山茶花红色素的提取及其性质初探

 初步探索了山茶花红色素的提取条件和理化性质, 结果表明, 用料液比1∶10 ( g/mL) 、pH 1(10%盐酸调) 的95%乙醇作提取剂, 在80℃恒温提取6 h, 提取效率较好。山茶花红色素属花色素苷类,pH值对色素影响明显, 在酸性条件下色泽具有热稳定性。光照能加快色素降解, 但与紫外光无关。金属离子Na⁺ 、Ca^{2 +} 、A1^{3 +} 、Cu^{2 +} 、Zn^{2 +}对色泽无影响, Fe^{3 +} 、Pb^{2 +}有不良影响。色素的抗氧化能力较差, 耐还原性较好。蔗糖、葡葡糖和盐等添加剂对色素无影响。     

郁金香更新鳞茎发育的碳同化物积累与内源激素变化研究

 应用扫描电镜和¹⁴C同位素标记技术, 并结合内源激素测定, 考察郁金香更新鳞茎膨大发育与碳同化物积累、分配的关系。结果表明: 在鳞片细胞内观察到明显的淀粉颗粒, 并随鳞茎的发育进程充满整个细胞腔。在盛花期前, ¹⁴C同化物主要分配到地上部; 进入叶枯期后¹⁴ C同化物以向地下部运输为主,分配比例达66.01% , 其中更新鳞茎中¹⁴C同化物的分配占60.85% , 这时¹⁴C库活性表现为: 鳞茎>叶片>花茎>根系。在郁金香更新鳞茎发育进程中, 叶片中GA、IAA含量呈下降趋势, ABA含量则不断增高并在盛花期出现峰值, 达65.86 ng·g^{- 1} FM。比较不同生育期的GA₃ /ABA比值, 在发叶期的叶片和盛花期的更新鳞茎中均出现高比值, 表明内源激素的平衡可能是郁金香更新鳞茎发生和发育的调节因子。     

‘雪青’梨叶片高频再生体系的建立

 以‘雪青’梨叶片为外植体, MS为基本培养基, 培养温度(25 ±1) ℃, 光照强度2 000 lx,14 h /d, 继代周期30 d。在MS + 2,4-D 2 mg·L ^{- 1} + 6-BA 0.5 mg·L ^{- 1}培养基中, 外植体脱分化率达100% ,愈伤组织增殖倍数达12.05; 在MS + 6-BA 5 mg·L ^{- 1} + IAA 0.1 mg·L ^{- 1}中, 不定梢诱导率达100% , 在MS+ 6-BA 2 mg·L ^{- 1} + IAA 0.1 mg·L ^{- 1} +CH 100 mg·L ^{- 1}中, 1～6代不定梢平均繁殖系数达7; 在1 /2MS +IBA 2 mg·L ^{- 1} + 6-BA 0.5 mg·L ^{- 1} +AC 500 mg·L ^{- 1}中, 不定梢生根率达67.50%; 68株试管苗移栽到珍珠岩营养钵中, 30 d成活46株, 成活率为67.65 %。     

多花蔷薇胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株

利用多花蔷薇‘无刺3号’假珠芽诱导的胚性愈伤细胞悬浮系分离得到原生质体,并培养获得再生植株。酶种类和浓度, 酶解时间及悬浮细胞继代时间对原生质体分离有重要影响,最佳酶液组成是2.0%纤维素酶,0.5%离析酶,5.0 mmol·L^-1 MES, 0.5 mol·L^-1甘露醇,0.5% CaCl₂·2H₂O。采用继代3 d的悬浮细胞系,酶解10 h,原生质体产量达到26.67×10⁶g^-1,原生质体活力为92.21%。采用液体浅层培养,肌醇比蔗糖更有利于纯化后的原生质体分裂和生长。愈伤组织形成增殖培养基为1/2MS + 2,4-D 1.0 mg·L^-1+ EBR 0.2 mg·L^-1 + 10 g·L^-1 Ficoll + 500 mg·L^-1谷氨酰胺 + 20 mg·L^-1甘氨酸 + 20 mg·L^-1天冬氨酸,分化培养基为1/2MS + 10 mg·L^-1 TDZ + 500 mg·L^-1谷氨酰胺+ 20 mg·L^-1甘氨酸+ 20 mg·L^-1天冬氨酸,后转入1/2MS培养基上获得完整植株。     

‘翠秀’黄瓜子叶原生质体的高效培养及植株再生

 分离纯化的黄瓜子叶原生质体，以5.5×10～5.5×10⁵个/mL的不同密度培养于mKMSp液体培养基中，均获得不同程度的细胞分裂。当培养密度超过1.0×10³个/mL时，原生质体可持续分裂至愈伤组织形成，最高植板率为54%。原生质体来源的愈伤组织经诱导培养产生大量体胚并再生成植株。Ca²⁺ 浓度对黄瓜原生质体的稳定和细胞分裂有重要影响。     

根癌农杆菌介导Cry1Ac基因转化‘雪青’梨获得转基因植株

 以‘雪青’梨叶片愈伤组织为外植体, 经根癌农杆菌介导将CaMV35S启动子调控下的Cry1Ac基因导入‘雪青’梨。698块愈伤组织和231个Kan^r芽与携带表达载体质粒pBX203的根癌农杆菌菌株LBA4404共培养3 d后, 转入含50 mg·L^-1 Kan的筛选培养基培养30 d, 15 d转接1次。结果表明,在MS + 5 mg·L ^-1 6-BA + 0.1 mg·L^-1 IAA筛选培养基中, Kan^r芽率为34.24% , 在1/2MS + 2 mg·L^-1 IBA+ 0.5 mg·L^-1 6-BA + 500 mg·L^-1AC筛选培养基中, 15.58% Kan^r芽生根。共获得再生植株32株, 经PCR和Southern-blot分析证明, 其中4株的基因组已成功导入和整合Cry1Ac基因。     

大果优质中熟油桃新品种‘甜丰’

 (¹ 河北省农林科学院石家庄果树研究所, 石家庄050061 ; ² 河北省沧州市林业局, 沧州061001)     

红叶石楠生根培养与根系活力的研究

 以红叶石楠继代组培苗为试材, 研究了不同生长素( IAA、NAA和IBA) 、间苯三酚、暗培养、多效唑(MET) 以及培养基支持体对红叶石楠生根过程的影响。结果表明: NAA 015 mg·L ^{- 1}和暗培养7 d促进红叶石楠的生根; 培养基1/2MS +NAA 0.5 mg·L ^{- 1} + IBA 0.3 mg·L ^{- 1} +MET 0.5 mg·L ^{- 1}的处理使平均每株生根数达615条, 生根率达到90%; 以琼脂、蛭石、珍珠岩为培养基支持体诱导生根, 其中以珍珠岩为培养基支持体诱导效果最佳, 平均每株生根数达2318条, 生根率达96.6% , 移栽成活率达95.9% , 根系活力高达576.159μg·g^{- 1} ·h^{- 1} , 过氧化物酶( POD) 活性达到27.08 △A₄₇₀ ·min^{- 1} ·g^{- 1}。     

食用仙人掌‘米邦塔’的试管快繁

 对食用仙人掌‘米邦塔’的试管快繁研究结果表明: 初代培养基以MS + 6-BA 0.6 mg·L^-1 +NAA 1.0 mg·L^-1 + 2 ,4-D 0.1 mg·L^-1为最佳处理, 接种60 d 后, 外植体上刺座下的潜伏芽萌发率可达67 %。继代增殖培养适宜培养基为MS + 6-BA 0.1 mg·L^-1 + NAA 1.0 mg·L^-1 + 2 ,4-D 0.2 mg·L^-1 或MS + 6-BA 0.1mg·L^-1 + NAA 0.5 mg·L^-1 , 平均每50 d 继代增殖培养1 次, 增殖倍数可达5～6 , 且新生的小子茎生长旺盛。在培养过程中, 虽然部分外植体切口处发生大团绿色至黄绿色小颗粒状愈伤组织, 然而均没有分化不定芽。在生根培养基MS + IAA 0.1 mg·L^-1 或MS + IBA 0.1 mg·L^-1 上, 2～3 cm 高的小子茎培养10 d 左右发根,形成完整植株。当试管苗高达5 cm时移入砂床, 成活率高达99 %, 经约60 d , 试管苗发出第一批掌片。     

大叶补血草Na+/H+ 逆向转运蛋白基因( SOS1)的克隆与序列分析

 用RT-PCR及RACE方法从盐生植物大叶补血草Limonium gmelinii (Willd. ) Kuntze中分离出Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白基因的cDNA (LgSOS1, GenBank登录号EU780458) , LgSOS1的cDNA全长为3 910bp, 5′非翻译区为79 bp, 3′非翻译区为376 bp, 开放阅读框为3 455 bp, 编码1 151个氨基酸, 推测分子量为126 kD。氨基酸同源性分析表明, LgSOS1与冰叶午时花、沙拐枣、番茄、盐芥和拟南芥质膜型Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白的一致性分别为69.02%, 64.42% , 61.96% , 60.12%和59.62%。预测分析表明, LgSOS1有12个跨膜结构区域。系统发育分析表明该蛋白与质膜型的Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白的亲缘关系较近, 与液泡型的Na⁺/H⁺ 逆向转运蛋白亲缘关系较远。     

发根农杆菌介导的荔枝LcMYB1转化烟草叶片的研究

利用荔枝果皮花青苷生物合成的关键调节基因LcMYB1为标记，构建植物表达载体pBA002-LcMYB1，电转法转入发根农杆菌A4菌株，通过叶盘法转化烟草K326。结果表明，烟草叶片侵染一周后长出白色的毛状根，约3周后部分毛状根逐渐变成红色，毛状根诱导率为100%，红色毛状根诱导率为19.9%。当筛选培养基中添加5 mg ? L-1 Basta，毛状根诱导率降低为33.3%，但红色毛状根诱导率提高到75%。高效液相色谱分析表明，红色毛状根中积累矢车菊素–3–葡萄糖苷和矢车菊素–3–芸香糖苷，PCR检测证实红色毛状根是由LcMYB1的转入引起的。实时荧光定量PCR表明转LcMYB1可以诱导烟草毛状根中花青苷生物合成相关的结构基因和调节基因表达。     

黄瓜多抗自交系NC-46转基因不定根的高频诱导及其cDNA文库的构建

利用发根农杆菌K599（带有质粒pBIN-35S-GFP）,以具有抗爪哇根结线虫和花生根结线虫等多种抗性基因的黄瓜自交系NC-46离体子叶为外植体,高效诱导出转基因不定根（诱导率达76.7 %）;并在此基础上成功构建了转基因不定根的cDNA文库。构建的cDNA文库重组率为98.3%,原始库容量达2.02 × 106 cfu,其中基因的完整性比率为47.6%,Unigene比例为66.7%。选用转基因不定根构建根的cDNA文库,克服了实生苗难以获得大量均一状态根的缺陷;克服了实生苗根受到土壤根际微生物、线虫等对根生理状态的影响以及对提取RNA的污染问题;利用改良的Smart cDNA文库构建法,获得的文库克隆含有完整的5′端非翻译区的全长cDNA;此外,构建的文库由于利用改良的pUC19载体替代了λTripIEx2噬菌体载体,获得的克隆无需再将插入到噬菌体载体上的cDNA转染到质粒载体,可直接用于杂交和测序筛选,因此在基因克隆筛选时更加方便。     

Induction of hairy roots by Agrobacterium rhizogenes in relation to L-theanine production in Camellia sinensis

Summary

Theanine is a functional compound synthesised in roots of Camellia spp., especially tea (C. sinensis). Hairy roots were induced by two strains of Agrobacterium rhizogenes (15834 and LBA9402). The amino acid, catechin and caffeine compositions of hairy roots were determined by HPLC and compared with roots grown from tea seed. The results showed that the most suitable conditions to induce hairy roots were to use stem segments cut from 70 d-old plantlets, co-cultivated on YMB (yeast, mannitol broth) medium for 2 d, then induced on MS (Murashige and Skoog) medium for 4 weeks. Induced roots grown on LG₀ medium had 23.12 mg theanine g^–1 fresh weight, which was 23% higher than in roots grown from tea seed. Low concentrations of catechin, caffeine and epicatechin were detected in both root samples. Polymerase chain reaction (PCR) confirmed that the genes rol A, rol B and rol C of A. rhizogenes had been transferred into the DNA of the hairy root cells. The integrated genes for plant hormone synthesis from A. rhizogenes could increase hormone levels in the induced hairy roots, which in turn stimulated root growth and theanine synthesis. Hairy roots with higher concentrations of theanine, and lower levels of catechins and caffeine, are considered to be a good source for extracting L-theanine which is used as an active ingredient in food and medicine.     

Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium spp.: hairy root production,inulin and total phenolic compounds analysis

Chicory (Cichorium spp.) is a valuable vegetable crop worldwide for its edible leaves and for the production of coffee substitutes from roots. Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation of two species of chicory (C. intybus and C. endivia) was investigated using Agrobacterium strain K599 harbouring p35SGFPGUS+ plasmid and two types of explants: leave and leaf stalks. This Agrobacterium strain proved to be competent in the transformation with transformation rate about (23.1%) in leaf explants of C. intybus. However, the transformation rate with C. endivia was much lower (3.6%). Moreover, the hairy roots appeared from different infection sites of the leaf explants. Several hairy roots of the two species were acquired, out of them 11 clones (C. intybus) and two clones (C. endivia) were selected due to their fast-growing character. Growth of hairy roots was determined on the basis of total root biomass accumulation. It was found that the liquid MS-basal medium seems to be the most suitable for biomass production. PCR analysis revealed foreign DNA integration in the selected transgenic hairy root clones. Notable, the transgenic hairy roots exhibited substantially higher growth rates and accumulated higher amount of inulin than non transgenic roots (WT). Also, the total phenolic compounds were determined.     

长期培养的黄瓜毛状根中外源基因遗传稳定性分析

 对在固体培养基上培养3 年的黄瓜转gfp 基因毛状根进行gfp 和rol 位点系列基因的PCR 扩增、gfp 的荧光定量PCR、Western blot 杂交以及荧光观察分析。结果显示,由组成型启动子35S 驱动的gfp 在转录水平上能正常表达,而且能够翻译出编码蛋白;此外,培养3 年后的毛状根,能扩增出与毛状根形态构成有关的rol 系列基因。本研究结果表明长期培养的毛状根能保持其遗传稳定性,这为利用毛状根长期工厂化生产外源基因表达的蛋白产物和药用植物的活性成分提供了理论依据。     

发根农杆菌K599对菊花活体转化及其高效再生

 发根农杆菌K599侵染菊花无菌苗刻伤的叶片形成转基因不定根,生根频率为88.0%;不定根经过诱导培养形成愈伤组织,并再生完整植株,愈伤组织诱导率和分化率分别为75.0%和63.3%。诱导的不定根和再生植株经过PCR鉴定含有K599 Ri质粒中的rolC基因,qRT-PCR检测显示rolC基因在再生转基因植株中实现了正常表达。再生植株表现出矮缩、多毛状根特征,并能正常开花。建立的利用活体材料直接作为发根农杆菌K599侵染的受体诱导不定根的遗传转化体系,能克服假阳性不定根的出现;同时,利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点,通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养,结合使用头孢霉素杀菌,能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的,在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无须再使用抗生素杀菌,提高了转基因再生效率,为菊花的矮化育种和目标基因的转移提供了良好的试验体系。     

发根农杆菌介导山定子遗传转化及发根再生植株

为了提高山定子的生根能力,用发根农杆菌转化山定子,诱导产生发根,并由发根诱导出再生植株。通过对不同发根农杆菌株系、培养基、共培养时间以及添加乙酰丁香酮（AS）的研究,优化了发根农杆菌转化体系。当用添加AS（100μmol﹒L-1）的菌液侵染植株切段30 min,共培养3 d,在无植物生长调节剂的固体1/4MS培养基上诱导产生发根时,发根诱导率最高,达到88.89%。将发根根段在MS+BA 2.0 mg﹒L-1 +IBA 0.1 mg﹒L-1+GA3 0.1 mg﹒L-1的再生培养基上,通过愈伤组织的诱导得到再生植株,再生率3%。     

柑桔体细胞杂种扦插繁殖及其有关性状研究

对３个由原生质体融合产生的柑桔体细胞杂种繁殖特性的研究表明，金柑与甜橙属间体细胞杂种扦插生根成活率较低。甜橙＋宜昌橙以及甜橙＋粗柠檬种间体细胞杂种扦插萌发和生根能力与权及粗柠檬没有显著差异；插条发根平均为２．０条和１．８条，一年生植株根系总长分别为１２２．２ｃｍ和８０．７ｃｍ，与积和粗柠檬均无显著差异；粗柠檬＋甜橙杂种的须根数为３９条，株－１，与权（５４．５条·株－１）差异显著，而宜昌橙＋甜橙种间杂种（４７．７条·株－１）与积差异不显著；体细胞杂种的抗寒性有介于双亲之间的趋势     

氟唑活化酯诱导大白菜抗根肿病效果与机理初步研究

为明确新型植物诱导抗病剂氟唑活化酯对大白菜根肿病的诱导抗病效果及抗病机理,研究了氟唑活化酯的诱导浓度、在白菜根部的运输过程以及氟唑活化酯诱导白菜后相关防御基因的表达情况。结果显示以氟唑活化酯25 mg ? L-1对大白菜进行叶面喷雾诱导时根肿病的病情指数最低。通过台盼蓝（Trypan blue）染色观察到氟唑活化酯诱导大白菜叶片后,根部对根肿菌也产生了一定的抗性。利用Real-time PCR技术检测大白菜防御相关基因的表达,发现氟唑活化酯诱导大白菜2 h后JA途径中的COI1和LOX2基因以及SA途径中的PR-1基因都有显著的过量表达,其中JA信号途径相关基因表达变化更明显。结果说明氟唑活化酯可以诱导大白菜产生系统获得抗性,两种信号传导途径都参与了抗病过程,但以JA途径为主,SA途径为辅。     

菊花脂肪酸脱饱和酶基因CmFAD7的克隆与表达分析

以秋菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）抗寒品种‘星光灿烂’为材料,利用RT-PCR和RACE方法从叶片中克隆了ω-3脂肪酸去饱和酶基因,命名为CmFAD7,GenBank登录号为KC567246。该基因cDNA 全长1 284 bp,编码428个氨基酸,相对分子量为48.98 kD,等电点为9.07,编码的氨基酸序列与高山还阳参同源性最高（84%）。该蛋白含有?12-FADs保守结构域和3个跨膜螺旋,N端含有一段叶绿体转运肽,属于膜脂肪酸去饱和酶超级家族。采用实时荧光定量PCR和气相色谱法研究低温胁迫下叶片和根系中CmFAD7的表达量及脂肪酸含量变化,CmFAD7在根系和叶片中均有表达,叶片中的表达量高于根系。根系中5 ℃时表达量最高,叶片中–4 ℃时最高,在–8 ℃时叶片和根系表达量均较低;随着处理温度的降低,叶片中C18:3含量呈逐渐上升趋势,根系中变化不明显。结果表明,菊花CmFAD7与抗寒性有关,低温条件下不同器官的表达量有较大差异。