黄龙病菌感染对长春花 SOD 和 POD 活性的影响

【目的】比较黄龙病菌感染对长春花叶、茎、根 3 个组织中超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化物酶（POD） 活性的影响。【方法】采用分光光度计法测定黄龙病菌感染后长春花叶、茎、根 3 个组织中 SOD 和 POD 的活性。 【结果】染病长春花中 SOD 活性随感染时间的增加,逐渐下降,活性最低时,叶、茎和根 SOD 活性分别只有健 康对照的 61%、55% 和 47%。3 个组织间 SOD 活性总体表现为叶 > 茎 > 根。染病长春花中 POD 活性随感染时间 的增加呈现先上升后下降的趋势,叶、茎和根 POD 活性最高出现在嫁接后 30、35、35 d,活性分别为健康对照 的 205%、254% 和 194%,根中 POD 活性总体较叶、茎部高。【结论】黄龙病菌感染对长春花各组织中 SOD 和 POD 酶的活性均有较大影响,SOD 和 POD 活性的增加对长春花抵抗 CaLas 侵染起重要作用。     

小麦籽粒多酚氧化酶活性的QTL分析

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)是引起面团(片)颜色褐变的主要原因。由小麦品种花培3号和豫麦57杂交获得DH群体168个株系,种植于2年6个环境中,利用324个多态性标记构建遗传连锁图谱,对小麦多酚氧化酶活性进行QTL分析。利用完全区间作图法,共检测到15个加性效应位点,其中2D染色体上主效QTL(标记Xcfd168-Xbarc349.2)在4个环境下均能被检测到,贡献率为11.65%~65.84%,适用于分子标记辅助育种。     

长春花法尼基转移酶β-亚基基因的克隆及其在黄龙病菌感染过程中的表达分析

为了探讨长春花法尼基转移酶β-亚基(crFTB)在黄龙病菌侵染过程中的表达模式及作用,采用RACE技术扩增长春花crFTB基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测叶片组织中crFTB在黄龙病菌(CLas)侵染长春花不同时间点的表达变化。结果显示,crFTB cDNA全长为1 826 bp,包含150 bp 5′UTR、308 bp 3′UTR和1 368 bp开放阅读框,编码455个氨基酸,理论分子质量和等电点分别为50.45 ku和4.67。FTB蛋白在物种间有较好的保守性,系统进化树表明,crFTB与油橄榄樟子松变种FTB蛋白的亲缘关系最近。CLas侵染长春花过程中,crFTB在叶片组织中的表达量呈现先升后降的模式,从接种后4 d开始crFTB基因的表达量升高,到24 d时达到峰值,然后表达量开始下降,直到试验结束时仍显著高于健康植株中crFTB基因的表达量。分析认为,crFTB在长春花抵抗CLas侵染过程中起重要作用。     

鸭梨果肉多酚氧化酶的活性研究与纯化

对鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)果肉多酚氧化酶的活性进行研究并对其进行纯化。以鸭梨果肉为试材,采用邻苯二酚为底物测定氧化产物的方法,就pH值、温度、热稳定性、抑制剂、不同成熟期及果肉不同部位等因素对PPO活性的影响进行了研究;酶粗提液经30%硫酸铵沉淀去杂和80%饱和度硫酸铵析出、Sephadex G200柱层析及HiPrepTM16/10 QXL离子柱层析等步骤进行了纯化,经SDS-PAGE进行了验证。结果表明:鸭梨果肉中的PPO最适pH值为6.4;最适温度为25℃;20～25℃时热稳定性较高;不同成熟期的活性不同;34 mmol/L的NaCl为较好的抑制剂;果肉近果心处活性最高,中部活性最低。经纯化,获得均一的PPO,分子量约43 kD。为鸭梨果肉PPO的性质研究以及控制梨果PPO酶促褐变提供了依据。     

南美白对虾多酚氧化酶的生化特性

对南美白对虾中多酚氧化酶(PPO)的活性及其影响因素作了分析研究,探测该酶的最适pH和最适温度;比较分析了抗坏血酸、亚硫酸钠、植酸和EDTA对PPO的抑制作用以及不同包装连头对虾在不同温度(-2、0、3、7℃)下贮藏期间PPO活性的变化.结果表明:以邻苯二酚为底物,虾PPO活性的最适pH为7.0,最适温度为35℃;4种抑制剂(1mg·mL-1抗坏血酸、2mg·mL-1亚硫酸钠、1mL·L-1植酸及0.1mg·mL-1EDTA)对南美白对虾PPO都表现出一定的抑制作用,以1mL·L-1植酸抑制作用最强;南美白对虾在贮藏过程中PPO活性逐渐上升,真空环境中PPO活性受到抑制,贮藏温度越低,抑制作用越强.     

小麦籽粒多酚氧化酶提取方法的比较研究

采用3种不同方法提取21个小麦品种籽粒的多酚氧化酶(PPO),以综合研究不同的提取方法与其活性的关系,结果显示:在3种提取方法中,用十二烷基硫酸钠(SDS)提取全麦粉PPO的活性平均值和变异系数最高,分别为57.2 U/(g.min)和77.7%;而用磷酸盐提取全麦粉PPO活性平均值为19.6 U/(g.min),变异系数为59.6%,低于前者。用磷酸盐提取完整籽粒的PPO活性平均值及变异系数最低,分别为5.1 U/(g.min)和16.7%。简单相关分析结果表明,分别用磷酸盐和SDS提取全麦粉PPO活性的相关性最好,相关系数达0.954;其次是磷酸盐提取的完整籽粒和SDS提取全麦粉的PPO活性的相关性,其相关系数为0.925;最小的是用磷酸盐分别提取完整籽粒和全麦粉PPO活性的相关性,相关系数为0.877。相关性均达极显著水平。同时研究了磷酸盐和SDS分别提取PPO活性的时间特性,结果表明:对于PPO活性差异较大的品种,其活性曲线的差别也较大;对于同一品种,这2种方法提取的PPO活性面积(活性曲线下包含的面积)也差异明显。上述说明磷酸盐缓冲液中加入SDS可有效地改善PPO的提取效果;不同品种、不同的提取方法,PPO的活性曲线也有明显差异。     

黄皮多酚氧化酶活性的影响因素分析

研究了pH值、温度、底物浓度及抑制剂等因素时黄皮果实中多酚氧化酶(PPO)活性的影响.结果表明,黄皮PPO具有同工酶,PPO的最佳底物浓度为0.14mol·L-1,最适pH值为7.0,最适温度为40℃,当温度高于60℃时,PPO的活性明显降低,亚硫酸钠、抗坏血酸、柠檬酸、L-半胱氨酸等4种抑制剂对黄皮PPO的活性表现出不同的抑制作用,抑制效果为亚硫酸钠抗坏血酸柠檬酸L-半胱氨酸,其中,抗坏血酸随着浓度的增加抑制效果越好,抑制率不断升高.     

植物多酚氧化酶及其活性特征的研究进展

对植物就多酚氧化酶类型、细胞和组织中的定位、生理功能、酶活性的影响因素等方面的近年来的研究成果进行了总结.     

棉花多酚氧化酶基因GhPPO1的克隆及在棉铃虫取食诱导反应中的作用

【目的】克隆棉花多酚氧化酶基因（GhPPO1）全长cDNA序列,分析其序列特征,并研究其及多酚氧化酶系对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的取食诱导反应,明确其在棉花防御棉铃虫取食中的作用。【方法】根据笔者研究组前期从棉花SSH文库中获得的对昆虫取食诱导响应明显的棉花PPO基因序列片段,设计5′RACE特异引物,进行5′端RACE反应,测序后进行序列拼接。拼接序列在NCBI棉花dbEST数据库中,用Blastn程序进行同源检索,获得一条EST（GenBank登录号：DR461072.1）与测序结果有410 bp重复。用DNAstar进行组装、电子延伸,获得一条棉花PPO基因序列,命名为GhPPO1。在GhPPO1序列两端设计引物进行全长验证,同时设计引物,以棉花基因组DNA为模板,进行PCR扩增测序,验证GhPPO1是否含有内含子。采用BLASTX在NCBI数据库中对验证后的GhPPO1序列进行同源序列分析;ClustalW软件进行多重序列比对;MEGA 4.0软件构建系统进化树;同时对推测的编码区氨基酸序列进行功能位点及理化性质的预测与分析,所用软件包括ANTHEPRO5.0、ExPASy、InterProscan等。利用实时荧光定量PCR方法测定机械损伤、棉铃虫取食和口腔分泌物处理后,棉花叶片中GhPPO1的mRNA表达量;并通过分光光度法测定棉花叶片中PPO酶系的活性变化趋势。【结果】 GhPPO1的cDNA序列全长为2 022 bp,推测该基因编码区（ORF）为1 797 bp,编码598个氨基酸,5′UTR 含102 bp,3′UTR含123 bp,预测其等电点为6.11,蛋白分子量约67.18 kD,无内含子。GhPPO1编码区氨基酸序列包含CuA和CuB结合位点、3个N-糖基化位点、8个N-豆蔻酰化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点及1个酰胺化位点。GhPPO1的CuA和CuB离子结合区,有PPO蛋白关键氨基酸组氨酸和半胱氨酸。GhPPO1蛋白与其他植物的PPO蛋白序列最大相似度几乎均在50%以上,与其他植物PPO蛋白进化关系相对较远。机械损伤棉花叶片后,GhPPO1表达量呈现出先升高后下降的趋势,至6 h表达量最高,为无处理对照的3.29倍;1龄末期棉铃虫幼虫取食棉花后,叶片中该基因的表达量呈现先升高后下降,然后又升高的趋势,至12 h表达量最高,为无处理对照的6.04倍;棉铃虫取食3 h和6 h后的表达量低于机械损伤处理后相同时间的表达量。棉铃虫取食和机械损伤棉花叶片后,PPO酶活性均呈现出升高趋势,且机械损伤处理酶活性在各时间段均高于棉铃虫幼虫取食处理。与未做任何处理的正常叶片相比,机械损伤和清水共同处理的叶片GhPPO1表达量及PPO酶活性显著升高,而机械损伤和棉铃虫幼虫口腔分泌物共同处理的叶片GhPPO1表达量及PPO酶活性无显著变化,表明口腔分泌物对GhPPO1表达量及PPO酶活性有抑制作用。【结论】获得了GhPPO1的全长cDNA序列,证明GhPPO1是棉花防御棉铃虫取食的关键PPO基因,推测棉铃虫口腔分泌物中存在抑制棉花PPO酶活性升高物质,该物质在棉铃虫适应寄主植物产生的防御反应中发挥作用。     

金花茶多酚氧化酶基因的克隆及其体胚发生过程中的表达分析

以金花茶胚性培养物为材料,对体胚PPO基因克隆以及在体胚发生过程中的转录水平进行q PCR分析和酶活性变化检测.结果表明:克隆获得的金花茶PPO基因c DNA序列1788 bp,含有完整的开放阅读框(ORF),编码595个氨基酸;与登录Gen Bank的山茶属其他植物PPO基因序列进行核苷酸和氨基酸比对发现,同源性分别为74%和72%左右.同时,以18S rRNA作为内参基因进行的q PCR分析表明:金花茶体胚发生过程中PPO基因表达量呈下降趋势,球形胚PPO基因表达量最大,子叶胚和心形胚次之,成熟胚最小;而正常子叶胚和花状多子叶胚的表达量存在明显差异.此外,对金花茶体胚发生过程中PPO活性变化检测结果表明:在此过程中PPO活性明显比较低,变化趋势与PPO基因定量表达结果相似,推测PPO基因可能在金花茶体胚发生早期发挥重要作用.     

柑桔黄龙病菌外膜蛋白的原核表达与纯化

为获得大量高纯度的柑桔黄龙病菌Omp 外膜重组蛋白、应用PCR 方法从染病柑桔模板中扩增出黄龙 病菌omp 基因的3 个片段、将其克隆到pMDl9-T 载体、再亚克隆到pET32a 原核表达载体、构建pET32a-omp 原核表 达重组质粒、然后转化大肠杆菌BL21（DE3）、经IPTG 诱导并用SDS-PAGE 电泳检测带组氨酸标签的Omp 融合蛋白 表达后、用镍柱分离纯化该融合蛋白。结果表明院柑桔黄龙病菌omp 基因序列的两个片段在37益经1 mmol/L IPTG 诱导后、在大肠杆菌得到了高效表达;镍柱纯化蛋白得到预期大小（约55 ku）的融合蛋白。     

木薯叶多酚氧化酶的提取及其酶学性质研究

以木薯叶为原料,研究木薯叶多酚氧化酶PPO的最佳提取条件与酶学性质。结果表明,木薯叶PPO 的 最佳提取条件为磷酸缓冲液PBS的pH 值6.8料液比4 mL/g提取时间6 h;木薯叶PPO 酶促反应产物在399 nm 处有最大吸收峰,以邻苯二酚为底物的酶促反应的米氏常数Km=0.8 mol/L动力学方程为V=2000[S]/0.8+[S]该酶最 适温度为37益,最适pH 值为7.0。     

滁菊多酚氧化酶的三相分离及其酶学特性分析

滁菊在采收后极易因酶促褐变导致其品质下降,故以滁菊鲜花为原材料,针对影响其品质劣变的多酚氧化酶展开研究,明确其三相分离纯化工艺以及酶学特性.考察了硫酸铵浓度、pH值、提取液与叔丁醇体积比、提取时间等工艺参数对滁菊多酚氧化酶纯化效果的影响,结果表明三相分离纯化滁菊多酚氧化酶的较佳工艺参数为:硫酸铵质量浓度0.4 g·mL-1,pH值6.0,粗提液与叔丁醇的体积比为1∶1.5;按照此工艺条件对纯化后滁菊中多酚氧化酶的酶学特性进行了分析,滁菊多酚氧化酶最适pH值为6.50,最适反应温度为30℃;以邻苯二酚为滁菊多酚氧化酶反应底物时,底物最适浓度为0.35 mol·L-1,酶促反应米氏常数为0.1749 mol·L-1.     

茶树扦插生根过程中3种氧化酶活性及多酚含量变化研究

对3个国家茶树品种扦插生根情况以及扦插过程中3种氧化酶活性和茶多酚含量变化进行研究。结果表明,不同品种间扦插繁育能力存在差异,扦插成活率排序为：皖茶91>舒茶早>石佛翠。在扦插过程中,PPO活性均呈上升→下降→上升趋势,扦插15 d时达到高峰且皖茶91高于舒茶早和石佛翠;POD活性与扦插生根呈负相关,除石佛翠呈上升趋势外,其他2个品种均先降后升;IAAO活性除石佛翠基本无变化外,其他2个品种均呈上升→下降→上升趋势,皖茶91变化幅度比舒茶早大;这3种氧化酶与茶树扦插成活率具有明显的相关性。插穗叶片中茶多酚含量的增加也有利于插穗成活率的提高。     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。     

枸杞苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

为研究枸杞苯丙氨酸解氨酶基因LcPAL在干旱和盐逆境中的作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆了LcPAL基因(Genbank No.KX781247)。该基因cDNA长度为2 544bp,含有2 163bp的完整开放阅读框,编码720个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA),与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树表明,枸杞LcPAL与茄科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR方法检测发现,LcPAL基因在枸杞的叶中表达量最高,果实中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,但表达模式不同。研究结果推测从枸杞中克隆获得苯丙氨酸解氨酶(LcPAL),是典型的PAL家族成员,在枸杞各组织发育过程中具有重要功能,且在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程也起一定作用。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

盐芥谷胱甘肽过氧化物酶基因（ThGPX8）的克隆与原核表达

【目的】克隆盐芥谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)基因ThGPX8,对其进行序列分析,构建原核表达载体,为进一步研究ThGPX8的结构和功能奠定基础。【方法】以盐芥为材料,利用RT-PCR技术获得其ThGPX8基因的全长cDNA序列;应用生物信息学手段对该基因编码的蛋白结构和系统进化关系进行分析;构建原核表达载体pET-ThGPX8,转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。【结果】获得的ThGPX8基因序列的开放阅读框(ORF)为504bp,编码167个氨基酸,具有GPXs的特征结构域,不是跨膜蛋白;其二级结构主要由无规则卷曲组成,三级结构为二聚体。进化树分析表明,盐芥ThGPX8与拟南芥AlyGPX8、AtGPX8和油菜BnGPX8具有较高的同源性。盐芥ThGPX8与ThGPX6的理化性质存在差异,但具有相似的二级结构和三级结构。将ThGPX8转入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达得到了分子质量约23ku的蛋白,该蛋白在37℃下诱导5h可获得较高的表达量。【结论】获得的ThGPX8基因cDNA序列所编码的蛋白属于植物GPXs家族成员,利用构建的原核表达载体pET-ThGPX8转化E.coli BL21(DE3)获得了融合表达蛋白。     

纤维素降解菌中葡聚糖酶基因的克隆表达及活性

为探明约氏梭菌(Clostridium josui)中纤维小体内某个酶的功能性,从该菌属CJ-1菌株中克隆出基因片段Cel9C,大小为1943 bp,编码647个氨基酸,将该基因构建于大肠杆菌表达载体p ET28a(+)中,获得重组表达载体p ET28a-Cel9C,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中进行表达。结果表明,该酶的最适反应温度为45℃,最适反应p H为p H6.0;对大麦-β-葡聚糖(Barley-β-glucan)和魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan)具有较高的反应活性,比活值分别达到114和57 U·mg-1;几乎不能以木聚糖(Brichwood xylan)和半乳甘露寡糖(Galacto mannan)为底物。说明该酶对葡聚糖类物质时有较高的降解能力,应为葡聚糖酶。