比较分析2个杂交组合后代的乳管分化情况发现,PB86×PR107的4份子代中次生乳管有3份为3级,1份为4级,后代表现出较强的乳管分化能力;而RRIM600×PR107的6份子代中1级2份,2级2份,3级2份,可见其后代乳管分化能力略差。PB86和PR107后代的乳管分化表现出较强的双超亲现象,可作为优良的育种亲本。通过预割判断乳管分化能力不仅为魏克汉种质鉴定和评价奠定基础,也为橡胶树高产育种以及早熟、晚熟品种的早期预测提供有效指标。     

利用电激共转化法转化橡胶树悬浮细胞的初步研究

利用电激转化法对橡胶树悬浮细胞系进行转化,初步确定卡那霉素的筛选浓度、共转化的实验条件。通过电激共转化法将NPTII、GUS、EGFP和Hb CBF1基因成功导入到橡胶树悬浮细胞并整合到基因组中。通过卡那霉素抗性筛选、GFP荧光观察和PCR验证等方法,确定外源DNA片段转化成功。共筛选得到95个抗性愈伤组织,其中9个愈伤组织经过PCR验证确定整合有外源DNA片段,1个愈伤组织共转化有NPTII和GUS基因。此结果表明电激共转化法可成功应用于橡胶树悬浮细胞转化操作。     

5个自主培育橡胶树无性系适应性初探

为筛选橡胶树自育优良新品种,以5个自主培育无性系为研究材料,结合历年的风、寒害调查资料,对无性系的生长、乳管分化和抗性等性状展开系统的早期鉴定,结果表明:热试87-1和热试87-4整体表现良好,生长较快,乳管分化能力优于对照,抗风性、抗寒性较好,需要重点关注。热试87-5抗逆性突出,但乳管分化能力较弱;热试93-5和热试87-6生长较快,乳管分化能力强,但抗风性和抗寒性表现较差。因橡胶树较长的生长周期及我国多变的植胶区环境类型,上述结论尚需进一步验证。