牛体外受精胚胎在不同温度下保存后的存活率

本研究探讨了保存温度和保存时间对牛体外受精胚胎存活率的影响。试验１测定第７，８ｄ的囊胚分别在４℃，２０℃和３９℃下保存（或培养）４～６ｈ，２４ｈ和４８ｈ后在体外培养的孵化率。在４℃下保存的胚胎的孵化率分别为７１．２％，５７．１％及２７．０％，显著低于对照组（８７．８％，Ｐ＜０．０１）。在２０℃和３９℃下保存（或培养）４～６ｈ不影响胚胎孵化率（分别为８４．９％，８５．９％），但保存２４ｈ和４８ｈ后，孵化率均显著降低（Ｐ＜０．０１）。试验２用ＰＲＩＤ阴道栓处理青年母牛，使其发情同期化，在发情开始后的第７ｄ，用非手术法给每头母牛移植２枚在２０℃下保存３～７ｈ或１８～２４ｈ的囊胚。移植保存３～７ｈ的胚胎获得的妊娠率、双胎率分别为７１．０％和５０．０％；移植保存１８～２４ｈ的胚胎的妊娠率显著降低（４１．５％），但双胎率（４１．２％）与保存３～７ｈ者无显著差异（Ｐ＞０．０５）。     

西门塔尔牛在广西超排及胚胎移植效果初报

在广西不同季节利用西门塔尔牛进行超数排卵及重复超数排卵,并利用广西本地黄牛和杂交黄牛作受体进行胚胎移植。结果表明:超排平均每头次获可用胚胎7.1枚,鲜胚移植受胎率50%,冻胚移植受胎率44.4%。     

不同发育阶段和质量的牛体外受精胚胎冷冻后的效果

胚胎的冷冻是用二步降温法，将胚胎降至－２５℃，并直接投入液氮。试验Ⅰ，将６～８日龄的牛胚胎置于显微镜下，按发育期把胚胎分成桑椹胚、早期囊胚、囊胚、扩展囊胚四个阶段，然后分别平衡在１．５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖ＰＢＳ液中，２０ｍｉｎ后进行冷冻。解冻后，各阶段的胚胎孵化率分别为：２９．０％，７３．２％，７４．６％，６１．２％。桑椹胚的孵化率极显著（Ｐ＜０．０１）地低于其它三个阶段的胚胎，其它三个阶段之间无显著差异（（Ｐ＞０．０５）。试验Ⅱ，将７日龄的囊胚，在显微镜下鉴定质量并分为１～５级，仅１，２级胚胎用于冷冻。试验结果表明：每管装２枚胚胎时，有１枚胚胎以上孵化的细管数，１级的有９３．８％（４５／４８），２级的有７７．４％（２４／３１），它们之间差异显著（Ｐ＜０．０５）。每管装３枚胚胎时，有２枚胚胎以上孵化的细管数，１级的有８７．５％（４２／４８），２级的有６８．０％（１７／２５），二者间差异显著（Ｐ＜０．０５）。本研究结果表明：不同阶段和质量的牛体外培养胚胎冷冻后对存活率有显著的影响。     

兔和牛卵母细胞核移植的研究

通过显微操作，将１６～３２细胞期胚胎的单个卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙内，用适当电压（兔１６０Ｖ、牛１２０Ｖ）和脉冲时间的两次电脉冲诱导卵裂球与卵母细胞的融合；融合后的胚胎体外培养观察发育或移植到同步受体。体内成熟的免卵母细胞操作后存活率为９３．７％（１５０１／１６０２），融合率为９４．３％（１２８１／１３５９）。融合卵再用１６０Ｖ４０μｓ电脉冲电激一次，可显著提高其卵裂率（７５．９％比１８．２％，Ｐ＜０．０１）。用体外成熟的兔卵母细胞进行核移植，存活率和融合率分别为７８．５％（９５／１２１）和９５．７％（８８／９２），融合胚卵裂率为５１．４％（３７／７２）。初步表明体外成熟的兔卵母细胞可作为核移植的受体卵。此外，还尝试了用体外受精的牛胚胎和体外成熟的牛卵母细胞进行核移植，操作后存活率和融合率分别为９８．０％（５０／５１）和７５．５％（３７／４９），核移植胚的卵裂率为５４．１％（２０／３７）。     

不同血清种类及其浓度对牛卵母细胞体外受精的影响

以３个试验探索能否用自行采集、价廉的成年牛血清（发情母牛血清ＯＣＳ和阉公牛血清ＳＳ）来代替犊牛血清（ＦＣＳ）。试验１，比较ＯＣＳ和ＦＣＳ及其２种浓度（１０％和２０％）对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，ＯＣＳ影响牛卵母细胞体外成熟的效果与ＦＣＳ的效果无显著差异（均达到９０％以上）。同时，２种浓度间亦无显著差异。试验２，比较不同浓度的ＯＣＳ（０，１％，５％，１０％，２０％，５０％）对牛早期胚胎体外发育的影响。结果表明，早期胚胎的总囊胚率及７天龄囊胚率随着ＯＣＳ浓度从０到２０％的增加而提高。但当浓度增至５０％时囊胚率则有下降之趋势，然而与２０％浓度比较，差异不显著。试验３，探讨能否利用采集简单且价廉的ＳＳ来代替ＯＣＳ，进行了ＳＳ与ＯＣＳ在卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外培养两阶段的效果比较。结果表明，ＳＳ亦完全可以替代ＯＣＳ。     

牛去透明带卵体细胞核移植技术的应用研究

本研究通过进一步完善和简化“去透明带双半卵体细胞克隆牛技术”，探讨了生产应用的可能性。结果表明：(1)在卵母细胞体外成熟发育的特定阶段(17～20h间)采用分期分批显微盲吸法去核，去核率可高达95％以上；(2)一次同时将2枚去核后的半卵和1枚供核体细胞粘合在一起，可大大提高电击融合效率；(3)克隆重构胚在DMAP中激活时间从4h延长至16h仍有较高的卵裂率和囊胚率；(4)利用OPS法玻璃化冷冻保存牛体细胞克隆胚胎，解冻后胚胎可用率极显著地高于常规慢速冷冻法；(5)利用改进后的体细胞核移植程序工厂化批量生产牛体细胞克隆胚胎，获得88．2％(2575／2920)卵裂率、41．6％(1215／2920)囊胚率、75．4％(916／1215)冻胚率，冷冻胚胎移植后30d妊娠率为28．1％(48／171)。结果说明，本研究的牛去透明带双半卵体细胞核移植技术已可达到克隆胚胎批量生产应用的水平。     

受精温度对牛卵母细胞体外受精及随后胚胎发育的影响

将经过２０～２４ｈ体外成熟培养后的牛卵母细胞在含５％ＣＯ２，９５％空气，最大相对饱和湿度和温度分别为３７℃（Ｇ１），３８℃（Ｇ２）和３９℃（Ｇ３）的培养条件下进行体外受精，以观察受精温度对牛体外受精及其随后胚胎发育的影响。结果显示，不同受精温度对牛卵母细胞体外精子入卵率（９３．６％～１００％）及受精卵裂率（７８．５％～８０．３％）无明显影响；而早期胚胎卵裂发育速度、体外囊胚发育速度及体外囊胚发育率和孵化率均随着受精温度的升高呈上升趋势。在ＩＶＦ４２～４６ｈ，Ｇ３发育到５细胞以上卵裂周期阶段的早期胚胎比率（４０．３％）非常显著地高于Ｇ２（２４．３％）和Ｇ１（１８．８％，Ｐ＜０．００１）；而相应处于２细胞阶段的胚胎比率（Ｇ３为１４．６％）则十分显著地低于Ｇ２（２５．２％）和Ｇ１（３０．１％，Ｐ＜０．０１）。Ｇ３的囊胚体外孵化率（７５．８％）也非常明显地高于Ｇ２（５１．９％）和Ｇ１（４７．９％，Ｐ＜０．００）。结果表明，受精温度（３７～３９℃）主要影响早期胚胎的质量，从而影响到其随后的囊胚发育率、发育速度及其孵化率，而对卵母细胞的受精、卵裂率无明显影响。     

玻璃化冷冻体外成熟牛卵母细胞的尝试

通过两个试验对体外培养成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻。试验１用１０％丙二醇（ＰＧ）加上不同浓度（０％～２０％）的乙二醇（ＥＧ）作为细胞内玻璃化溶液（ＶＳ１），２５％ＰＧ＋２５％ＥＧ作为细胞外玻璃化溶液（ＶＳ２）对卵母细胞进行冷冻。结果卵母细胞的体外受精分裂率（０．９％～２３．４％）均显著低于对照组（７５．０％）。在处理组中，以１０％ＰＧ＋５％ＥＧ和１０％ＰＧ＋１０％ＥＧ作为ＶＳ１的效果较好，分裂率分别为２３．４％和２２．２％，均显著高于其他处理组。试验２以１０％ＰＧ＋５％ＥＧ作为ＶＳ１，２５％ＰＧ＋２５％ＥＧ作为ＶＳ２进行冷冻。解冻后在０．５ｍｏｌ／Ｌ或０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中１～２步或在含防冻剂的溶液中经２～３步稀释防冻剂。卵母细胞经体外受精后，分裂率在１８．２％～３０．６％之间。在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中一步脱防冻剂的卵母细胞经体外受精、体外培养后，２５个早期胚胎中有３个发育成囊胚，其它组均未发现囊胚。这些结果表明玻璃化过程对卵母细胞造成了损伤。引起损伤的原因可能是玻璃化溶液的化学毒性作用及脱防冻剂过程中卵母细胞受到的渗透压损伤。     

幼畜繁殖（JIVET）技术在性成熟前奶牛上的应用

本实验旨在建立高效的性成熟前奶牛幼畜繁殖(JIVET)技术体系.建立了有效的对性成熟前犊牛进行促性腺激素处理的方法,平均每只犊牛可获得卵母细胞31枚:卵母细胞在体外成熟和体外受精过程中,受精率达到63.2%,与成年牛(59.7%)差异不显著.胚胎体外培养后犊牛胚胎囊胚率达到31.6%,仍显著低于成年牛(48.0%).对3头同期发情受体母牛进行胚胎移植,其中2头受孕,1头完成全程妊娠,受孕率达到66.7%.     

牛磺酸和颗粒细胞对牛胚胎体外发育的影响

用改良ＣＲ２培养液探讨了牛磺酸（５０μｍｏｌ／Ｌ,１００μｍｏｌ／Ｌ）和颗粒细胞对牛卵母细胞体外受精后的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数的影响。试验一中,在培养液中添加牛磺酸（５０μｍｏｌ／Ｌ,１００μｍｏｌ／Ｌ）对牛受精卵的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响（Ｐ＞０．０５）。试验二中,添加颗粒细胞对牛受精卵的分裂率无显著影响（Ｐ＞０．０５）,但促进了牛早期胚胎的囊胚率和囊胚细胞数（Ｐ＜０．０１）;牛磺酸对牛受精卵的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数均无明显影响。结果表明：在培养液中添加颗粒细胞可以促进牛早期胚胎体外发育的能力;在本试验条件下牛磺酸不能提高牛早期胚胎的体外发育能力。     

影响玉米幼胚愈伤组织再生率的因素分析

为探讨影响玉米幼胚愈伤组织的再生率的因素,本试验以3个优良玉米自交系为材料,对影响幼胚的胚性愈伤组织诱导率、克隆指数和分化率的因素进行了研究。结果表明,3个玉米自交系幼胚的愈伤诱导率差异极显著。 生长环境对975-12影响显著,对18-599和416051影响不显著。18-599和416051的胚大小为2mm时II型胚性愈伤组织的诱导率最高,而975-12在胚大小为2.5mm时II型胚性愈伤诱导率最高。3个自交系的克隆指数和分化率一般在第3或第4代时达到最大值。综合分析表明,18-599和416051这2个自交系具有愈伤组织诱导率高、克隆能力强、易分化的优点,是玉米转基因研究中具有潜在利用价值的优良自交系。     

解冻后的精子贮存不同温度和不同时间对牛体外受精的影响

探讨了冷冻精液解冻后,精子不同贮存温度和时间对牛体外受特的影响。试验1表明,精子放置在25℃的环境下,其分裂率和囊胚率较放置在4℃和39℃的高;试验2,精子在25℃的环境下放置48h 后,其分裂率较放置8h 和24h 的显著降低,但其囊胚率无显著差异。因此,精子在25℃的环境温度下放置48h,仍可用来作体外受精。     

玉米未成熟胚胚性愈伤组织诱导率与内源激素含量的关系

以胚性愈伤组织诱导率高低不同的9个玉米自交系未成熟胚为外植体,用改良N6培养基诱导培养愈伤组织。酶联免疫法测定不同培养时间后未成熟胚,以及由此诱导的胚性和非胚性愈伤组织,内源脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3、GA4)和细胞分裂素(DHZRI、PA、ZR)含量。结果发现,胚性愈伤组织诱导率与未成熟胚ABA和IAA含量正相关,与胚性和非胚性愈伤组织ABA含量正相关,与胚性愈伤组织GA3含量负相关。在胚性愈伤组织开始发生之际,外植体的ABA和IAA含量出现峰值,GA3含量出现低谷。因此认为,未成熟胚高水平的ABAI、AA含量和低水平的GA3含量,有利于胚性愈伤组织的诱导。但是胚性愈伤组织的ABA含量却低于非胚性愈伤组织,且胚性愈伤组织诱导率与胚性愈伤组织IAA含量负相关。由此看来,胚性愈伤组织的诱导和保持,可能还与各种激素的协同作用有关。     

我国奶牛胚胎移植和胚胎工程现状及“十一五”的重点研究领域

根据作者20多年从事奶牛胚胎移植研究与推广工作的实践，全面总结了我国奶牛胚胎移植和胚胎工程发展的历程及取得的主要成果，指出了目前存在的问题，提出了“十一五”重点研究领域。     

绵羊同期发情及冻胚移植效果观察

羊胚胎移植技术是优秀种羊扩群和引种的有效手段。在绵羊繁殖季节采用两种同期发情处理方案对150只受体羊处理,同期发情率为88.67%(133/150)。采用手术法,对其中126只受体羊进行了纯种肉羊冻胚移植,受体羊可用率为94.74%(126/133)。用B超诊断妊娠率为44.00%(55/125),产羔59只,单羔存活率93.62%(44/47),双羔存活率66.67%(8/12)。试验结果表明,用冷冻胚胎移植繁殖种羊可行。     

辐照花粉对小麦与中间偃麦草杂交及其胚胎发育的影响

用γ射线辐照中间偃麦草散粉期的穗,用其花粉授予普通小麦“J-11”和“中国春”,研究不同剂量辐照花粉对普通小麦与中间偃麦草杂交结实率、杂交种子含胚率、杂种幼胚培养和杂种幼苗获得率的影响。结果表明,5~9Gy低剂量γ射线略提高了中国春×中间偃麦草的结实率,表现出低剂量辐射的刺激效应,但对J-11×中间偃麦草却未表现出刺激效应。所有剂量的辐射对杂种幼胚均有伤害作用,杂交种子含胚率、杂种幼胚成苗率随剂量增加而下降。30Gy处理时有12.9%~14.5%的杂种幼胚发育成了植株,但该剂量应用到小麦中难以获得后代。在50~100Gy高剂量γ射线处理杂交种子胚发育不良,通过幼胚培养未能得到植株。将花粉辐照技术与幼胚拯救技术、花药培养技术有效结合,可以快速获得突变体,提高诱变育种效率。     

快速冷冻牛体外受精胚胎

本文研究不同类型的防冻剂及其浓度对快速冷冻牛胚胎的效果。试验Ⅰ：７日龄囊胚先分别放入含１０％（Ｖ／Ｖ）甘油或１０％（Ｖ／Ｖ）乙二醇改良的磷酸盐缓冲液（ＰＢＬ）中，室温下平衡１０ｍｉｎ。然后，分别移入１．５ｍｏｌ／Ｌ，２．０ｍｏｌ／Ｌ甘油或２．０ｍｏｌ／Ｌ，３．０ｍｏｌ／Ｌ乙二醇＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖ＰＢＬ液中，１０ｍｉｎ后将胚胎放进冰箱的结冰层（约─２３℃），３５ｍｉｎ后直接投入液氮。冻后孵化率最高的处理组为１．５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖（８２．４％），其极显著（Ｐ＜０．０１）地高于２．０ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖（１５．４％），２．０ｍｏｌ／Ｌ乙二醇＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖（６３．９％），３．０ｍｏｌ／Ｌ乙二醇＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖（３８．７％）。试验Ⅱ：７日龄胚胎先在１０％（Ｖ／Ｖ）甘油中平衡１０ｍｉｎ，而后，分别移入１．５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０，０．２５，０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，停留１０ｍｉｎ后快速冷冻。解冻后，胚胎分别用０．５，０．２５，０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖除甘油。结果表明：解冻液中的蔗糖浓度对胚胎的存活力无显著影响。当冷冻处理为１．５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖时，胚     

牛囊胚染色体制备的研究

本研究采用传统的细胞遗传学方法，从牛体外受精后产生的6～8d囊胚中制备染色体，以探讨适合牛胚胎染色体制备的方法。将牛的6～8d回收的囊胚分别在含0．1μg／mL、lμg／mL和10μg／mL秋水仙酰胺(Colcemid)的TCMl99液中继续培养4h或6h，以抑制细胞分裂停留在中期。经处理后的囊胚移入10g／L柠檬酸钠的低渗液中，室温下处理15～20min.将低渗后的单个胚胎转移至载玻片上，经固定液I和固定液Ⅱ固定后，用体积分数为25％的Giemsa溶液染色10min，蒸馏水冲洗脱色，于室温自然干燥。显微镜下计算胚胎细胞数和有丝分裂指数以及观察染色体的伸展情况。结果显示，1μg／mL秋水仙酰胺处理6h后染色体制备的结果较为理想。     

刺槐同源四倍体种子胚变异及生活力分析

为了阐明刺槐同源四倍体种子胚变异状况及充分利用刺槐同源四倍体有性过程创造的变异资源对四倍体刺槐进行遗传改良,研究了刺槐同源四倍体种子胚类型及其生活力特征,主要结论如下：刺槐同源四倍体种子胚按照子叶数量、颜色及饱满程度,可以划分出5个类型： 黄二(YVT)、黄三(YMT)、黄四(YRF) 、绿二(GNT)及白二(WNT),所有类型种子胚混合平均单胚重量接近二倍体的1/2。流式细胞仪检测证明,YVT、YMT、 YRF类型样本种子胚染色体数目仍然是四倍体。刺槐同源四倍体种子胚可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性明显低于二倍体相应指标,YVT、YMT、 YRF类型种子胚的上述2种指标明显高于GNT、WNT类型。以刺槐同源四倍体种子胚愈伤组织诱导率作为种子胚生活力强弱的评定指标表明：上述2种指标越高的种子胚,其生活力就越高,上述2种指标均小于二倍体相应指标的30% 是刺槐同源四倍体种子胚生活力丧失的临界指标;YVT、YMT、 YRF类型种子胚上述2种指标均高于二倍体相应指标的30%,组织培养时均有一定的愈伤组织诱导率,具一定的生活力,其中YVT类种子胚的愈伤组织诱导率最高（平均57.8%）、生活力最强,已培育出此3类胚的实生苗; GNT、WNT类型种子胚上述2种指标均低于二倍体相应指标的30%,组织培养时愈伤组织诱导率为0,胚细胞均失去了生命力。较好的种子胚愈伤组织诱导培养基综合条件为： MS基本培养基附加2,4-D 2.0 mg/L和6-BA 0.5 mg/L。