苜蓿轮枝菌的生物学特性分析及ATMT遗传转化体系的建立

 为了揭示苜蓿轮枝菌Verticillium alfalfae的生物学特性及其致病机理,在室内条件下测定不同温度、pH值、碳源和氮源对菌株Ms198的生长速率和产孢量的影响,同时利用农杆菌转化法(Agrobactirium tumfacience-mediated transformant,ATMT)将带有潮霉素(Hygromycin,Hyg)抗性标记和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因的双元载体转入苜蓿轮枝菌的分生孢子,获得147株阳性转化子,以野生型菌株为对照,对挑取的15株阳性转化子的菌落形态、生长速率、产孢量、孢子萌发率、粗毒素分泌量和致病力进行研究。结果表明,苜蓿轮枝菌具有较宽的温度和酸碱度适应范围,最适生长和产孢温度分别为25 ℃和20 ℃,最适生长pH值为6 ~ 9,最适产孢pH值为9。可以利用多种碳、氮源,最适生长的碳、氮源分别为可溶性淀粉和牛肉膏,最适产孢的碳、氮源分别为D-牛乳糖和胰蛋白胨。与野生型菌株相比,15株供试转化子中有66.67%的转化子在菌落形态方面与野生型菌株无明显差别,而其生长速率、产孢量和孢子萌发率均有不同程度的降低。在产毒能力和致病力方面,1株转化子的粗毒素分泌量显著高于野生型菌株,9株显著低于野生型菌株,其余5株与野生型菌株无显著差异;4株转化子的致病力显著低于野生型菌株,其余11株转化子的致病力与野生型菌株均无显著差异。研究结果表明,转化子的生物学特性以及产毒能力和致病力,随外源基因插入位点的随机性而有所变化。     

玉米弯孢叶斑病菌多聚半乳糖醛酸酶Clpg1基因功能验证

为明确玉米弯孢叶斑病菌的多聚半乳糖醛酸酶基因Clpg1在其致病过程中的作用,采用Double-joint PCR技术构建融合片段,利用PEG介导的原生质体转化技术获得18株抗潮霉素突变体,经检测得到1株Clpg1基因敲除突变体ΔClpg1。通过与野生型菌株比较,发现ΔClpg1产孢量和孢子萌发率下降、多聚半乳糖醛酸酶活性降低,致病力减弱。这些结果表明Clpg1基因影响多聚半乳糖醛酸酶活性,调控了玉米弯孢叶斑病菌的致病性。     

向日葵黄萎病菌突变体库的建立及其阳性转化子的鉴定

为揭示向日葵大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.的致病机理,利用农杆菌介导法将带有潮霉素抗性标记和绿色荧光蛋白报告基因的双元载体转入大丽轮枝菌的分生孢子中并获得阳性转化子,以野生型菌株为对照,对随机挑取的阳性转化子的菌落形态、菌丝生长速率、产孢量、粗毒素分泌量和致病力进行了研究。结果表明,共获得800株阳性转化子,随机选取的40株阳性转化子中有2株的菌落只产生白色气生菌丝,不能形成黑色微菌核。与对照相比,40株转化子的生长速率均有不同程度降低,其中转化子A1生长速度降低最显著,菌落直径仅为3.28 cm,比对照下降了38.92%。40株转化子中有3株的产孢量高于对照,其中转化子A9的产孢量最高,为3.50×10~7个/mL,比对照提高1.10倍;转化子A1的产孢量最低,仅为1.35×10~7个/mL,比对照下降了19.16%。40株转化子中有4株的粗毒素分泌量较对照显著升高,占测定菌株的10%,有24株较对照显著降低,占60%,其余12株与对照无显著差异。40株转化子中有3株的致病力较对照显著增强,占测定菌株的7.5%;有7株的致病力较对照显著降低,占17.5%;其余30株与对照无显著差异。     

辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立

由辣椒胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides导致的辣椒炭疽病是辣椒生产上最为严重的真菌病害之一。本文以辣椒胶孢炭疽菌CSLL11为供试菌株,采用PEG-CaCl_2介导的原生质体转化法,将含有潮霉素B抗性基因和eGFP表达基因的DNA片段成功转入辣椒胶孢炭疽菌的原生质体中,获得了稳定表达绿色荧光的转化子,从而成功建立了辣椒胶孢炭疽菌的遗传转化体系。试验结果表明,可有效筛选阳性转化子的潮霉素B浓度为500 mg/L;PCR及Southern blot结果显示,eGFP表达基因已单拷贝整合至辣椒胶孢炭疽菌转化子的基因组中;使用荧光显微镜观察第一代及继代培养后的转化子,菌丝与分生孢子均表现出强烈的绿色荧光信号,说明GFP能在转化子中稳定遗传;将转化子与野生型菌株相比,菌落形态、生长速率及致病力水平无明显差异。本研究建立了辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系并获得了稳定表达绿色荧光蛋白的转化子,对辣椒炭疽菌与寄主互作的研究及病害防治具有重要意义。     

胶孢炭疽菌致病相关基因Plv2功能分析

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的橡胶树炭疽病是橡胶树三大叶部病害之一,严重威胁着橡胶树的生长。本研究从构建的胶孢炭疽菌RC178 T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱的突变菌株T1103,其T-DNA为单拷贝。采用TAIL-PCR克隆了该突变体T-DNA插入位点的侧翼序列,通过比对胶孢炭疽菌全基因组序列,发现该TDNA插入位点所在的序列包含一个5 400 bp的基因,将其命名为Plv2。Plv2基因包含3个外显子,编码一个假定的甾醇C-24甲基转移酶。敲除野生型菌株RC178中的Plv2,发现敲除突变体与T1103的致病力表现基本一致,由此推测Plv2基因为致病相关基因。     

棉花黄萎病菌低致病力突变体的表型分析及致病相关基因克隆

 本研究通过对菌核型强致病力菌株Vd080产生的800个T-DNA插入突变体进行致病力测定,筛选得到31株致病力极显著降低的突变体,并对其进行了生物学性状分析。分子验证结果表明,这些低致病力突变体均为阳性,且有25株的T-DNA为单拷贝插入。与野生型菌株Vd080相比,这25株低致病力突变体菌落形态变异丰富,除了8株与野生型菌株形态一致的菌核型突变体外,还有3株黄色菌丝型,2株白色菌丝型和12株中间型突变体。此外,多数突变体的生长速率、产孢量和粗毒素产量都发生了显著变化,且各生理指标之间并无明显相关性。借助TAIL-PCR技术和VdLs.17的基因组数据库,进一步获得了这25株单拷贝插入低致病力突变体T-DNA的侧翼序列,并从Vd080中成功克隆得到了影响黄萎病菌致病力的相关基因。     

玉米新月弯孢菌(Curvularia lunata)的RAPD分析

 对分离自玉米弯孢菌叶斑病标样中的77株新月弯孢菌和1株来自水稻的新月弯孢菌进行RAPD分析表明,菌株间具有丰富的遗传多样性,在相似系数约0.60处,所有菌株被聚为3个组,但88.0%的菌株聚入第Ⅰ组内,其余菌株被聚入另外2个组内。第Ⅰ组内共有69个菌株,包含来自不同区域的致病性较强的菌株,是玉米弯孢菌叶斑病的优势类群,其余2个类群主要是一些致病能力较弱或不致病的菌株。结果表明,新月弯孢菌种内菌株的遗传多样性与致病性相关,但与菌株地理来源无明显的直接关系。     

MfMel1基因参与调控桃褐腐病菌对桃果实的致病力

为明确MfMel1基因在桃褐腐病菌Monilinia fructicola中的功能,利用生物信息学软件对该基因的结构、所编码蛋白的保守结构域以及进化关系进行分析;通过遗传转化方法对该基因进行敲除,并进行表型分析。结果显示,敲除转化子△MfMel1菌株的菌丝生长速率、孢子萌发率与野生型菌株Bmpc7均无显著差异,但产孢量显著降低。△MfMel1菌株在0.01%SDS、600μg/mL刚果红、150 g/L甘油、200 g/L蔗糖、6 mmol/L H2O2、4%NaCl和1.2 mmol/L山梨醇培养基上的生长速率、菌丝形态均无显著变化,但对200 g/L葡萄糖的渗透胁迫敏感性增强。敲除转化子△MfMel1菌株的α-半乳糖苷酶活性明显降低,对桃果实的致病力显著下降。表明MfMel1基因在桃褐腐病菌中可能通过参与调控α-半乳糖苷酶酶活,从而参与病原菌的致病。     

臂形草内生真菌HND5的GFP标记及其抑菌作用

臂形草Brachiaria brizantha内生真菌HND5及其产生的挥发性气体对多种植物病原真菌均有拮抗作用。本研究通过原生质体转化将绿色荧光蛋白（GFP）表达载体质粒pPKNTG转入HND5菌株中,获得了带绿色荧光且遗传稳定的转化子;PCR鉴定结果表明绿色荧光与外源质粒的插入相关。随机选取7个荧光转化子进行拮抗活性评价,发现其中5个转化子及其产生的挥发性气体对多主棒孢Corynespora cassiicola的拮抗活性与野生型菌株HND5相当。该结果为深入研究HND5菌株内生性及生防作用机理奠定了基础。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。