转基因小麦外源品质基因1Dx5表达的遗传研究

转基因小麦B72-8-11b中外源品质基因1Dx5表达量是内源相应基因表达量的6倍。利用小麦转基因品系为父本，常规品种鄂麦12、鄂麦18和日喀则8号分别为母本，配置3个杂交组合。采用SDS—PAGE技术，检测各组合亲本、F1、F2代的HMW-GS组成，研究转基因小麦B72-8-11b中外源品质基因1Dx5表达的遗传。结果表明：外源1Dx5基因有功能拷贝整合在1个位点，如同内源品质基因，遵从孟德尔遗传模式。这对育种选择策略的制订具有指导意义，也表明了基因枪转化法能够使得外源基因有功能拷贝整合在1个位点并能稳定传递。     

小麦品系2004s-47的1Dx基因的克隆与序列分析

明确 2004s-47品系 1Dx基因的序列,为寻找新的优质 HMW-GS类型、实现小麦品质的改良及育种提供理论依据。应用 SDS-PAGE对 2004s-47品系中 HMW-GS的亚基组成进行分析,用 PCR技术克隆1Dx亚基基因并用 DNAMAN软件进行序列分析。结果从 2004s-47品系中扩增出了大小为 2514 bp的基因。该基因具有典型的小麦 HMW-GS x-型基因序列结构特征。又因为 1D比 1A和 1B基因组中的 x-型和 y-型基因易表达,结合 SDS-PAGE的结果,所以 2004s-47品系中 HMW-GS的亚基组成为(Null, 7+8, ?+10)。序列比对表明, 2004s-47品系的 1Dx？基因与节节麦(Aegilops tauschii) 1Dx2.1t (AF480486)同源性最高。将该序列提交到 NCBI,获得序列登陆号为： KP702118。2004s-47品系中 1Dx？序列的确定,为原核表达确定1Dx？是否为新的基因提供了基础,也为品质改良及育种提供了依据。     

更正启事

《分子植物育种》第7卷第2期398-406页《利用转基因技术改良小麦品质的研究进展》一文中第401页:王广金等(2002)对转基因小麦植株(T0)及后代株系(T1～T5)的SDS-PAGE分析表明,外源1Dx5和1Dy10     

节节麦HWM-GS D~tx5与普通小麦HWM-GS Dx5亚基的AS-PCR鉴别

高分子量谷蛋白(HMW-GS)是小麦的重要储藏蛋白之一,决定小麦烘烤品质,其中HMW-GS Glu-D1位点与面包烘烤品质的关系最为密切。人工合成小麦(synthetic hexaploid wheat,SHW)继承了节节麦D基因组丰富的遗传变异,是高效利用野生祖先种优良基因的重要桥梁资源;近年来随着人工合成小麦在小麦遗传育种中的不断应用,来自节节麦类群的大量高分子量谷蛋白亚基类型越来越多的涌向普通小麦。而传统SDS-PAGE无法区分节节麦HMW-GS Dtx5和普通小麦Dx5亚基,鉴于此本研究利用节节麦HMW-GS Dtx5亚基和普通小麦HMW-GS Dx5亚基DNA序列之间存在的几个SNPs差异开发出等位特异PCR(allele specific polymerase chain reaction,AS-PCR)引物,通过PCR方法来区分两种不同来源的5亚基。结果显示,所设计出的两对引物都能够扩增出清晰稳定的目标条带,并且两对引物的扩增结果一致,含HMW-GS Dx5亚基的表现为阳性带,含节节麦来源的Dtx5亚基表现为阴性;同源性分析表明Dtx5亚基与Dx2亚基氨基酸序列的同源性要高于Dtx5与Dx5之间的同源性。     

利用SDS-PAGE鉴定转基因小麦HMW-GS的表达类型和后代遗传

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在蛋白质水平上对T2～T5代小麦转基因株系高分子量谷蛋白亚基(HMW—GS)的遗传表达及其分离进行了鉴定和分析。结果发现，外源1Dx5和1Dy10基因在T2代部分株系中表达；在有的株系中出现了原亚基(8亚基)的缺失或沉默和新亚基(暂定8^*)的产生，因而检测出2 5 10 12，2 5 7 8^* 10 12，5 7 10，2 7 10 12的多种类型。对2 5 10 12型株系进行了多代跟踪分析，发现其在T2～T5代陆续发生分离，存在于不同单株、不同单穗的子粒和同一单粒后代之间。经筛选，获得了天然不存在的亚基类型为2 5 10 12，2 10 12，2 5 12等稳定表达的种质创新株系。     

转基因小麦后代HMW-GS组成的变异研究

转基因技术应用于作物品种改良,要求外源基因稳定整合与表达,并且生物环境和自身遗传背景不被干扰[1].目前流行的植物转基因方法,需经历基因转移、组织培养再生植株和转基因植株的选择与繁殖等环节,每个环节都有可能产生不可预测的变异.有些变异与外源基因导入有关.Bregitzer等(1998)应用基因枪法获得转基因大麦,认为重要农艺性状抽穗期的延长是转化步骤引起了体细胞无性系变异[2].但有些变异与外源基因导入无关.Phan等(1996)把转基因水稻植株中基因组变异归因于组织培养[3].Barro等(2002)在田间评价转基因小麦的农艺性状时,没有发现因转化或组培引起表型变异[4].转基因植物在有性繁殖过程中,多拷贝外源基因也会对自身遗传背景产生影响[5].表型变异的原因可能是特定生化过程或蛋白质发生了质或量上的变化,但很少见遗传转化对植物内源非靶蛋白质影响的报道.     

小麦×玉米杂交双单倍体后代的HMW-GS组成和易位分析

为了提高优质小麦的育种效率,在早代明确高分子量谷蛋白亚基和醇溶蛋白的组成,增加育种的针对性,以1个小麦杂交组合的296个DH株系群体为试材,采用半粒SDS-PAGE法检测麦谷蛋白,且用A-PAGE检测了醇溶蛋白。结果表明:母本衡09-6324的HMW-GS构成为null、7+9、2+12,是有Sec-1特征带的1BL/1RS易位系品种,父本师栾02-1亚基组成1、7+9、5+10,是非1BL/1RS易位系品种。296个DH株系共鉴定出6种不同的HMW-GS类型,均为父母本表达亚基类型的再分配,无变异类型。与面包加工品质呈正相关的5+10亚基出现频率为35.13%。DH株系材料中1BL/1RS易位系类型的占54.05%,1、5+10优质亚基同时出现,且没有Sec-1表达的占15.20%,这些株系可作为新的面包小麦种质资源使用。采用半粒SDS-PAGE和A-PAGE法对育种早代的优异单株进行有效鉴定和选择,可以提高优质小麦育种效率。     

半粒法综合鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基研究

高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是决定小麦食品加工品质的重要因素。为了快速而全面地鉴定小麦品种或杂交后代的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS),本研究以宁春4号、扬麦19号和宁春4号×扬麦19号F2分离群体种子为研究对象,采用半粒法进行综合鉴定。即先从小麦胚端1/3~1/2处切除种子胚乳提取DNA,用分子标记快速筛选出含5+10亚基的籽粒,再从这些籽粒提取的DNA残留物中提取蛋白质,采用SDS-PAGE电泳法从总体上确定其HMW-GS的组合,从中筛选出含1,17+18,5+10亚基的籽粒。结果表明,在96粒F2分离群体种子中,有31粒种子被PCR鉴定为5+10纯合亚基,再经SDS-PAGE电泳鉴定,确定有14粒含1,17+18,5+10优质亚基,其中4粒种子的亚基组合为1,17+18,5+10。与之前的研究相比,半粒法能充分利用实验样品,快速筛选到含有优质亚基组合的籽粒,有助于优质小麦育种。     

利用SDS-PAGE和AS-PCR标记鉴定簇毛麦HMW-GS基因

本研究通过SDS-PAGE和AS-PCR标记对簇毛麦HMW-GS进行鉴定,对于快速鉴别导入到普通小麦中的簇毛麦HMW-GS和改良普通小麦品质具有重要意义。利用SDS-PAGE对中国春、钱尼、簇毛麦、6个中国春-簇毛麦二体附加系、普通小麦-簇毛麦3V异代换系进行HMW-GS组成分析,进一步确定簇毛麦HMW-GS基因位于1V染色体。根据已发表的普通小麦HMW-GS基因序列同源性比较结果,设计了3对分别扩增普通小麦x-型亚基基因、y-型亚基基因以及所有HMW-GS基因的特异引物。经过对簇毛麦HMW-GS基因进行扩增发现,这3个AS-PCR标记都能很好地鉴别簇毛麦HMW-GS编码基因,并从分子水平上把簇毛麦HMW-GS基因定位于簇毛麦1V染色体上。     

抗根腐病的TaMYB86过表达转基因小麦的创制与分子功能鉴定

小麦根腐病是一种难以防治的小麦土传病害。TaMYB86是一个小麦中受根腐病菌诱导表达的MYB编码基因。本文构建了TaMYB86的过表达转基因载体pUbi:MYC-TaMYB86,利用基因枪介导法将其转入推广小麦品种扬麦16。对转TaMYB86基因小麦T0-T3代植株进行分子特征分析和抗病鉴定。PCR检测结果表明,外源TaMYB86已转入3个转基因小麦株系中; qRT-PCR结果显示,TaMYB86在3个转基因小麦株系中的表达量显著高于在未转基因扬麦16中,约为未转基因扬麦16中的5~6倍,表明TaMYB86可在转基因小麦中过量转录; Western杂交结果表明,引入的TaMYB86可在上述3个转基因小麦株系中翻译表达。对转TaMYB86基因小麦与未转基因扬麦16进行根腐病菌接种与抗病鉴定表明,3个转TaMYB86基因小麦株系在T1-T3代的根腐病病情指数分别为31.75、50.00、45.00; 37.75、37.50、38.50; 41.75、31.25、37.50; 在3次鉴定中未转基因扬麦16的根腐病病情指数分别为75.04、54.17、65.38,转TaMYB86基因小麦T1~T3代的根腐病抗性均显著高于未转基因扬麦16 (P < 0.01)。与未转基因扬麦16相比,转TaMYB86基因小麦中3个下游防卫基因(PR10、PR17c和Chit1)的转录水平也显著上调。以上结果说明,TaMYB86过表达可显著增强转基因小麦的根腐病抗性,在小麦防御根腐病过程中起正向调控作用。     

过表达TaPK-R1基因增强了小麦对纹枯病的抗性和耐冻性

小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)和倒春寒是小麦生产中重要的生物和非生物胁迫因子,本研究目的是利用转基因技术改良小麦的纹枯病抗性和耐冷性。利用构建的转基因载体pAHC25-MYC-TaPK-R1,通过基因枪介导法,将小麦AGC蛋白激酶基因TaPK-R1导入春小麦品种扬麦20,获得TaPK-R1过表达的转基因小麦。对T1至T4代植株进行PCR、RT-PCR、qRT-PCR、Western blot分析,筛选到3个转基因小麦株系,外源TaPK-R1基因能够在其植物体内遗传和超量转录,并翻译成蛋白质。利用致病力不同的R. cerealis菌株R0301和WK207,分别对3个转基因株系T1至T2代和T3至T4代进行纹枯病抗性鉴定,发现TaPK-R1过量表达提高了转基因小麦的纹枯病抗性,3个转基因株系各世代的纹枯病平均病级为1.16~2.11, 病情指数为23.20~42.10,而对照扬麦20的纹枯病病级为2.55~3.60,病情指数为51.00~72.00。用?9℃低温处理三叶一心期小麦幼苗24 h,对照扬麦20的存活率为17%,3个转基因小麦株系的存活率分别为52%、79%和96%。上述结果表明,TaPK-R1过量表达能显著增强小麦对纹枯病的抗性及对冻害的耐受性, 所获得的3个转基因小麦株系可作为潜在的抗源材料。     

小麦高分子量麦谷蛋白亚基多重PCR扩增体系的建立

小麦的加工品质与小麦高低分子量麦谷蛋白的组成和含量密切相关,特别是Glu-1位点编码的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)的组成和含量.其中与好的加工品质相关的优质亚基如1Dx5、1Ax2*和1Bx7OB(over-expression)特异的分子标记已经被建立并应用于品质改良的分子育种.本研究的目的在于通过摸索PCR反应组分和循环参数对多重PCR反应结果的影响,建立一次反应能够同时鉴定1Ax2*、1Bx7OE和1Dx5亚基的多重PCR反应体系.结果表明:反应体系中的三种亚基的引物浓度比例和反应的Tm值是多重PCR成败的关键因素,当引物浓度比例为1Dx5:1Bx7CEL:1Ax2*=0.1:0.2:0.3或1Dx5:1Bx7OE:1Ax2*=0.1:0.2:0.4,Tm=60℃时1Ax2*、1Bx7OE和1Dx5亚基的多重PCR结果最好.利用HMW-GS的多重PCR的方法可以快速高效的鉴定多个亚基,可以进行小麦品质育种的复合分子标记辅助选择.     

簇毛麦新型HMW-GS的序列分析及加工品质效应鉴定

利用设计的HMW-GS特异引物,从簇毛麦TA10220中克隆到6条HMW-GS基因序列(1.0~1.7 kb, GenBank登录号为KF887414~KF887419),比普通小麦HMW-GS基因序列小,其中KF887414~KF887417为能正常表达的基因,KF887418和KF887419是编码区出现终止信号的假基因。综合推导氨基酸的序列分析以及基于编码蛋白全序列、N-端和C-端域的进化树分析,认为KF887414属于y型HMW-GS,KF887415~KF887419的氨基酸序列同时具有x和y型的结构特征。将具有完整编码区的4个基因在宿主菌Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析表达的蛋白质和种子提取的HMW-GS,经Western blot进一步检测表达产物,证明蛋白质表达成功。通过His-Trap HP柱纯化表达蛋白,回收产物经SDS-PAGE分析后,低温冷冻干燥备用。将冷冻干燥的回收产物加入中国春基础面粉中,利用微量掺粉试验通过测定粉质参数来鉴定簇毛麦来源的HMW-GS对面粉品质的影响,结果表明,簇毛麦来源的4个HMW-GS对于面粉加工品质具有显著的正向效应。     

相同HMW-GS组分春小麦谷蛋白大聚合体研究

高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）组成与小麦品质密切相关。其中Glu-ID5＋10已作为重要,选择标记应用于优质育种。但实践表明,虽然有些品种（系）的HMW-GS评分很高,但品质类型并不理想。而且有的相差很大。因此,为了探讨在优质亚基（1Dx5＋1Dy10）存在条件下小麦品质差异形成的原因．选用了4个HMW-GS组成相同的强筋小麦,在相同的HMW-GS遗传背景下,结合不同的施肥水平,对麦谷蛋白大聚合体含量进行了分析。结果表明,在低肥和中肥条件下,龙辐970189的GMP含量表现最高．龙麦26次之。龙辐98N2或龙-4081为最低。在高肥条件下为：龙麦26〉龙辐970189〉龙-4081〉龙辐98N2。而且4个品种（系）的GMP／蛋白质比值也存在显著差异。综合研究表明,龙麦26和龙辐970189的GMP含量及其与蛋白质的比值更大。这与黑龙江省多年生产结果相一致,即龙麦26和龙辐970189的品质表现更为突出。     

小麦高分子量麦谷蛋白亚基组成和检测研究进展

小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)组成与面包品质密切相关。为了从目前经常使用的一些HMW-GS检测方法中选择满足试验要求的最佳方法,笔者总结了HMW-GS组成,以及利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),反相高效液相色谱(RP-HPLC)和聚合酶链式反应(PCR)三种方法检测小麦HMW-GS组成的应用和研究进展,讨论了3种方法检测小麦HMW-GS组成的优缺点,指出常规育种材料或栽培小麦品种优先选择SDS-PAGE和PCR方法检测小麦中的HMW-GS,这两种方法适合对材料中亚基组成进行检测;而含有远缘遗传物质的小麦或近缘种属结合双向电泳或RP-HPLC方法检测HMW-GS,这两种方法适合发现新的亚基类型或对分子量接近的亚基进行检测。最后展望了SDS-PAGE和PCR方法在小麦分子标记辅助育种中应用前景。     

小麦wx-B1a基因片段的克隆及其RNAi载体构建

为了获得小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体,以小麦品种‘京花1号’开花12天的籽粒为材料,用天根公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA,以wx-B1a基因(GenBank NO:AB019623)的cDNA序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR克隆了wx-B1a基因部分cDNA片段.Blastn结果显示,它与GenBank上报道的Triticum aestivum wx-1 gene (GenBank NO:EU719611.1)同源.通过酶切连接将此片段分别置于拟南芥FAD2的Intronl (GenBank NO:AJ271841)的上、下游,然后将此发夹结构置于小麦HMW-GS 1Dx5启动子的下游,从而构建了小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体pBAC47p-wx-Bl aIR.从而为下一步转化高产强筋小麦品种培育优质面条专用小麦奠定基础.     

小麦wx-B1a基因片段的克隆及其RNAi载体构建

为了获得小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体,以小麦品种‘京花1号’开花12天的籽粒为材料,用天根公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA,以wx-B1a基因(GenBank NO:AB019623)的cDNA序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR克隆了wx-B1a基因部分cDNA片段。Blastn结果显示,它与GenBank上报道的Triticum aestivum wx-1 gene(GenBank NO:EU719611.1)同源。通过酶切连接将此片段分别置于拟南芥FAD2的Intron1(GenBank NO:AJ271841)的上、下游,然后将此发夹结构置于小麦HMW-GS 1Dx5启动子的下游,从而构建了小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体pBAC47p-wx-B1aIR。从而为下一步转化高产强筋小麦品种培育优质面条专用小麦奠定基础。     

小麦高分子量谷蛋白亚基与小麦品质性状关系的研究

采用SDS-PAGE方法, 通过对4个优质亲本与3个农艺亲本间杂交获得的F2群体的每一单株及其亲本进行小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成分析, 并对每一F2单株上F3籽粒群体的高分子量谷蛋白亚基组成与其籽粒蛋白质含量、 SDS-沉降值的关系进行研究,结果表明：小麦高分子量谷蛋白亚基组成不同的群体间籽粒蛋白质含量差异不显著     

兼抗全蚀病和白粉病小麦新种质的创制与鉴定

TaLTP5是从小麦中分离到的一个脂质转移蛋白编码基因。利用基因枪介导法将TaLTP5表达载体pA25-TaLTP5转入抗白粉病的小麦品种扬麦18 (含抗白粉病基因Pm21)中, 旨在选育兼抗全蚀病和白粉病的小麦新种质。对转基因小麦T₀~T₃代植株中引入TaLTP5基因进行分子检测和抗病性鉴定。PCR检测、Southern杂交分析结果表明, 外源TaLTP5基因已转入、整合到3个转基因小麦株系的基因组中, 并能稳定遗传; 荧光定量RT-PCR的分析以及全蚀病菌的接种与鉴定结果表明, 与受体小麦扬麦18相比, 这3个转基因小麦株系中TaLTP5表达量显著提高, 其对全蚀病的抗性也明显增强。对3个转基因株系的Pm21分子标记和白粉病抗性鉴定表明, 外源TaLTP5基因的导入没有影响受体小麦对白粉病抗性, 说明这些转基因株系为兼抗全蚀病和白粉病小麦新种质。     

过量表达拟南芥NPR1基因提高小麦纹枯病的抗性

拟南芥NPR1基因是植物重要的抗病调控因子,转基因过表达该基因可以赋予植物广谱抗性.为明确该基因在小麦抗纹枯病基因工程中的应用潜力,本研究构建了由玉米ubiquitin启动子驱动的拟南芥NPR1表达载体,采用基因枪介导法导入到小麦品种扬麦12号中,获得20株转基因植株.对14个外源基因纯合株系的半定量RT-PCR和测序分析结果显示,外源拟南芥NPR1基因已经导入转基因小麦并有不同水平的表达,部分转基因株系拟南芥NPR1基因发生重排；纹枯病抗性鉴定结果表明,转基因株系中拟南芥NPR1基因的正确表达可以减轻纹枯病菌引起的病症发展,提高转基因小麦的纹枯病抗性.