Ghrelin对小鼠不同来源胚胎体外发育的影响及其受体的表达模式

为探明Ghrelin及其受体Ghsr-1a在早期胚胎发育中的作用,以小鼠体内受精、体外受精和孤雌激活胚胎为研究对象,在其体外发育过程中添加不同浓度Ghrelin,观察胚胎发育效率;通过免疫荧光染色和荧光定量PCR,观察不同时期胚胎中Ghsr-1a的变化。结果表明,体内受精胚体外发育中添加0.1 ng/m L Ghrelin显著降低了囊胚率(P0.05),添加1 ng/m L的Ghrelin显著降低了小鼠体外受精胚的囊胚率(P0.05)。在体内受精胎中,Ghsr-1a的mRNA表达水平在4细胞显著高于其他时期(P0.05);体外受精胚中,Ghsr-1a的mRNA水平在8细胞前无明显差异,桑椹胚和囊胚显著下降(P0.05)。在孤雌激活胚胎中,Ghsr-1a的mRNA表达水平从2细胞到8细胞显著降低,之后到囊胚期开始显著升高,其蛋白表达模式与mRNA表达模式相反。Ghsr-1a在体内受精和体外受精胚胎中的表达相似,囊胚期表达量最低。结果提示,Ghrelin能够抑制体内和体外受精胚的体外发育,不同来源胚胎Ghsr-1a mRNA和蛋白表达模式均不相同。研究结果为进一步探索Ghrelin在胚胎发育中的作用机制提供了试验基础。     

2种化学激活方法制备的小鼠孤雌胚胎早期发育指标比较研究

为了寻找一种更健康、更有效地制备孤雌胚胎的方法,进而从根本上提高哺乳动物孤雌胚胎、体外受精胚胎及核移植胚胎成活率并减少孤雌胚胎、核移植胚胎出生后发生潜在疾病与缺陷的几率。通过比较2种不同化学激活方法（试验组I：7%乙醇+2 mmol/L 6DMAP;试验组II：7%乙醇+2 mmol/L 6 DMAP+5 μg/mL CB）制备的小鼠孤雌胚胎由卵母细胞激活到发育至囊胚的时间、囊胚形态及囊胚细胞数目,初步研究了不同化学方法制备的小鼠孤雌胚胎在形态学及细胞水平上的差异性。结果表明：试验组I与试验组II相比,前者比后者卵裂率稍高,桑葚率、不同时间段的囊胚率稍低,但两组间数据差异不显著(64.9 vs73.7,P>0.1;31.7 vs28.8,P>0.1;8.7 vs5.5,P>0.1)。2种方法所得的孤雌囊胚在形态上相似,但是试验组II囊胚细胞数要比试验组I囊胚细胞数稍少(67vs50,P>0.1);两组囊胚的细胞数与受精囊胚相比没有显著差异(67vs50vs65,P>0.1)。选用的2种化学方法制备的小鼠孤雌胚胎,在由卵母细胞发育至囊胚的时间、囊胚形态及囊胚细胞数目方面没有显著差异。     

程序化冷冻前后小鼠休眠胚胎中Apol8蛋白分布和表达

旨在研究小鼠孵化囊胚和休眠胚胎程序化冷冻前、后Apol8蛋白定位和相对表达量变化。通过超排技术获取小鼠体内孵化囊胚,通过小鼠延迟着床模型获取休眠胚胎,通过Confocal显微镜和Western Blot技术对孵化囊胚和休眠胚胎程序化冷冻前后Apol8蛋白的分布和表达进行检测。结果表明:作为抗冻潜力蛋白,在程序化冷冻前、后孵化囊胚和休眠胚胎Apol8均有表达。程序化冷冻后孵化囊胚中Apol8的表达量是冷冻前1.2倍(P0.01),程序化冷冻后休眠囊胚中Apol8的表达量是冷冻前2.0倍(P0.01),程序化冷冻后休眠胚胎Apol8表达量是冷冻后孵化囊胚的1.25倍(P0.01)。程序化冷冻后休眠胚胎Apol8相对表达量变化明显大于孵化囊胚,Apol8蛋白具有作为新型哺乳动物源抗冻蛋白的潜力。     

母源性印记基因在牛早期胚胎中的表达

为研究母源性印记基因Magel2、Sgce、SNRPN在牛早期胚胎中的表达规律,初步判定其印记发生的阶段。利用Real-time PCR技术,检测了这3个基因在牛孤雌激活 (Parthenogenetic Activation,PA) 胚胎和体外受精(In vitro Fertilization,IVF)胚胎中的表达水平。结果表明：在牛IVF和PA 2种胚胎间,3个母源性印记基因的印记表达模式明显不同,Magel2在牛IVF胚胎各阶段都有表达,而在PA胚胎中没有检测到表达信号;Sgce在牛IVF胚胎各阶段都有表达,而只在PA胚胎的2~4细胞阶段检测到表达,在其他发育阶段均没有表达;SNRPN在牛IVF胚胎各阶段都有表达,而只在PA胚胎的2细胞和囊胚阶段检测到很微弱的表达。实验结果表明,母源性印记基因Magel2、Sgce、SNRPN的正常表达对牛早期胚胎发育具有重要作用。     

卵泡液对牛卵母细胞发育潜力的影响

为了确定卵泡液(直径大于10 mm)对卵母细胞成熟的影响,共收集1759枚卵母细胞进行试验。在成熟液中分别添加0%,10%,30%和50%的卵泡液(bFF, bovine follicular fluid ),成熟培养24h后,孤雌激活或者体外受精和胚胎培养;对比10% bFF和10% 胎牛血清（FBS）,以及观察微滴培养对卵母细胞成熟的影响。结果表明,在孤雌激活组中,bFF浓度对卵裂率的影响差异不显著,但胚胎囊胚发育率高于对照组（P<0.05）;在体外受精组中随着bFF浓度增加而卵裂率下降(P<0.01),而且囊胚率也下降(P<0.05)。在10%的bFF组中,孤雌激活囊胚率和体外受精囊胚率分别为47.1% 和38.0%,囊胚扩张率显著高于其它组。从试验得出,添加10% bFF有利于卵母细胞胞质成熟,且不会降低到受精率,而且可以替代FBS;微滴培养不利于卵母细胞成熟。     

血管内皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响研究

为了探讨适宜浓度的(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)对猪卵母细胞体外成熟的影响,以提高猪卵母细胞的成熟效果进而促进胚胎的后期发育,以期为进一步改善猪卵母细胞体外成熟体系提供参考。本研究通过在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的VEGF,成熟培养液(TCM199+BSA)中分别添加0 ng/mL VEGF对照组、5 ng/mL VEGF试验组Ⅰ、50 ng/mL VEGF试验组Ⅱ、500 ng/mL VEGF试验组Ⅲ的卵母细胞成熟培养后,经孤雌或体外受精和体外培养。结果表明：（1）试验组Ⅰ极显著地提高了猪卵母细胞的成熟率,试验组Ⅱ显著提高了猪卵母细胞的成熟率;（2）成熟的卵母细胞经孤雌激活和体外培养后,试验组Ⅰ极显著提高了孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。试验组Ⅱ显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、极显著的提高了囊胚率;（3）成熟的猪卵母细胞经体外受精和体外培养后,试验组Ⅰ显著地提高了体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率,试验组Ⅱ显著地提高了体外受精的卵裂率、极显著地提高了囊胚率。5 ng/mL或50 ng/mL的VEGF,有利于促进猪卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育。     

体外成熟培养时间对牛卵母细胞孤雌发育的影响

为了探讨牛卵母细胞体外成熟培养时间对孤雌胚胎发育的影响,通过比较18.5、22和25.5 h等3个不同成熟培养时间下孤雌胚的卵裂率和囊胚率,从而确定较为理想的体外成熟培养时间。试验结果发现,体外不同成熟培养时间下卵母细胞的孤雌卵裂率之间并无显著差异,虽然体外培养22 h卵母细胞的孤雌卵裂率稍稍高于体外培养18.5 h和25.5 h卵母细胞的孤雌胚卵裂率,但差异不显著;而不同成熟培养时间下卵母细胞的孤雌囊胚率之间存在着显著的差异,体外成熟培养22 h卵母细胞的孤雌囊胚率显著高于其它两组。该结果证明卵母细胞体外培养时间是影响孤雌胚发育的一个重要因素,体外培养时间过长或过短都会对孤雌胚今后的发育产生不利影响。     

组织蛋白酶抑制剂E-64对猪卵母细胞体外发育能力的影响

为探明外源性组织蛋白酶抑制剂(E-64)对猪卵母细胞体外发育能力的影响,通过向成熟液中添加1、5、10μmol/L的外源性组织蛋白酶抑制剂,对猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟培养46 h,统计第一极体率,随后分别进行体外受精和孤雌激活,统计第2天的卵裂率和第7天的囊胚率。结果表明,成熟液中加入1μmol/L E-64的第一极体排出率显著高于未添加的对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组。将体外成熟的卵母细胞进行体外受精及孤雌激活,体外受精后胚胎的卵裂率与囊胚率结果均为成熟液中加入1μmol/L E-64的添加组显著高于对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组;孤雌激活后,4组间胚胎的卵裂率差异不显著,囊胚率为10μmol/L E-64的添加组显著低于其他3组。因此1μmol/L E-64能促进猪卵母细胞的核成熟,并能进一步提高其体外受精后的卵裂率和体外培养的囊胚率。     

大豆MYB转录因子基因GmMYBJ6和GmMYBJ7的克隆及表达分析

MYB转录因子以保守的DNA结合域为共同特征, 是植物最大的转录因子家族之一, 广泛参与植物代谢调控。本文根据植物中MYB转录因子的DNA保守结构域, 通过RT-PCR和RACE的方法从大豆品种吉林3号的叶片中分离得到了2个MYB基因GmMYBJ6和GmMYBJ7, 并对其结构特征和表达特性进行了分析鉴定。基因组DNA序列分析表明, 两个基因都含有两个内含子; 酵母系统检测表明, 两个基因均具有转录激活活性; β-半乳糖甘酶活性分析表明, 内含子的存在使两个基因的转录激活活性明显降低; 实时荧光定量PCR检测结果显示, GmMYBJ6在大豆中的表达受ABA、GA3和NAA的诱导, 而GmMYBJ7的表达则受ABA和NAA的诱导; 半定量RT-PCR分析表明, 两个基因在大豆的根、茎、叶、花和未成熟种子中均有表达。GmMYBJ6和GmMYBJ7为典型的R2R3-MYB转录因子新基因; 他们在大豆中的表达可能与ABA和NAA的信号转导途径有关。     

大豆MYB转录因子基因GmMYBJ6和GmMYBJ7的克隆及表达分析

MYB转录因子以保守的DNA结合域为共同特征, 是植物最大的转录因子家族之一, 广泛参与植物代谢调控。本文根据植物中MYB转录因子的DNA保守结构域, 通过RT-PCR和RACE的方法从大豆品种吉林3号的叶片中分离得到了2个MYB基因GmMYBJ6和GmMYBJ7, 并对其结构特征和表达特性进行了分析鉴定。基因组DNA序列分析表明, 两个基因都含有两个内含子; 酵母系统检测表明, 两个基因均具有转录激活活性; β-半乳糖甘酶活性分析表明, 内含子的存在使两个基因的转录激活活性明显降低; 实时荧光定量PCR检测结果显示, GmMYBJ6在大豆中的表达受ABA、GA3和NAA的诱导, 而GmMYBJ7的表达则受ABA和NAA的诱导; 半定量RT-PCR分析表明, 两个基因在大豆的根、茎、叶、花和未成熟种子中均有表达。GmMYBJ6和GmMYBJ7为典型的R2R3-MYB转录因子新基因; 他们在大豆中的表达可能与ABA和NAA的信号转导途径有关。     

花生NAC转录因子AhNAC2和AhNAC3的克隆及转录特征

NAC转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子。本实验从花生中克隆了2个NAC基因AhNAC2和AhNAC3(GenBank登录号EU755023和EU755022);蛋白序列分析表明,两者具有典型NAC转录因子特征,N端含有保守NAC结构域。半定量RT-PCR显示,在ABA和GA₃处理,以及控水和低温条件下,AhNAC2和AhNAC3在花生组织中的表达上调,呈现不同的表达模式。AhNAC2和AhNAC3为典型的NAC转录因子新基因,蛋白序列与拟南芥RD26同源性较高,推测与响应干旱和ABA信号有关。     

鹰嘴豆锌指蛋白基因ZE1的克隆及表达分析

利用一段从PEG胁迫的鹰嘴豆幼苗叶片所构建的cDNA文库中得到的EST序列,通过3'RACE方法克隆到一个鹰嘴豆C_2H_2型锌指蛋白基因ZF1,该基因不含内含子,编码一条244个氨基酸残基的多肽,含有两个典型的Cys2/His2锌指结构.其氨基酸序列含有一个可能的核定位型号,农杆菌介导的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明,ZF1蛋白位于细胞核内.半定量RT-PCR分析表明,ZF1在鹰嘴豆的根、茎、叶、花、幼荚和幼胚中均有表达,在茎和叶中表达较弱,为组成型转录因子.半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测结果显示,ZF1不但受高温及干旱诱导,而且还受6-苄基腺嘌呤(6-BA)、脱落酸(ABA)、乙烯利(Et)、赤霉素(GA_3)、吲哚-3-乙酸(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)和氧胁迫诱导.这些结果表明,ZF1基因可能作为一个核调控因子参与植物的生长代谢以及多种生物与非生物胁迫的应答.     

沙冬青C2H2型锌指蛋白基因AmZFP1的克隆与表达分析

为了研究强抗逆植物沙冬青寒旱诱导表达基因AmZFP1(Zinc finger protein 1)的生理功能,通过转录谱分析,从中鉴定出一个受寒旱诱导的ZFP全长cDNA序列并命名为AmZFP1。利用半定量RT-PCR方法对AmZFP1进行了表达分析,结果表明,在室内正常培养的沙冬青幼苗中该基因有较高表达量,在低温或干燥处理2~48 h其表达量明显上调,尤其以干燥处理上调速度更快且上调幅度略高;在野外自然生长植株的嫩叶、花蕾和幼嫩果荚中AmZFP1均有较明显的表达,而在嫩枝和根中检测不到其转录本;在野外植株的嫩叶中,AmZFP1在严冬季节高表达,而在春、夏、秋温热季节表达水平低或很微弱。利用RT-PCR方法克隆到AmZFP1编码区cDNA(816 bp),推测其编码蛋白含有2个典型C2H2型锌指结构域及一个核定位信号。此外成功将该cDNA片段构建到植物表达载体p3300-353T上,为下一步深入开展该基因功能研究奠定了基础。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

鹰嘴豆锌指蛋白基因ZF1的克隆及表达分析

利用一段从PEG胁迫的鹰嘴豆幼苗叶片所构建的cDNA文库中得到的EST序列,通过3¢RACE方法克隆到一个鹰嘴豆C₂H₂型锌指蛋白基因ZF1,该基因不含内含子,编码一条244个氨基酸残基的多肽,含有两个典型的Cys2/His2锌指结构。其氨基酸序列含有一个可能的核定位型号,农杆菌介导的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明,ZF1蛋白位于细胞核内。半定量RT-PCR分析表明,ZF1在鹰嘴豆的根、茎、叶、花、幼荚和幼胚中均有表达,在茎和叶中表达较弱,为组成型转录因子。半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测结果显示,ZF1不但受高温及干旱诱导,而且还受6-苄基腺嘌呤(6-BA)、脱落酸(ABA)、乙烯利(Et)、赤霉素(GA₃)、吲哚-3-乙酸(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)和氧胁迫诱导。这些结果表明,ZF1基因可能作为一个核调控因子参与植物的生长代谢以及多种生物与非生物胁迫的应答。     

对甘蔗受黑穗病菌侵染后差异表达基因的分离与鉴定

采用12个3''锚锭引物和8个5''随机引物构建引物组合, 运用DDRT-PCR差异显示方法, 分析NCo376和F134两品种接种黑穗病菌前后的基因表达差异。经克隆、测序和半定量RT-PCR验证, 获得7条真实差异表达片段, 这些片段分别同GenBank中编码细胞色素C氧化酶基因、核糖体蛋白基因、NAD-依赖型苹果酸脱氢酶基因、氨基转移酶基因、乙烯响应相关结合蛋白基因、RNA聚合酶特异转录起始因子和反转录转座子的序列的同源性达28%~99%。半定量RT-PCR分析表明, 细胞色素C氧化酶基因的表达受甘蔗黑穗病菌和水杨酸的调控, 不依赖于过氧化氢的作用机制, 在甘蔗根、茎、叶中表达的抗病基因组成型表达, 但表达水平较低。推测甘蔗受黑穗病菌侵染后, 可能通过细胞色素C氧化酶基因的诱导, 促使植保素合成增多, 以此抵抗或抑制病原菌的胁迫。该结果丰富了甘蔗与黑穗病菌互作的分子机制研究, 为甘蔗抗黑穗病分子育种奠定了基础。     

草地贪夜蛾Sf9细胞对饥饿诱导自噬的响应

为研究草地贪夜蛾对饥饿诱导自噬的响应。从草地贪夜蛾EST数据库中筛选到一段核苷酸序列,设计特异性引物,RT-PCR技术从草地贪夜蛾Sf9细胞中扩增该核苷酸序列,经过生物信息学分析该序列与昆虫自噬相关基因ATG8同源性最高,命名为SfATG8基因,并构建了pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8载体转染Sf9细胞。Sf9细胞经饥饿(PBS)诱导4 h后,Lyso-Tracker染色、Western Blotting、共聚焦显微镜检测细胞对自噬的响应程度。结果表明,经饥饿(PBS)诱导4 h的Sf9细胞中出现Sf Atg8-PE的表达,共聚焦显微镜检测到Sf9细胞膜上的自噬小体。以上证据证实饥饿(PBS)能诱导Sf9细胞发生自噬,为深入研究Sf9细胞对自噬的响应奠定了基础。     

家蚕化学感受蛋白BmCSP8表达谱及多克隆抗体制备

为阐明昆虫化学感受蛋白(Chemosensory Proteins,CSPs)基因在昆虫不同组织部位和发育时期表达特性。运用半定量RT-PCR的方法分析了家蚕BmCSP8基因的时空表达谱。结果显示：（1）BmCSP8基因在雌、雄蛹中均表达,但在卵期不表达,在幼虫阶段,低龄期高于高龄期的表达量;（2）BmCSP8基因广泛分布于成虫身体各组织,但雌雄间的表达存在差异性,在主要感受器官触角中的表达量较低;运用重组BmCSP8蛋白成功制备兔多克隆抗体,Western-blot分析发现抗血清与触角蛋白发生特异性结合,为深入研究其生理功能打下基础。以上结果表明：BmCSP8基因可能参与了家蚕觅食的生理过程,且具有其他尚未明确的非嗅觉功能。     

水稻(Oryza sativa L.)a-淀粉酶基因的进化及组织表达模式

α-淀粉酶在植物特别是谷类萌发种子淀粉降解中具有重要作用。水稻α-淀粉酶基因的结构、进化和表达研究已有报道,但是,多集中于OsAmy1和OsAmy3这两个亚族内基因间以及发芽种子中。不同亚族间的基因结构、进化及更多组织和时期的表达特点尚缺乏细致研究。本研究通过TblastN同源性比对及保守结构域分析揭示水稻基因组含有11个α-淀粉酶基因。生物信息学分析、系统进化树构建及半定量RT-PCR分析表明,该家族基因在结构上发生了明显的分化,具有清晰的进化层次,OsAmy5A和OsAmy4A是家族中较原始状态的基因;在表达和功能上也发生了明显分化,进化水平较高的基因发生了明显的时空表达特异性分化。OsAmy1A、OsAmy3A及OsAmy3D和OsAmy3E分别在保证种子植物世代传递、维持种子休眠过程中胚的微弱生命活动及保证种子萌发过程中能量的稳定持续供应上具有重要作用。     

Design of a Motion Control System of Confocal Scanning Laser Microscope

A confocal scanning laser microscope is presented. Its motion control system is built with the DSP - based motion controller. The system worked on a double CPU structure that includes industrial control computer and motion controller, the system adopt friendly man - machine interface In the design of software. The systems tasks are divided into real - time tasks and no - real - time tasks. The lower computer deals with the real - time tasks such as position control and velocity control and the upper computer is used to deal with the non - real - time tasks. The system structure of con-focal scanning laser microscope and the constitute of motion control system as well as the software is introduced .