日本结缕草ZjSPL4基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

根据转录组数据库,通过同源克隆获得结缕草ZjSPL4基因,开放阅读框为1 002 bp,编码333个氨基酸,该基因具有SBP基因家族保守域。ZjSPL4编码的蛋白分子量为36.381 63 k D,理论等电点(pI)为8.79,总平均亲水性为-0.707,属于亲水性蛋白。二级结构预测结果显示ZjSPL4蛋白主要由无规则卷曲(Cc)、α螺旋(Hh)构成。ZjSPL4蛋白与其他植物的SBP蛋白总体相似度为53.71%,通过系统进化树分析发现ZjSPL4与谷子和二穗短柄草中的SPL基因亲缘关系较近。ZjSPL4蛋白亚细胞定位结果显示,其编码的蛋白定位于细胞核中。同时日本结缕草ZjSPL4基因受到GA、ABA、蔗糖、低温的诱导,说明该基因可能参与结缕草花芽分化以及抗逆反应等过程。因此,克隆分析结缕草ZjSPL4基因可为结缕草花芽分化与抗性机制研究以及分子育种提供一定参考。     

结缕草Zjlea3基因逆境响应模式及抗逆功能鉴定

为揭示结缕草LEA蛋白在植物逆境胁迫应答过程中的作用与功能,利用RT-PCR方法从日本结缕草Meyer中克隆得到一个lea基因,命名为Zjlea3,对其进行生物信息学分析。蛋白质理化性质分析结果表明:该基因编码产物包含177个氨基酸,预测分子质量为18.3 ku,理论等电点(pI)为5.63,为亲水性蛋白,含有9个特征性的11氨基酸基序,属于LEA蛋白中的第3组成员。聚类分析结果表明:Zjlea3蛋白与高粱、石茅等耐高温物种的同源蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示:在低温、干旱和高盐胁迫下,Zjlea3基因表达量均有上调,表达量峰值分别出现在72,24,72 h,其中受低温诱导上调幅度最大。转基因酵母抗逆性分析显示:转化Zjlea3基因的酵母细胞对冷冻、高盐和高渗胁迫的耐受能力显著提升。由此推测Zjlea3蛋白参与结缕草抵御低温、干旱和高盐等非生物胁迫的调控。     

小麦胁迫相关基因TaLEAL3的克隆及分子特性分析

第3组LEA蛋白(late embryogenesis abundant protein)介导干旱、高温、高盐等非生物胁迫响应, 关于普通小麦LEA基因的研究鲜有报道。利用噬菌体原位杂交技术, 从小麦苗期干旱胁迫条件构建的cDNA文库中筛选出LEA蛋白基因TaLEAL3, 其全长750 bp, 编码区长501 bp, 编码166个氨基酸, 含有一个明显的核定位信号区。氨基酸同源性分析发现, TaLEAL3属于第3组LEA蛋白, 序列中含有由11个氨基酸组成的3个不完全重复的基序和α-螺旋的LEA结构。电子定位结果显示, TaLEAL3基因位于4BL、4DL和5AL染色体上, 主要在茎中表达, 而在根中几乎无表达。实时荧光定量PCR分析表明, 在干旱、低温和ABA诱导下, TaLEAL3基因表达量明显增加。在该基因上游1.7 kb序列处, 预测具有启动子的核心序列和增强子序列, 及与干旱和低温等多种逆境胁迫相关的调控序列。本研究为深入分析小麦LEA蛋白基因的功能, 初步解析LEA蛋白的作用机制提供了数据。     

小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因的克隆及分析

中国竹类植物资源丰富,栽培历史悠久,是集生态、经济和社会价值于一身的园林植物。本研究以小琴丝竹和凤尾竹为材料提取叶片总DNA,通过PCR扩增技术克隆得到2种竹类植物LEA3基因,其中小琴丝竹LEA3基因全长810 bp,编码区序列编码188个氨基酸,GC含量为67.9%;凤尾竹LEA3基因全长分别为810 bp和834 bp,编码区序列分别编码188个氨基酸和195个氨基酸,GC含量为67.72%和68.53%。通过DNAMAN等生物软件分析发现,小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因与其他禾本科LEA3基因同源性均在77%以上,同源性较高,且编码蛋白均属于稳定的亲水蛋白;此外,小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因均包含一个完整的开放阅读框,其编码的氨基酸均含有6个由11个氨基酸组成的保守基元序列,本研究不仅为分析其他竹类植物的脱水耐受性机制提供基础数据,同时也为竹类植物及其他农作物抗旱育种提供了科学依据。     

东北白桦(Betula platyphylla Suk.)LEA基因的克隆及盐胁迫响应基因的鉴定

LEA蛋白(late embryogenesis abundant proteins)是一类胚胎发育晚期种子中大量富集的蛋白,在植物抗逆过程中起重要作用。目前,白桦的全基因组测序工作已经完成,在此基础上,本研究根据已报导的拟南芥抗逆相关LEA基因,从白桦全基因组序列中鉴定出13个与这些抗逆LEA基因同源的白桦LEA基因。并进一步利用qRT-PCR方法研究这些LEA基因对盐胁迫的表达响应,从而鉴定出在白桦响应盐胁迫过程中起作用的LEA基因,这些盐胁迫响应的LEA基因将为白桦的抗性育种及抗逆分子生物学研究提供帮助。     

花生NBS-LRR类基因P9的克隆与序列分析

为探索花生NBS-LRR类基因在花生抗病中的分子作用机制,本研究以花生品种‘Z525’为试验材料,采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,克隆了花生叶片中的P9基因。结果表明,获得一个长度为3557 bp的序列,该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF),ORF的长度为3195 bp(93 bp^3287 bp),编码1064个氨基酸(120.4 kD),等电点pI为5.92。序列分析表明,该基因编码的蛋白与花生中假定的抗性蛋白RPP13-like及花生二倍体野生种Arachis duranensis和Arachis ipaensis推测的抗病蛋白At3g14460、RPP13-like高度相似;P9蛋白属于NBS-LRR家族,具有典型的NB-ARC和LRR-3两个保守结构域,推测该基因参与花生抗病调控过程。蛋白质亚细胞定位预测表明该基因编码的蛋白主要位于叶绿体中,可能少量分布于细胞核中,推测该基因可能主要作为叶绿体蛋白参与细胞的抗氧化、抗衰老等抗逆过程,其次作为转录因子参与转录调控作用。本研究克隆了P9基因的全长cDNA序列,并对该基因序列、结构和功能等方面进行了分析,为进一步研究花生抗病分子机制提供理论基础,同时为花生抗病品种的选育提供理论支持。     

银缕梅MADS-box家族基因PsuAP1的克隆、生物信息学表达分析

本研究以珍稀濒危植物银缕梅为材料,利用同源克隆与RACE技术克隆得到一个AP1-like基因的c DNA全长序列,命名为Psu AP1。利用生物信息学方法对它所编码的氨基酸序列进行分析,结果表明,该基因序列全长916 bp,开放阅读框长度为747 bp,编码248个氨基酸,分子质量约28.62 k D,理论等电点为9.84,是一种不稳定亲水蛋白。保守结构域分析表明该基因属于MADS-box家族基因;序列比对分析显示其氨基酸序列与连香树相似性最高,达78.57%,进化树聚类分析也表明Psu AP1与连香树的氨基酸亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示该蛋白定位于细胞核。二级结构中同时含有琢-螺旋、延伸链和无规则卷曲结构,分别占比47.18%、11.29%、41.53%。荧光实时定量PCR分析表明,Psu AP1基因在花及果实中均有大量表达,推测其与花的发育以及果实的成熟相关。Psu AP1基因的克隆以及表达分析使银缕梅开花调控机理的研究取得了新的突破,为该基因功能的进一步深入研究提供了实验材料以及理论基础。     

柠条锦鸡儿CkLEA4-3基因克隆及表达分析

胚胎发育晚期蛋白是植物在逆境胁迫下产生的一种应激蛋白质,具有较高的亲水性和热稳定性,与植物抗逆功能密切相关。本研究从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制削减杂交文库(SSH)中筛选到一条LEA蛋白编码基因的部分序列,用RACE技术扩增得到该基因cDNA全长。序列比对与系统进化分析显示,该基因没有特定结构域,它与拟南芥LEA4(AT3G53040)基因同源性最近,故命名为CkLEA4-3。该基因cDNA长971 bp,开放阅读框架长636 bp,编码211个氨基酸,推测蛋白分子量为22.44 kD,等电点为5.76,是一种亲水蛋白。利用荧光定量PCR技术检测发现,CkLEA4-3基因在干旱、ABA、NaCl和脱水处理下均受到不同程度的诱导,推测CkLEA4-3基因可能与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫有关。     

陆地棉GhLEA3基因的克隆及其响应低温胁迫表达分析

【目的】本研究旨在探索棉花GhLEA3基因的结构特征及其在低温胁迫下的表达模式,研究其抗逆功能。【方法】利用同源序列克隆法在陆地棉中克隆GhLEA3;采用生物信息学方法分析其蛋白质性质,构建系统进化树。采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白表达载体35S∷GhLEA3-GFP并进行亚细胞定位;在棉花三叶期进行叶片低温表达分析;采用农杆菌介导的花序浸染法将GhLEA3基因转入拟南芥;对T_3转基因拟南芥种子进行4℃低温萌发试验;低温处理后测转基因拟南芥叶片的电导率。【结果】GhLEA3基因编码序列全长1 218bp,编码405个氨基酸;GhLEA3蛋白含有4个功能结构域PF02987。陆地棉GhLEA3与拟南芥AtLEA3氨基酸序列之间相似性为52.6%。GhLEA3蛋白可能定位在液泡和小泡中。GhLEA3基因在低温处理的棉花叶片中上调表达。T_3转基因拟南芥低温萌发率显著高于野生型,低温处理后转基因拟南芥叶片电导率显著低于野生型。【结论】陆地棉GhLEA3属于典型的LEA3家族成员,与拟南芥AtLEA3亲缘关系最近;该基因响应低温胁迫,可能在抗冷中起重要作用。     

结缕草CBF基因的同源克隆及其转基因拟南芥的抗寒性验证

结缕草是优良的暖季型草坪草之一, 主要用于亚热带和热带地区的草坪种植。抗冷性是结缕草栽培范围的限制因子。本研究以日本最北部原产的结缕草品系为材料, 根据其他植物的已知的抗寒基因CBF序列, 通过同源克隆的方法获得结缕草中相对应的同源基因ZjCBF;根据和其他已报告的CBF序列的比对结果, 我们确定ZjCBF基因属于CBF转录因子家族基因中CBF1型基因。利用半定量PCR和实时定量PCR分析该基因在寒冷条件下的表达情况, 发现ZjCBF基因受冷胁迫的诱导, 在4℃处理6 h时表达量最高。在此基础上, 本研究构建了该基因的过表达载体, 并将其转化到拟南芥中, 通过低温冷处理实验发现, 不论是否经过冷驯化, 转基因ZjCBF的植株由于ZjCBF的过量表达都要比野生型植株抗寒性强。     

大豆转录因子基因GmDof3的克隆及非生物胁迫诱导表达分析

植物Dof (DNA binding with one finger)转录因子在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。为了探索大豆Dof转录因子与非生物胁迫的关系,本研究利用RT-PCR技术克隆了一个大豆中Dof转录因子基因GmDof3。GmDof3编码含有483个氨基酸残基的蛋白质,分子量为52.91 kD,等电点为8.11。蛋白结构预测发现,该蛋白含有一个典型Dof结合域,定位于细胞核中且含有大量磷酸化位点。进化分析表明大豆GmDof3蛋白与木豆CcDof3蛋白的同源性最高。顺式作用元件预测结果显示,GmDof3启动子序列中含多种逆境响应元件。实时荧光定量PCR表明,高盐、干旱、低温和高温均可诱导GmDof3的表达。本研究结果可以为大豆Dof转录因子在植物抗逆基因工程中的应用提供理论依据。     

大豆GmGLDH基因的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究大豆L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因Gm GLDH-Glyma.02G166300 (以下简称GmGLDH)的功能,本研究采用同源克隆法获得大豆GmGLDH基因,开展了相关生物信息学分析,并对其非生物胁迫下表达模式进行调查。结果表明,GmGLDH基因包含一个长度为1 752 bp的ORF序列,编码584个氨基酸。GmGLDH蛋白为亲水性较强的蛋白;二级结构中以无规则卷曲和α螺旋结构为主;预测亚细胞定位GmGLDH主要分布在线粒体中,分析结果并未发现跨膜结构域和信号肽结构;该蛋白序列中存在磷酸化位点56个。进化分析表明,克隆的GmGLDH氨基酸序列与菜豆、苜蓿的同源关系较近。基因上游顺式调控元件分析表明该基因可能参与光应答、激素响应、高温响应等,但光处理下大豆子叶中Gm GLDH基因的表达变化不大,且和子叶中抗坏血酸含量无相关性;4种非生物胁迫处理下大豆叶片中Gm GLDH基因是先下调后上调表达,和抗坏血酸含量变化呈反相关。本研究为进一步研究GmGLDH基因在大豆抗逆中的作用提供了重要的帮助。     

MADS-box基因GmAP3的克隆及生物信息学分析

植物MADS盒基因蛋白是一类在生物发育过程中起着重要作用的转录因子家族。本研究在前期大豆花芽转录组测序分析的基础上,利用RACE技术成功克隆了一个MADS-box基因的全长cDNA序列,利用生物信息学方法对它所编码的氨基酸基本性质和结构进行了系统分析。结果表明,该基因属于MIKC家族,为亲水性蛋白,稳定性较好;二级结构中同时含有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲结构,其中α-螺旋和无规则卷曲所占比例均较高;亚细胞定位分析显示其定位在细胞核上;聚类分析表明该基因属于AP3亚家族,该基因编码的氨基酸与拟南芥AP3蛋白的同源性为41.18%,与大豆中GmNMH7的同源性最高为97%,命名该基因为GmAP3。本研究成功克隆出GmAP3基因,为该基因的进一步研究提供实验材料,并通过生物信息学分析预测,为下一步该基因的功能研究提供依据。     

西藏青稞LEA3蛋白新抗旱基因的克隆与序列分析

以强抗旱青稞冬青8号和弱抗旱青稞品比14为材料,将幼苗经干旱诱导处理12 h提取总RNA,RT-PCR同源克隆到2个有差异的LEA3蛋白抗旱基因的全编码框序列。冬青8号、品比14的LEA3蛋白基因序列全长分别为661 bp和694 bp,其中,来源于品比14的LEA3蛋白基因编码框全长639 bp,编码含213个氨基酸残基的蛋白质,该多肽含有9个重复的、由11个氨基酸残基组成的保守基元序列。而来源冬青8号的LEA3蛋白基因与之相比较除缺少33 bp核苷酸外,另有6个碱基的差异,所编码的蛋白质也相应地缺少第4个保守基元序列,由8个重复的保守基元序列组成。二者在DNA与氨基酸序列上的同源性分别为94.38%和92.02%。结果证实抗旱性不同的青稞品种之间LEA3抗旱蛋白保守基元拷贝数有差异,推测抗旱蛋白结构的差异可能对植物的抗旱性有影响。     

海岛棉转录因子EREB5基因的克隆及特征研究

 近年来,ERF (Ethylene-responsive element binding factor) 家族转录因子已成为植物抗逆、抗病的分子机制和作物分子育种研究的热点。本研究以电子克隆、同源扩增和RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术相结合的方法从海岛棉中分离出了一条新的ERF族转录因子基因,命名为EREB5。该基因包含一个573 bp长的开放阅读框,预期编码190 aa长的蛋白质分子。序列分析表明该蛋白除含有一个ERF保守域外,还含有一段核定位信号序列、一段富丝氨酸的激活域、多种磷酸化位点和一个土豆抑制子Ⅰ型家族基序等。构建系统发育树分析表明该因子属于ERF亚家族B3亚组。瞬时表达实验证明该因子定位于细胞核内,同时,凝胶阻滞实验结果说明EREB5蛋白和GCC盒具有较强的结合能力。再者,荧光定量PCR结果表明乙烯和黄萎病菌处理可以诱导该基因的表达。这些结果暗示EREB5蛋白很可能在黄萎病抗性机制中扮演者重要角色。     

药用野生稻OoLEA1基因的克隆和生物信息学分析

药用野生稻积累了丰富的遗传多样性和有利基因,是水稻遗传改良的重要基础资源。LEA蛋白在植物抗逆反应起着重要的作用。本研究在药用野生稻干旱胁迫差异转录谱数据分析基础上,利用RT-PCR方法从药用野生稻克隆了OoLEA1基因,OoLEA1的开放阅读框长度为603 bp,编码一个由200个氨基酸残基组成的蛋白,分子量为20.73 k D,理论等电点为6.61。OoLEA1蛋白含有4个LEA_4结构域、8个α-螺旋构象和1个β-片层构象,该蛋白为亲水蛋白。OoLEA1受干旱和高温诱导表达,说明OoLEA1可能在水稻抗旱和抗高盐胁迫中发挥作用。     

油菜O-acetylserine (thiol) lyase isoform A(OASTL)基因的克隆及序列分析

植物OASTL蛋白是半胱氨酸生物合成过程中的关键酶,催化半胱氨酸合成的最后一步。克隆低镉积累基因型油菜中OASTL基因,为研究该基因在镉积累过程中的功能提供参考。本研究以镉低积累品种美国‘油王88’幼苗为材料,采用同源克隆法PCR扩增OASTL基因,并对其进行生物信息学分析。克隆得到美国‘油王88’OASTL基因cDNA编码区长为969 bp,编码322个氨基酸;编码蛋白的理论分子量为33.9 kD,理论等电点为5.50,溶液中的不稳定指数为27.45,为稳定蛋白,属于磷酸吡哆醛(PLP)依赖型的β-取代丙氨酸合成酶超家族成员。氨基酸序列聚类分析表明,其与花椰菜和小白菜的相似性最高。亚细胞定位预测分析表明,OASTL蛋白定位于细胞质中,推测OASTL蛋白主要在细胞质中发挥重要作用。OASTL基因的克隆及其结构、性质与功能的初步分析,为油菜抗重金属育种提供理论基础和基因资源。     

蔗茅EfNAC基因的克隆和生物信息学分析

为了更好地利用甘蔗野生种蔗茅(Erianthus fulvus Ness.)的抗逆相关基因,并为转基因甘蔗抗逆育种提供可靠的候选基因。本研究利用电子克隆和RT-PCR的方法在蔗茅野生种‘蔗茅99-2’中克隆到一个干旱诱导表达基因,并命名为FfNAC (GenBank登录号:MT499790)。生物信息学分析表明,FfNAC基因ORF长度为765 bp,共编码254个氨基酸,具有一个保守的NAM结构域。编码的蛋白以无规则卷曲和α-螺旋为主,没有信号肽,具有多个磷酸化位点,没有跨膜结构。本研究为深入研究蔗茅干旱胁迫的分子调控机制和转基因甘蔗抗旱育种提供理论依据和技术支撑。     

小麦wzy2-1基因的克隆及功能分析

脱水素是一类植物胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA蛋白),属于LEA D-11家族,植物受非生物胁迫会大量表达。利用同源克隆技术,从郑引1号小麦中克隆了1个Kn型脱水素基因,命名为wzy2-1。该基因全长1740bp,编码579个氨基酸,含有9个保守的K片段,与大麦的Dhn5基因具有较高同源性。生物信息学预测该蛋白属于高度亲水性的无序蛋白。通过该蛋白对大肠杆菌的保护作用研究表明,WZY2-1蛋白能够提高大肠杆菌对低温、高温、高盐以及高渗胁迫的耐受性。荧光实时定量PCR分析表明,wzy2-1基因受低温、盐渍、干旱诱导表达,但不受外源ABA诱导,说明wzy2-1基因属于非ABA依赖型脱水素基因。     

木薯MeAnn1基因的克隆及表达分析

以华南8号木薯为材料,采用RT-PCR技术,克隆得到1个具有完整阅读框的木薯膜联蛋白基因,命名为MeAnn1(Gen Bank序列号为:KM975562),该基因CDS序列长度为951 bp,编码317个氨基酸。生物信息学分析发现,其理化性质、蛋白保守结构域及多个蛋白功能位点与已报道的植物膜联蛋白一致。进化树分析表明,木薯MeAnn1与Ptr Ann6、At Ann1、At Ann2、At Ann6和Ann Bj1具有较近的亲缘关系,具有59.9%~84%的序列相似性。细胞定位结果表明MeAnn1蛋白主要定位于细胞质和细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,木薯膜联蛋白基因MeAnn1的表达受多种非生物胁迫的诱导,其中低温胁迫下基因表达量上调幅度最大,为对照表达量的24倍;但对H2O2胁迫不敏感。本研究结果有助于进一步研究MeAnn1基因的功能及木薯抗逆的分子机理。