Rho相关蛋白激酶抑制剂Y-27632对猪诱导多能干细胞冻存和传代效率的影响

猪作为重要的疾病模型动物,目前猪诱导多能干细胞(iPS 细胞)已有建系,但是细胞的冻存和传代的效率较低,影响后续的实验研究。Rho 相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂 Y-27632 可提高人胚胎干细胞的解冻存活率,促进其克隆形成。本实验以猪(Sus scrofa)iPS 细胞为研究对象,通过在猪 iPS 细胞冻存和解冻过程中添加Y-27632,发现其可以减少猪 iPS 细胞在冻存和解冻复苏过程中的凋亡。在细胞的传代过程中,使用 Y-27632 可以促进猪 iPS 细胞的贴壁和克隆形成。虽然高浓度 Y-27632 会对猪 iPS 克隆的形态产生一定的影响,但并未影响细胞的碱性磷酸酶(AP)活性和多能性基因 Oct4、Sox2 和 Nanog 的表达水平。最后将转座子报告质粒 PB[Act-RFP]DS 导入猪 iPS 细胞中,经流式筛选后得到的带有红色荧光的细胞,并将其注射于猪孤雌胚胎中进行发育能力检测,发现 Y-27632 的处理能减少细胞在流式筛选和胚胎注射中的凋亡,促进其在胚胎内的嵌合发育。研究结果说明,ROCK 抑制剂 Y-27632 可以提高猪 iPS 细胞冻存和传代的效率,促进其在胚胎中的嵌合。该研究有助于猪 iPS 细胞及其他多能干细胞的保存,传代和筛选等相关研究。     

cNanog和cPouV表达下调对鸡胚胎干细胞(cESCs)多能性的影响

利用稳定干扰载体pSuper-cNanog和pSuper-cPouV转染鸡(Gallus gallus)胚胎干细胞(chicken embryonic stem cells,cESCs),观察多能性相关基因cNanog和cPouV下调后cESCs的增殖特性和多能性标记的改变。Real-time PCR检测分析结果显示,cNanog和cPouV两基因的表达量从48 h开始出现显著下降趋势,并随着转染筛选时间的延长而呈现持续显著下降趋势,96 h可达65%以上(P0.05)。下调cNanog和cPouV基因的表达后,cESCs呈现分化形态,细胞增殖速度减慢,隆起逐渐不明显,边缘不整齐。待筛选后培养至96 h时,干扰cNanog基因的细胞多能性标记碱性磷酸酶(alkline phosphatase,AKP)和阶段特异性胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen-1,SSEA-1)均不表达,而干扰cPouV基因的细胞中则仍有部分表达。将下调cPouV基因的cESCs再次用pSuper-cNanog转染,培养48 h多能性标记AKP和SSEA-1均不表达。结果说明,cNanog和cPouV基因在维持鸡胚胎干细胞多能性和自我更新中起重要作用,且cNanog基因占主导地位。本研究为研究家禽胚胎发育的分子机制以及家禽胚胎干细胞体外培养时自我更新和多能性维持的分子机制提供理论依据。     

供体细胞不同性别和处理方式对异种克隆牦牛胚胎发育的影响

以黄牛(Bos taurus)卵母细胞为受体,牦牛(Bos grummiens)耳成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植,研究供体细胞性别、细胞周期同期化处理方式及冷冻对异种克隆牦牛胚胎发育的影响.结果显示,雄性供体细胞的异种克隆牦牛囊胚发育率显著高于雌性供体细胞(56.6% vs 39.5%,P<0.05),但卵裂率和囊胚细胞数差异不显著;血清饥饿和接触抑制提供的供体细胞对异种克隆牦牛胚胎发育率和胚胎质量的影响没有明显差别;供体细胞冷冻-解冻组的克隆胚胎卵裂率明显低于新鲜消化组(54.5% vs 78.2%,P<0.05),但两组之间的囊胚率和囊胚细胞数没有显著差异.说明供体细胞的性别对异种克隆牦牛囊胚发育有影响,而同期化处理和细胞冷冻对异种克隆牦牛囊胚发育影响很小.     

HSP27基因在牦牛卵母细胞和体外早期胚胎中的表达

为了探讨牦牛HSP27(heat shock proteins27, HSP27)基因在牦牛卵母细胞和早期孤雌激活胚胎中的表达情况及定位,本试验通过实时荧光定量PCR检测牦牛HSP27基因在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中的相对表达量,用免疫荧光染色法检测HSP27蛋白在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中的表达与定位情况。结果显示,HSP27基因在牦牛未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎中均可表达,其中在未成熟卵母细胞中的表达量显著高于成熟卵母细胞;在孤雌激活胚胎中,2~4细胞期表达量最高,囊胚期胚胎表达量最低,随着胚胎的发育,HSP27的表达量呈现逐渐降低的趋势;在2~4细胞期和囊胚期胚胎中的表达与其他组表达存在显著差异性,在5~8细胞期和桑椹胚中的表达无显著差异。免疫荧光染色结果表明,HSP27蛋白在牦牛卵丘细胞和卵母细胞中均有表达,在牦牛孤雌激活2~4细胞期、5~8细胞期和桑椹期胚胎中主要表达于细胞核内和细胞质中,在囊胚期主要表达于细胞核中;而HSP27蛋白的表达水平与基因表达水平基本一致。本研究为后续研究HSP27基因在牦牛生殖生理过程中的作用机制提供了参考。     

Hsp70在小鼠体外早期胚胎发育中的表达

为探究热休克蛋白Hsp70在小鼠体外早期胚胎发育中的表达情况以及Hsp70在胚胎发育中的作用机理,本试验采集8~12周龄SPF小白鼠的卵巢,在体式显微镜下采集卵母细胞并培养成熟,用0.1%透明质酸酶消化卵丘卵母细胞复合体后,放入SrCl₂+CB液中进行5 h(37℃)的孤雌激活,然后移入G1培养液进行培养。取培养至2细胞期、4~8细胞期、9~16细胞期、桑椹期和囊胚期的小鼠胚胎提取总RNA,通过实时荧光定量PCR检测Hsp70在各个时期的表达情况,免疫荧光染色检测其在各个时期小鼠胚胎的表达定位。实时荧光定量PCR结果表明,Hsp70在小鼠体外早期胚胎的2细胞期、4~8细胞期、9~16细胞期、桑椹期、囊胚期都有表达,但在2细胞期胚胎和4~8细胞期胚胎的相对表达水平较高,在9~16细胞期胚胎、桑椹期胚胎和囊胚期胚胎的相对表达水平较低。免疫荧光染色结果显示,Hsp70定位于各个时期胚胎的细胞核和细胞质中,但9~16细胞期以后Hsp70主要定位于细胞核中。综上所述,Hsp70对小鼠体外早期胚胎的发育具有潜在的调控作用,这为进一步明确热休克蛋白Hsp70在胚胎抗热应激中的作用及机理研究提供了理论依据。     

体细胞核移植技术生产转入溶菌酶基因(hLYZ)牛胚胎的研究

本研究主要探讨经基因修饰和筛选后转基因供体细胞的挑选及处理对牛转入溶菌酶基因克隆胚胎早期发育的影响.用含人溶菌酶基因(human lysozyme,hLYZ)乳腺特异表达载体pEBH重组质粒转染高产荷斯坦牛成纤维细胞,经G418筛选后的转基因阳性细胞作为核供体细胞成功构建了转hLYZ基因克隆胚胎.结果发现,基因转染及筛选过程对转基因重构胚的发育有不利的影响,囊胚发育率显著降低;以注核针内径为参照,挑选直径为15～20μm的转基因阳性细胞作为供体细胞,重构胚的融合率和囊胚率较其它组差异显著(分别为80.4%和33.8%,P<0.05);生长旺盛期的细胞构建的转基因克隆胚的卵裂率及囊胚发育率显著高于经血清饥饿和生长接触抑制处理组(P＜0.05);所有的转基因克隆胚在体外发育的各个发育时期都能观察到绿色荧光蛋白的表达,但表达的强弱在不同个体及相同个体不同发育时期之间存在差异.随机挑选10枚囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为阳性转基因胚胎.研究结果表明,利用体细胞核移植方法可以获得转舰hLYZ基因的克隆胚胎,重构胚可成功的发育到囊胚阶段;挑选生长旺盛期的直径为15～20 μm的转基因阳性细胞作为供体细胞可显著提高转基因克隆胚的融合率和囊胚率.     

红色荧光标记载体pBacA4DsRed1的构建及其表达

以首次克隆的家蚕Bombyx mori 肌动蛋白（actin4, A4）启动子、红色荧光蛋白基因DsRed1和多聚腺苷酸识别序列SV40为元件，经多次克隆将其插入到 piggyBac转座载体中，构建成pBacA4DsRed1转基因表达载体。将该载体显微注射到胚盘形成前期的蚕卵中，在荧光显微镜下观察其发光情况，结果发现：在胚胎早期发育的第三天，检测到蚕卵内发出较强的红色荧光。由于蚕卵没有红色自发荧光，用DsRed1标记背景干扰小，对注射蚕种无特别选择，在荧光显微镜下观察到明显的红色荧光，表明pBacA4DsRed1载体构建正确且能在蚕卵中表达。红色荧光蛋白(RFP)基因丰富了报告基因的种类，并且与绿色荧光蛋白(GFP)基因一样，可以作为理想的报告基因应用于家蚕的功能基因研究。     

不同类型的转基因细胞为核供体生产猪的转绿色荧光蛋白基因克隆胚胎

2005年我国获得了体细胞克隆猪的成功,但是在体细胞转基因克隆猪方面还处于起步阶段。猪的转基因克隆在农业和医学方面有着巨大的应用前景,在农业上可以提高猪肉品质和培育抗病猪种等;医学上可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料。体细胞核移植结合基因组修饰技术,是目前生产转基因家畜的一种有效方式。供体细胞的类型是影响转基因克隆效率的一个关键因素,因为供体细胞的类型决定着体细胞转基因效率和重组胚的发育潜力。目前所知,较成功用于生产转基因克隆猪的供体细胞仅限于胎儿成纤维细胞,因为它易培养、增殖期限长、重构胚的发育能力高。此外骨髓间充质细胞,一种成体干细胞,作为转基因克隆猪的供体细胞有着巨大的潜力,国内外仅有个别报道。前脂肪细胞,一种易于获得的体细胞,有报道称利用成年猪前脂肪细胞为核供体构建的克隆胚发育能力和胎儿成纤维细胞相当,并且获得了克隆猪的后代。而利用猪前脂肪细胞生产转基因克隆胚胎,将为后续组织工程研究奠定基础。因此本研究选择猪胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞为转基因克隆的供体细胞,目的是比较不同类型转基因供体细胞对生产克隆胚胎效率的影响。本研究首先建立了近交系五指山小型猪(WZSP)胎儿成纤维细胞系(FF)、新生猪骨髓间充质细胞(MSCs)系和成年猪前脂肪细胞系(PreA)。采用组织块法建立胎儿(27日龄)成纤维细胞系;髓间充质细胞从新生猪后腿骨冲取骨髓,加入到Percoll分离液中离心,吸取中间界层面细胞,贴壁法培养骨髓间充质原代细胞,培养基为低糖DMEM。对间充质细胞向脂肪细胞进行诱导分化,油红O染色鉴定;前脂肪细胞从猪的皮下脂肪取样,用0.1%胶原酶消化法建立前脂肪细胞原代细胞,并对前脂肪细胞进行诱导分化为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定。为了获得转基因细胞系,利用脂质体lipofectamineTM2000(Invitrogene)介导的方法将质粒pEGFP-N1转染了胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞,经过800μg/mL G418筛选后均获得了阳性细胞株。分别以3种类型转基因和未转基因细胞为核供体进行猪的体细胞核移植,比较克隆胚胎的发育能力。结果如下:(1)比较了3种类型非转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(8.2%)、骨髓间充质细胞(7.1%)和前脂肪细胞(8.8%)囊胚发育率差异不显著(P>0.05);(2)比较了3种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(9.6%)和骨髓间充质细胞(9.9%)最高,前脂肪细胞(3.7%)最低,前两者与后者差异显著(P<0.05);(3)分别比较了每一类型供体细胞转基因和非转基因对重组胚的囊胚发育率的影响,转基因对胎儿成纤维细胞(9.6%vs 8.2%)和骨髓间充质细胞(9.9%vs 7.1%)的重构胚囊胚发育率影响不大(P>0.05);前脂肪细胞转基因重组胚的囊胚发育率显著降低(3.7%vs 8.8%,P<0.05)。以上结果表明,某些供体细胞类型转基因与否对猪克隆胚胎的早期体外发育影响不明显,有些细胞类型转基因对克隆胚的发育能力影响较大。通过体细胞核移植技术,猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞可以有效地生产猪转基因囊胚,但前脂肪细胞转基因克隆胚胎的囊胚发育率能否进一步提高,还需要进一步的实验观察。     

不同转座子介导的基因捕获效率比较

为了比较SB(Sleeping Beauty)、PB(PiggyBac)和Tol2 3种转座子介导的基因捕获效率,本研究构建了含有3种转座子的启动子捕获载体pT3-PST-Pro-Trap。将此载体分别和SB、PB和Tol2 3种转座酶mRNA按照质量比1.0∶1.5的比例注射斑马鱼(Danio rerio)一细胞胚胎,通过检测绿色荧光蛋白报告基因(GFP)的表达水平比较不同转座子的捕获效率。结果显示,3种转座子介导的启动子捕获载体能够高效率捕获内源基因启动子,进而驱动GFP的表达;注射后培养36 h时的SB、PB和Tol2捕获效率分别为24.32%、30.70%和18.87%,PB捕获效率显著高于SB和Tol2(P0.05);3种转座子在60 h时的捕获效率均高于36 h的,其中SB和Tol2组差异达显著水平(P0.05),而PB组差异不显著(P0.05)。本研究结果表明,SB、PB和Tol2转座子介导的基因捕获技术可以用于脊椎动物高通量功能基因筛选,为功能基因研究提供有效新方法。