黄曲霉毒素B1检测ELISA条件的优化

采用黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白偶联物(AFB1—BSA)抗原免疫Balb/C小鼠获得特异性抗体。以AFB1—STI为检测抗原,利用此抗体,进行间接竞争ELISA法试验。通过正交实验确定了最佳抗原包被反应质量浓度为1.0μg/mL;最佳抗原包被条件为:4℃过夜,一抗和酶标二抗IgG—HRP;最佳稀释度为1∶200000和1∶5000。在此优化条件下制备的抗体检测黄曲霉毒素B1具有很高的特异性和灵敏性,具有实际应用价值。     

人工合成氯霉素抗原免疫血清效价的比较及多克隆抗体的制备

【研究目的】人工合成氯霉素抗原及氯霉素多克隆抗体的制备,比较氯霉素人工抗原免疫血清效价。【方法】采用重氮化法,分别以BSA、OVA为载体蛋白合成CAP-BSA,CAP-OVA两种完全抗原,并对两种合成抗原的免疫效果进行比较。分别以这两种抗原作为免疫抗原用弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔,免疫四次后,心脏采血,分离血清,再用两种抗原分别作为包被原对兔血清进行间接竞争ELISA分析。【结果】大白兔经免疫后产生了抗氯霉素特异性抗体,两种抗原得到的抗体效价均达到1:8100,氯霉素最低检出限为9ng/mL。【结论】综合比较认为,CAP-OVA作为免疫原,CAP-BSA用作包被原是比较理想的实验方案,可用于制备氯霉素抗体和研制生产氯霉素酶联免疫试剂盒。     

沙拉沙星单克隆抗体制备及鉴定

为制备敏感性好、亲和力高、特异性强的抗沙拉沙星(Sarafloxacin,SARA)单克隆抗体,采用碳二亚胺法合成SARA人工抗原,通过免疫BALB/c小鼠,选择血清效价高且敏感性好的小鼠,采用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,筛选分泌抗SARA单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;采用体内诱生腹水法制备SARA mAb,通过间接ELISA和间接竞争ELISA对SARA mAb的免疫学特性进行鉴定。结果表明:小鼠经免疫原免疫后,小鼠多抗血清效价均达到1∶128 000。选择敏感性较好的2号小鼠进行细胞融合,经多次亚克隆后,筛选出1G3、3H3两株杂交瘤细胞株,其中1G3所产SARA mAb效价较高,为1∶512 000,IC_(50)为6.34 ng/mL,亲和常数为8.55×10~8L/mol,与诺氟沙星的交叉反应率为1.06%,与其他药物交叉反应率均低于0.50%。     

丙烯酰胺人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

摘 要：利用偶联方法合成丙烯酰胺人工抗原,通过免疫方法获得抗丙烯酰胺多克隆抗体;应用戊二醛法将丙烯酰胺与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,并对这两种物质及其复合物进行紫外扫描,并用此复合物免疫兔子,利用间接酶联免疫吸附法测定抗体的效价;应用牛血清白蛋白与丙烯酰胺偶联人工抗体成功,抗体效价大于8100;应用人工抗原免疫成功制备抗丙烯酰胺多克隆抗体。     

环丙沙星单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

用EDC法将BSA和OVA分别和环丙沙星（Ciprofloxacin, CIP）偶联作为免疫原和包被原,并经紫外扫描 (UV Scan)、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。用合成的BSA-CIP免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌CIP单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备CIP mAb,对CIP mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明BSA-CIP人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-4;其中2号小鼠血清CIP抑制效价较高且IC50最低,达48.59μg/L,融合后筛选出Z3G12B3和Z2H8C10两株敏感特异的杂交瘤细胞,其两株细胞培养上清液效价为1:512,腹水效价为1:2.56×105,Z3G12B3株对CIP的IC50为2.47μg/L,与二氟沙星、沙拉沙星有小于0.03％的交叉反应性,与其他抑制物无交叉反应性。本试验获得了高效价、敏感、特异的抗CIP mAb,为CIP残留ELISA检测试剂盒和试纸条的建立奠定了坚实的基础。     

特布他林人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

合成并鉴定特布他林（Terbutaline,TBL）人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源TBL多克隆抗血清。分别通过1,4丁二醚法和EDC法将特布他林偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-TBL和包被抗原OVA-TBL,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行鉴定,通过动物免疫试验获得鼠源多抗血清,并使用ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行了鉴定。结果表明半抗原TBL分别和载体蛋白BSA及OVA偶联成功;受免6只小鼠效价均达1×10-4以上,且1号小鼠多抗血清抗TBL的IC50为55.88 ng/mL。本试验成功合成了TBL人工抗原,并生产了高效价、高敏感性的鼠源多克隆抗血清,为TBL单克隆抗体制备及其快速检测试剂的研制奠定了坚实的基础。     

绵羊FecB基因的原核表达及其抗体制备

为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。     

植物甜蛋白马宾灵(MabinlinⅡ)多克隆抗体的制备与鉴定

马宾灵(Mabinlin Ⅱ)是中国所特有的植物马槟榔种子中的甜味蛋白,将其作为新型甜味剂有着广阔的市场前景。为了给重组马宾灵的基因工程应用提供可靠的蛋白质检测与鉴定的抗体,通过离子交换法从马槟榔(Capparis masaikai Lévl)种子中分离纯化马宾灵,将其作为抗原免疫新西兰大白兔,收集免疫后血清经抗原亲和纯化制备马宾灵多克隆抗体。结果表明,制备的马宾灵多克隆抗体经ELISA检测效价比达到1:256000,Western-blot检测表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的马宾灵多克隆抗体可用于马宾灵在不同生物反应器中表达的检测,为马宾灵的基因工程研究提供灵敏可靠的免疫学鉴定。     

伊维菌素人工抗原的制备及鉴定

为制备伊维菌素人工完全抗原,通过对伊维菌素进行化学修饰,引入活性基团羧基,合成具有半抗原结构特征的伊维菌素半琥珀酸酯。然后采用NHS法将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,制备人工免疫原IVM-BSA和检测原IVM-OVA,经SDS-PAGE和紫外光谱扫描鉴定。用人工免疫原IVM-BSA免疫Balb/c小鼠,间接竞争ELISA法测定抗血清效价。结果发现：偶联物IVM-BSA和IVM-OVA的偶联比分别为14.1:1和14.7:1,免疫小鼠抗血清效价达到1:12800,结果说明成功制备出人工完全抗原并且具有良好的免疫原性。     

大肠杆菌内毒素多克隆抗体的制备与纯化

为制备大肠杆菌内毒素多克隆抗体,应用大肠杆菌内毒素作为抗原免疫5周龄家兔,辛酸-硫酸铵法和葡聚糖凝胶层析法分离提纯抗血清,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳方法鉴定多抗纯度,紫外分光光度计测定抗体蛋白含量,ELISA法检测抗血清效价与交叉反应;大肠杆菌内毒素抗体含量和效价分别为6.95mg/ml和1:12800;成功制备出抗大肠杆菌内毒素多克隆抗体,为大肠杆菌内毒素病诊断试剂盒的研制奠定基础。     

抗雌二醇单克隆抗体的制备与鉴定

活化雌二醇（E2）C3处的酚-OH,与牛血清白蛋白（BSA）偶联,制备得E2的完全抗原,利用完全抗原免疫动物,采用单克隆抗体技术,经过细胞融合、克隆筛选、扩大培养、动物体内诱生腹水等过程,最后获得了E2的单克隆抗体,对纯化的单克隆抗体的性质鉴定,结果显示：其抗体效价为1:106,抗体属于IgG2a型;分子量为179000Da;E2单克隆抗体的亲和常数Kaff＝2.9×108L/mol。     

叶酸人工抗原合成及免疫抗血清的鉴定

叶酸是人体必需的营养物质,叶酸的缺乏可以引起神经管畸形等多种疾病,建立叶酸的快速检测方法对营养强化食品的质控以及临床研究具有重要意义。本实验通过活化酯法合成叶酸-牛血清白蛋白（FA-BSA）人工免疫原,通过混合酸酐法制备叶酸-卵清蛋白（OVA）包被原。通过紫外扫描和免疫动物进行人工抗原的合成鉴定。根据BSA、OVA的含量以及人工抗原、BSA、OVA及叶酸（FA）的紫外吸收曲线在280nm处的摩尔吸收值,计算出叶酸与BSA的偶联比为1：3.84, 叶酸与OVA的偶联比为4.70。利用合成的叶酸人工抗原免疫小鼠,三免后眼眶内眦静脉采血,采用间接ELISA方法测定免疫小鼠多抗血清效价在128,000以上,叶酸对抗血清的IC50为14.82ng/ml;由此表明叶酸人工免疫原合成成功,为进一步研究叶酸单克隆抗体奠定基础。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CryIA单克隆抗体的制备及在转Bt基因棉毒蛋白检测上的应用

用苏云金杆菌菌株HD-1和HD-73分别发酵培养制备了孢晶混合物，孢晶混合物经分离、纯化、电泳得到CryIA、CryIA(c)杀虫晶体蛋白。用CryIA和CryIA(c)分别免疫家兔制备了两种多抗。用CryIA免疫小鼠，经细胞杂交、融合、克隆后筛选出4个单克隆株系A4F5F11、B4E6C7、B4E6D8、B4F5G11。用CryIA(c)多抗包被，B4E6D8上清液作为夹心抗体成功地建立了双抗夹心 ELISA，并检测了中棉所30、NUCOTN33B蕾期叶片中毒蛋白的含量，结果分别为23．4ng·g-1 FW、24．7ng·g-1 FW。     

孕酮人工抗原的合成及间接ElISA法鉴定

摘要：本研究采用二环己基碳二亚胺法将孕酮衍生物P4-11α-半琥珀酸酯与载体BSA和OVA进行偶联,制备了孕酮人工完全抗原（免疫原和检测原）,然后免疫Balb/c小鼠,制备孕酮多克隆抗体。用紫外光谱扫描法鉴定偶联是否成功并用间接Elisa法对孕酮多克隆抗体进行鉴定;结果显示,孕酮和BSA、OVA的偶联比分别为18:1、10:1,免疫血清孕酮抗体效价高达1：25600,这说明成功制备了免疫原和检测原,为孕酮胶体金试纸条的研制奠定了基础。